材料和试剂

1. 25 cm ²组织培养瓶（Greiner Bio-One，目录号： 690175）

2. 无菌过滤器吸头（ 20、200 和 1、250 μL ）（Interpath，目录号： 24500、24700、24900 ）

3. 无菌血清移液管（10、25 m L ）（Sigma，目录号： CLS4489-200EA、CLS4488-200EA）

4. 无菌 2 mL吸液管（Greiner Bio-One，目录号： 710183 ）

5. 细胞刮刀（Sarstedt，目录号： 83.3951）

6. 针头皮下注射26 G × 13 mm（Terumo，目录号： NN.2613R）

7. 10 m L Luer Lock 注射器（Terumo，目录号： SS10L）

8. Millex-SV 注射器过滤器单元 5 μM PVDF（Millipore，目录号： SLSV025LS）或 25 mm Whatman Nuclepore 3 μm 聚碳酸酯膜过滤器（Cytiva，目录号： 10418306）。 3 µm 聚碳酸酯过滤器必须组装成可重复使用的 25 mm Whatman 聚丙烯 Swin-Lok 过滤器（Cytiva，目录号： 420200）。

9. 聚丙烯离心管（15、50 m L ）（Greiner Bio-One，目录号： 188271、227261）

10. 无菌 Eppendorf 管（1.5 m L ）（Axygen，目录号： MCT-150-C）

11. 试剂容器（Sigma，目录号： R1400）

12. Seahorse XF96 FluxPak（培养板、传感器盒、校准物；Agilent，目录号： 102416-100）

13. Seahorse XF 基础培养基（Agilent，目录号： 102353-100）

14. 碳酸氢钠（Sigma，目录号： S6297-1KG）

15. Cell-Tak 粘合剂（Corning，目录号： 354241）

16. L-谷氨酰胺（Sigma，目录号： G8540-100G）

17. D-葡萄糖（BDH AnalaR，目录号： 101174Y）

18. 氢氧化钾（AJAX-Finechem Univar，目录号：AJA405-500G）

19. 羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）（Sigma，目录号：C2920-10MG）

20. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D8418-250G）

21. 洋地黄皂苷（Sigma，目录号：D141-500MG）

22. L-苹果酸（Sigma，目录号： M1000-100G）

23. sn-甘油3-磷酸双（环己基铵）盐（Sigma，目录号： G7886-1G）

24. Atovaquone（Sigma，目录号： A7986-10MG）

25. N，N，N，N'-四甲基-对苯二胺（TMPD）（Sigma，目录号： T7394-5G）

26. L-抗坏血酸（Sigma，目录号： A5960-25G）

27. 叠氮化钠（AJAX-Finechem Univar，目录号： AJA1222-100G）

28. 乙二醇-双（2-氨基-乙醚）-N，N，N，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma，目录号： E3889-25G）

29. 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Sigma，目录号： H3375-250G）

30. 磷酸二氢钾（KH ₂PO ₄）（ChemSupply，目录号： PA009-500G）

31. 六水合氯化镁（MgCl ₂· 6H ₂O）（AJAX-Finechem Univar，目录号： AJA296-500G）

32. D-甘露醇（Sigma，目录号： M9546-250G）

33. 蔗糖（Sigma，目录号： S9378-5KG）

34. 基本上不含脂肪酸的牛血清白蛋白（FAF-BSA）（Sigma，目录号： A3803-10G）

35. MilliQ H ₂O

36. 碳酸氢钠 (0.1 M)（见食谱）

37. 谷氨酰胺原液（200 mM）（见食谱）

38. 葡萄糖储备（1 M）（见食谱）

39. 含有葡萄糖 (5 mM) 和谷氨酰胺 (1 mM) (BM+Glc+Gln) 的基础培养基（参见食谱）

40. FCCP 库存（50 mM）（见食谱）

41. Atovaquone 原液（10 mM）（参见食谱）

42. 洋地黄皂苷原液（5% w/v）（参见食谱）

43. 线粒体检测溶液 (MAS) 缓冲液 (1 × , 500 mL)（参见食谱）

44. 苹果酸原液（320 mM）（见食谱）

45. 甘油 3-磷酸原液 (200 mM)（参见食谱）

46. TMPD 原液（500 mM）（参见食谱）

47. 抗坏血酸原液（200 mM）（参见食谱）

48. 叠氮化钠原液 (110 mM)（参见食谱）

设备

1. 100-1,000 μL（Eppendorf ，目录号： 3120000011、3120000038、3120000054、3120000062 ）

2. 多通道移液器 10-100 μL 和 30-300 μL（Eppendorf，目录号： 3122000035、3122000051 ）

3. Seahorse XFe96 分析仪（安捷伦）

4. 加湿、37°C、非 CO ₂培养箱

5. 加湿、37°C、5% CO ₂培养箱

6. 血细胞计数器，改进的 Neubauer 亮线细胞计数室（Thermo Fisher Scientific，81002.04）

7. 标准倒置光学显微镜 (Olympus CKX41)，配备 4 × 、10 × 、20 ×和 40 ×物镜

8. II级生物安全柜

9. 吸气器真空泵

10. 水浴，37°C

11. 4°C冰箱和-20°C冰柜

12. 酸碱度计

软件

1. Wave 软件（安捷伦）

2. Excel（微软）

3. Python（3.7 或更高版本）

4. R（版本 4.0.5 或更高版本）

5. GraphPad 棱镜 (GraphPad)

程序

有关各种程序的概述，请参见图 2。

A. 检测前一天的准备工作

1. 将 Seahorse XF 基础培养基调节至 pH 7.4。

2. 准备配方部分中列出的所有药物和试剂的储备溶液。

注意：即使储备溶液可以提前准备好，重要的是在用于测定之前再次检查所有试剂的 pH 值是否为 7.4。

3. 培养弓形虫寄生虫，使其在检测当天从宿主细胞中排出（或存在于宿主细胞内的大液泡中）。需要考虑的几点：

a. 在检测前，寄生虫不应在细胞外停留太久。这是为了确保在寄生虫最健康/最有活力时对其进行检测。

注意：虽然我们在实验中没有经常这样做，但可以在检测前一天晚上轻轻清洗受感染的宿主细胞烧瓶，以去除任何过早排出的细胞外寄生虫。

b. 我们经常使用条件性敲除寄生虫系[例如，编码感兴趣蛋白质的基因处于无水四环素 (ATc) 可调节启动子的控制之下]；在这种情况下，在检测前在 ATc 中预培养寄生虫所需的时间（例如， 0-3 天）。

c. 我们在 Seahorse XFe96 培养板的孔中接种 1.5 × 10 ⁶寄生虫/孔，并一式三份测试每个条件（因此每个条件需要 4.5 × 10 ^{6 个}寄生虫细胞）。一个含有单层人类包皮成纤维细胞的25 cm ^{2组织培养瓶可产生约 2.5-10}× 10 ^{7 个}寄生虫，因此通常足以进行实验。如果需要更多的寄生虫，接种多个 25 cm ²组织培养瓶，或接种更大的（例如，175 cm ²）组织培养瓶。

注意：每口井接种的寄生虫数量可能需要根据被测试的弓形虫菌株的代谢情况进行优化。为此，我们建议在初步实验中滴定不同数量的寄生虫。

d. 您想比较的所有寄生虫菌株都应包含在同一个板上。这是因为我们在数据分析流程中应用了线性混合效应模型（在数据分析部分讨论），该模型比较板内的条件以识别不同日期重复之间的变化，从而尽可能精确地测量处理效果.

4. 用 Cell-Tak 涂抹 96 孔 Seahorse XFe96 培养板。在生物安全柜中执行此程序以保持板无菌。

a. 750 μL无菌碳酸氢钠 (0.1 M) 与 15 μL Cell-Tak 混合在 1.5 m L Eppendorf 管中并彻底混合。这会激活 Cell-Tak 并使其聚合并粘附在塑料上。

b. 将 15 μL的这种混合物分装到 96 孔板（48 孔）的一半孔中。

c. 制备第二批 Cell-Tak 溶液，如步骤 a 所示，并分装到板的后半部分，如 b 所示。建议分两批，以确保溶液不会聚合得太快。

d. 轻轻敲击板以去除孔底的任何气泡，然后在室温 (RT) 下孵育 20-30 分钟，使 Cell-Tak 粘附在每个孔的底部。

e. 取出 Cell-Tak 溶液并用 100 μL无菌 MilliQ 水清洗每孔 3 次，以去除孔中残留的碳酸氢钠。

f. 取出最后的洗涤液，让盘子干燥。

g. 根据我们的经验，Cell-Tak 包被的 96 孔 Seahorse XFe96 培养板可以在检测前以拉链袋的形式存放在冰箱中长达一周。

5. 检测前一天晚上，根据制造商的说明为 Seahorse XFe96 传感器盒补水。

a. 当前制造商的说明是将每口井 200 μL 的无菌水添加到校准板中，并将传感器盒降低到其中（图 3）。

b. 要正确地为 96 个传感器探头中的每一个进行水合，您必须确保传感器探头下方没有气泡。

c. 要去除气泡，将传感器盒轻轻地升高和降低到校准板中的水中几次。

d. 检查是否有残留的气泡，如有必要，重复步骤 5c。

e. 然后应将板和盒在设置为 37°C 和大气 CO _{2的加湿培养箱中培养过夜}。还应将 50 mL 等分试样的 XF 校准溶液置于 37°C 培养箱中过夜以脱气。

6. 预先计算适当的药物浓度。

a. Seahorse XFe96 系统设置为在检测期间从传感器盒的端口 AD 向 Seahorse XFe96 培养板的 96 个孔中的每个孔注入25 μL体积（图 3）。

b. 在测定开始时，Seahorse XFe96 培养板中 96 个孔中每个孔的体积为 175 μL 。因此，从端口 A 注入的溶液必须以孔中所需最终浓度的 8 倍制备，以考虑体积变化（ 175 μL中的 25 μL = 1:8 稀释）。同样，从端口 B 注入的溶液必须是 9 × 、端口 C 10 ×和端口 D 11 ×所需的最终浓度，以考虑连续的体积变化。

c. 药物应在用于测定的培养基中制备[即，Seahorse XF 基础培养基或线粒体测定溶液 (MAS) 缓冲液]。每个注射口装入 25 μ L的体积，因此计算所需孔数所需的药物量（例如， 48 个孔× 25 μ L = 1.2 mL）。如果经济允许使用多通道移液器装载端口，请进行过量。

图 3. Seahorse XFe96 的部件 传感器墨盒。

（上）在侧视图中，可以看到连接到绿色传感器盒的传感器探头。探针包含固态光学传感器，在用于分析之前必须在一夜之间进行水合。 （下）在俯视图中，可以看到 96 个孔中每个孔上方的四个进样口。插图描绘了端口 AD 和中央传感器探头的位置。在测定期间，在用户定义的时间通过端口 AD 将化合物注入下方的孔中。

B. 完整寄生虫的 OCR 和 ECAR 测量

弓形虫寄生虫的 OCR 和 ECAR 的测量，这些寄生虫提供葡萄糖和谷氨酰胺作为底物（图 4A）。这是基于用于评估哺乳动物细胞中线粒体功能的典型线粒体压力测试 (MitoStress) 测定法( Divakaruni et al ., 2014 ) 。最初测量基础 OCR 和 ECAR 以确定寄生虫的基线 ETC 活性和一般代谢活性（图 4B 和 4C）。然后注入质子载体 FCCP（通过端口 A）以将电子传输与 ATP 合成分离，从而计算最大 OCR 和备用容量（图 4A 和 4B）。最后，注入 ETC 复合物 III 抑制剂 atovaquone（通过端口 B）以评估非线粒体 OCR（图 4A 和 4B）。

我们的分析在两个主要方面不同于典型的 MitoStress 分析。首先，通常在 FCCP 之前注射寡霉素，通过阻断 F ₀结构域形成的质子通道来抑制 ATP 合酶（复合物 V）（Symersky等，2012）。因此，添加寡霉素可评估质子泄漏和 ATP 相关呼吸（ Divakaruni等人，2014 年）。然而，由于寡霉素对我们手中的弓形虫寄生虫 OCR 的影响有限，因此我们不将其包括在我们的分析中。为什么寡霉素在我们的检测中效果有限尚不清楚。刚地弓形虫的 ATP 合酶复合物在蛋白质组成（ Huet等人，2018 年；Salunke等人，2018 年）和结构（ Mühleip等人，2021 年）与许多其他真核生物有很大不同，可以想象，寡霉素不能有效地与蛋白质复合物结合。或者，可以想象，细胞外弓形虫速殖子的 ETC 在很大程度上与 ATP 合酶活性无关，在这种情况下，抑制 ATP 合酶对 OCR 的影响很小[尽管我们注意到添加 FCCP 会导致寄生虫 OCR 的增加（图4D），暗示ATP合成和电子传递之间存在一些耦合。弓形虫] 。其次，ETC 复合物 I 抑制剂鱼藤酮通常与 ETC 复合物 III 抑制剂抗霉素 A 结合使用以评估非线粒体 OCR（ Divakaruni等人，2014 年）。由于弓形虫寄生虫中不存在复合物 I（ Hayward 和 van Dooren，2019 年），因此我们的分析中也不包括鱼藤酮。

在表征新型弓形虫蛋白的功能时，我们经常使用这种方法来确定缺乏目标蛋白的突变寄生虫是否存在 ETC 功能缺陷（ Seidi等人，2018；Hayward等人，2021 ） .例如，我们生成了一种寄生虫菌株，我们可以在其中通过添加 ATc 来抑制 ETC 复合物 III 蛋白Tg QCR11 的表达（ Hayward等人，2021 年）。我们观察到Tg QCR11 敲低导致基础 OCR 降低（图 4D）。我们还观察到敲除在 ETC 中选择性起作用的蛋白质 [例如。 , Tg QCR11（ Hayward等人，2021 年）或 ETC 复合物 IV 亚基Tg ApiCox25（ Seidi等人，2018 年） ]不会导致 ECAR 的伴随损害，并且在某些情况下会导致轻微但显着的增加ECAR（图 4E）。我们将观察到的 OCR 但不是 ECAR 的下降解释为选择性 ETC 缺陷的特征。相比之下，敲除对一般寄生虫存活很重要的蛋白质会导致 OCR 和 ECAR 降低，我们将此解释为 ETC 之外缺陷的特征。例如，敲除血红素生物合成酶Tg UroD，或用蛋白质合成抑制剂放线菌酮治疗，导致 OCR 和 ECAR 同时降低（ Seidi等人，2018； Tjhin 等人，2020）。因此，该测定将 ETC 功能缺陷与更广泛的寄生虫代谢缺陷或对寄生虫存活的影响区分开来。我们注意到，通过将端口 2 中的 atovaquone 替换为测试化合物，该测定还可以确定感兴趣的化合物是否抑制 ETC。

图 4. 在 MitoStress 测定中测量完整的弓形虫寄生虫的 OCR 和 ECAR。

A. 测定示意图。在 Seahorse XF 基础培养基中，为完整的刚地弓形虫寄生虫提供葡萄糖 (Glc) 和谷氨酰胺 (Gln) 作为能量/电子源。 FCCP 通过端口 A 注入以消散穿过线粒体内膜的质子梯度，从而将电子传递与 ATP 合成分离。 Atovaquone (ATV) 通过端口 B 注入以抑制 ETC 复合物 III。 B. 突出显示对 FCCP 和 ATV 注射的典型 OCR 响应的模拟轨迹，以及可以对结果数据执行的计算：即，通过平均注射 atovaquone (ATV) 后的 OCR 测量值获得非线粒体 OCR（粉红色））。然后可以在注射 FCCP 之前从测量值中减去非线粒体 OCR，以计算基础线粒体 OCR（基础 mOCR，绿色）。非线粒体 OCR 也可以从 FCCP 注射后的测量值中减去，以计算最大 mOCR（橙色）。最后，备用容量是最大和基本 mOCR（紫色）之间的差异。 C. 注射 FCCP 前的 ECAR 测量值代表基础 ECAR。 D. 真实痕迹描绘了在检测前 1-3 天在没有 ATc 或存在 ATc 的情况下培养的 WT（蓝色）和 r Tg QCR11（橙色）寄生虫的 OCR。数据代表三个技术重复的平均值 ± SD，代表三个独立实验（源自Hayward等人，2021 年）。 E. 基础 mOCR 与 WT（蓝色）和 r Tg QCR11（橙色）寄生虫的基础 ECAR，如 (D) 中所述培养。数据代表来自单个实验的三个技术复制的平均值 ± SD。数据从 Wave 软件导出到 GraphPad Prism 以生成图形。颜色与 (D) 中的图例相匹配。

在 Wave 软件中为完整的 MitoStress 分析准备Seahorse XFe96分析模板：

1. 从安捷伦网站下载 Wave 软件。

2. 在“组定义”选项卡下（图 5A），填写注入策略如下：

a. 端口 A：FCCP。

b. 港口 B：阿托瓦昆。

c. 端口 C：含葡萄糖和谷氨酰胺的基础培养基 (BM+Glc+Gln)。

d. 端口 D：BM+Glc+Gln。

3. 在“组定义”选项卡下（图 5A），添加“组”，使用下面概述的约定命名它们（必须严格遵循用于分析数据的 Python 和 R 脚本才能工作）：

a. X 天（其中 x 是寄生虫在 ATc 上生长的天数）。

b. 正在使用的寄生虫线的名称（例如， WT、r Tg QCR11）。

c. 完整（表明该测定是在完整的寄生虫上进行的，而不是在通透的寄生虫上进行，如程序部分 C 中描述的实验中所发生的那样）。

4. 在 "板图" 选项卡 (图 5B) 下, 配置板图, 确保包括适当的背景井 (没有单元格的井, 空白), 每个板至少四个。

注意：在实验井中包括和减去背景井对于解释任何背景（与寄生虫无关）OCR 和 ECAR 很重要。

5. 在“协议”选项卡（图 5C）下，通过在基线读数后添加注入来指定要注入的端口。

6. 在 "协议" 选项卡 (图 5C) 下, 指定混合和测量周期的时间和数量:

a. 3 个测量周期（在提供的测试数据集中，我们做了 5 个周期）。

b. 30 秒混合。

c. 0 秒等待。

d. 3 分钟测量。

7. 保存此模板。在 Seahorse XFe96 机器上打开时，打开顶部的“运行检测”选项卡以开始检测。

图 5. 在 Wave 软件中为完整的 MitoStress 分析设计 Seahorse XFe96实验模板。

A. 在“组定义”选项卡下，填写注入策略如下：端口 A：FCCP； B港：阿托瓦昆；端口 C：含葡萄糖和谷氨酰胺的基础培养基（BM+Glc+Gln）；端口 D：BM+Glc+Gln。添加“组”，并确保使用约定 x 天（其中 x 是寄生虫在 ATc 上生长的天数）、正在使用的寄生虫线的名称（例如.、WT、r Tg QCR11）命名它们，以及完整的（表示检测是在完整的寄生虫上进行的，而不是在程序部分 C 中描述的透化寄生虫上）。 B. 在“板图”选项卡下，配置板图，确保包括适当的背景孔（无细胞孔、空白孔）。 C. 在“协议”选项卡下，通过在基线读数后添加注射来指定要注射的端口。指定混合和测量周期的时间和数量如下：3 个周期（在测试数据集中，我们提供了 5 个周期）； 30 秒混合； 0 秒等待； 3 分钟测量。保存模板。在 Seahorse XFe96机器上打开时，打开顶部的“运行检测”选项卡以开始检测。

完整 MitoStress 测定的实验程序：

1. 准备 Seahorse XF 基础培养基，辅以葡萄糖 (5 mM) 和谷氨酰胺 (1 mM)（BM+Glc+Gln – 参见食谱部分）。检查 pH 值，如有必要，调整到 7.4。在水浴中加热至 37°C。

2. 在 BM+Glc+Gln 中准备以下内容（每种 5 mL 足以容纳整个 96 孔板过量）：

a. FCCP（为 1 μM 最终浓度准备 8 μM）。将 0.8 μL 的 FCCP 库存（50 mM）添加到 5 mL 的 BM+Glc+Gln。

b. Atovaquone（为 1 μM 终浓度准备 9 μM）。在 5 mL 的 BM+Glc+Gln 中加入 4.5 μL 的 atovaquone 库存（10 mM）。

注意：在之前的研究中，我们还加入了第二种复合物 III 抑制剂 Antimycin A（制备 90 μM 最终 10 μM）与 atovaquone 组合（ Hayward 等人，2021 年）；然而，这是不必要的，因为 atovaquone 对 OCR 产生了足够的抑制作用，可以计算非线粒体 OCR。虽然我们怀疑抗霉素 A 在单独使用时也会对 OCR 产生足够的抑制作用，但我们建议在试点实验中进行测试。

注意：上述浓度是通过滴定每种化合物并选择给出最佳响应的最低浓度来确定的。根据实验中使用的弓形虫寄生虫的菌株，可能需要进行额外的优化。

3. 检查寄生虫感染的宿主细胞瓶。理想情况下，寄生虫应该最近从宿主细胞中排出或在检测当天仍留在细胞内，以确保最佳的寄生虫活力。为了安全和无菌，在 II 类生物安全柜中执行涉及寄生虫的步骤。

a. 如果寄生虫大部分仍在细胞内，则首先使用细胞刮刀从烧瓶底部去除宿主细胞，然后通过 26 号针将受感染的宿主细胞传代以机械地排出寄生虫，从而从宿主细胞中释放寄生虫。

b. 如果细胞外，跳过刮和针通过步骤。

4. 将含有寄生虫的培养基通过 5 μm 聚偏二氟乙烯 (PVDF) 过滤器传递到 15 mL 管中，以去除宿主细胞碎片（请注意，也可以使用 3 μm 聚碳酸酯过滤器）。

注意：这一步对于确保完整的宿主细胞（包含活性线粒体）不会影响 OCR 测量非常重要。

5. 使用血细胞计数器计数寄生虫。计算提供 1.5 × 10 ⁷寄生虫/mL所需的寄生虫总数和基础培养基的体积。

注意：准确的寄生虫计数至关重要，以确保每种条件和重复之间使用相似数量的寄生虫，因此我们建议一个人对特定检测的所有样本进行计数，以确保内部一致性。

6. 以 1,500 ×离心沉淀寄生虫 g在室温下 10 分钟。

7. 吸出介质。

8. 在 ~ 1-2 mL 的 BM+Glc+Gln 中清洗寄生虫颗粒。该洗涤步骤对于确保将干扰 ECAR 测量的NaHCO _{3缓冲培养基从样品中充分去除非常重要。}

9. 将寄生虫溶液保存在 15 mL 试管和上述离心机中，或转移到无菌 1.5/2 mL 试管和 12,000 ×离心机中 g在室温下 1 分钟。无论您使用 15 mL 还是 1.5/2 mL 试管，都将取决于需要重新悬浮颗粒以达到 1.5 × 10 ⁷寄生虫/ mL 浓度的基础培养基的体积。

10. 从管中吸出介质。

11. 在 BM+Glc+Gln中将寄生虫颗粒重新悬浮到 1.5 × 10 ^{7寄生虫/mL。}

12. 将 100 μL 的寄生虫悬浮液（包含 1.5 × 10 ⁶寄生虫）添加到 Cell-Tak 涂层 Seahorse XFe96 培养板的指定井中。

13. 用 100 μL 的 BM+Glc+Gln 填充空白井（不含寄生虫）。

14. 800 ×离心板 g在室温下在低制动离心机设置下持续 3 分钟。

注意：我们建议使用低制动设置，以便在每个孔的底部形成均匀的单层寄生虫。

15. 在最低放大倍率设置下使用标准倒置光学显微镜检查孔，以确保在孔底部形成均匀的单层寄生虫。

注意：这也是目视检查每种情况下是否存在相似数量的寄生虫的好机会。

16. 用 75 μL 的 BM+Glc+Gln 将每口井加满，总体积为 175 μL。

17. 从校准板上取下绿色传感器盒，并将其放在 II 级生物安全柜中，将其放在一边，使传感器探头朝上。用 200 μL 的 XF 校准溶液替换校准板孔中的水。将传感器盒放回校准板中，确保传感器探头下方没有气泡。

18. 将含有寄生虫的 Seahorse XFe96 培养板、校准板中的传感器盒和步骤 2 中制备的试剂带到 Seahorse XFe96 机器上。还要带上一个多道移液器，它可以分配 25 μL 溶液、吸头和试剂容器。

19. 在设置 Seahorse XFe96 软件和加载墨盒端口时，在 37 °C的加湿 CO _{2培养箱中孵育含有寄生虫的 Seahorse XFe96 培养板。}

20. 打开之前使用 Wave 软件准备的检测模板。

21. 使用多通道移液器，按照下面概述的注入策略，将 25 μL 的溶液加载到传感器盒的适当端口中。

a. 端口 A：FCCP。

b. 港口 B：阿托瓦昆。

c. 端口 C：BM+Glc+Gln。

d. 端口 D：BM+Glc+Gln。

笔记：

1. 需要注意确保将溶液正确加载到端口中，并且在加载端口后不得粗暴地撞击或敲击墨盒。根据我们的经验，最佳做法是：

a. 使用反向移液来防止气泡。

b. 将移液器吸头直接插入端口底部，稍微抬起吸头使其不再接触底部，倾斜吸头使其接触端口侧面，然后轻轻地将溶液释放到端口中。正确加载后，解决方案应在每个端口中可见。

2. 常见的加载错误包括：

a. 将移液器吸头放在端口的底部并用力释放溶液，导致通过端口注入底板。如果犯了这个错误，端口将看起来是空的。

b. 将吸头放置在离端口顶部太近的位置，从而在端口底部和溶液之间形成气泡。如果犯了这个错误，端口会显得过满。这可能会导致检测过程中的注射失败。

22. 加载传感器盒的端口后，单击 Wave 软件中的“运行检测”。这将打开 Seahorse XFe96 机器侧面的托盘。

23. 确保已取下盖子，将装入校准板中的传感器盒轻轻放在 Seahorse XFe96 机器的托盘上，然后单击提示关闭托盘。

注意：必须取下盖子以防止损坏机器。

24. Seahorse XFe96 机器随后会进行大约 30 分钟的校准/验证过程，以确保传感器探头正常工作。

注意：如果传感器盒未能通过这些校准/验证步骤，我们建议重新启动 Seahorse XFe96 机器并再次尝试。如果第二次失败，则传感器盒可能有故障，我们不建议在出版物中包含在后续测定中获得的数据。

25. 出现提示时，从托盘中取出校准板（传感器盒保留在 Seahorse XFe96 机器内）。

26. 小心地将 Seahorse XFe96 培养板（含有寄生虫）从 37°C 培养箱中取出，取下盖子，将其放在托盘上，然后单击提示关闭托盘。

27. 测定从此时开始，根据选择的混合和测量循环次数，运行时间为 1-2 小时。

28. 结果数据的分析在数据分析部分 A 中描述。

C. 透化寄生虫中底物诱发 OCR 的测量

上一节中描述的 Seahorse XFe96 测量测量了以葡萄糖和/或谷氨酰胺作为碳源的完整细胞外寄生虫中的 OCR 和 ECAR。这些实验依赖于寄生虫对这些底物的吸收和活跃代谢。 Seahorse XFe96 检测也可适用于测量由 ETC 的直接底物引发的 OCR。这涉及用低浓度的洋地黄皂苷渗透寄生虫质膜，以使原本不会进入完整寄生虫的底物到达线粒体。然后将寄生虫与选定的底物一起孵育，这些底物可以被将电子馈入 ETC 的各种脱氢酶直接氧化（图 1）。这种方法提供了完整细胞难以获得的信息，并且具有不需要从寄生虫中纯化线粒体细胞器以直接测定线粒体活性的额外好处。利用这些方法，我们能够更深入地研究刚地弓形虫中的 ETC 功能。例如，这些方法使我们能够确定在敲除编码在 ETC 中起作用的蛋白质的基因时受损的 ETC 的特定步骤（ Hayward等人，2021 ），或阐明 ETC 抑制剂的分子靶点。本节介绍了一种通过测量已提供 ETC 特定基质的透化弓形虫寄生虫的 OCR 来评估不同 ETC 复合物功能的方法（图 6A 和 6B）。

在该测定中，弓形虫寄生虫被饥饿以消耗内源性能源，然后寄生虫的质膜被毛地黄皂苷渗透。接下来，通过注入口 A 注入底物以刺激 O ₂消耗，并与 FCCP 一起确保 OCR 以最大容量发生。我们在这些实验中使用了两种不同的底物，它们都独立地将电子提供给 CoQ： i ）苹果酸，它通过 TCA 循环酶苹果酸：醌氧化还原酶将电子提供给 ETC； ii ) 3-磷酸甘油 (G3P) ， = 2 \* roman 它通过线粒体 G3P 脱氢酶将电子输入 ETC，与 TCA 循环无关（图 6A； Hayward等人，2021 年）。如果由两种底物引发的 OCR 在寄生虫突变体中受到损害，则证明缺陷发生在辅酶 Q 的下游（即，在 ETC 复合物 III 或 IV 上）。例如，ETC 复合物 III 亚基Tg QCR11 的敲低导致苹果酸依赖性（图 6C）和 G3P 依赖性（图 6D）OCR 的降低（ Hayward等人，2021 年）。如果仅由一种底物引发的 OCR 在寄生虫突变体中受到损害，那么对 ETC 的影响可能是该脱氢酶特有的。

测定的下一步涉及通过端口 B 注射复合物 III 抑制剂 atovaquone (ATV)。这将抑制复合物 III 处的 ETC，并能够确定非线粒体 OCR。接下来，为了区分复合物 III 和复合物 IV 中的缺陷，还原了 N、N、N、N'-四甲基-对苯二胺 (TMPD)，这是一种直接向 CytC 提供电子的底物（从而绕过复合物 III；图 6A )，通过端口 C 注入。如果 OCR 可以通过添加 TMPD 来挽救，这提供了证据表明缺陷发生在 CytC 上游（例如，在 ETC 复合体 III），而如果 OCR无法挽救，这表明存在缺陷。 CytC 下游的缺陷（即，在复合体 IV）。作为对这种方法的验证，我们证明 OCR 可以通过在缺乏 ETC 复合物 III 亚基Tg QCR11 但不缺乏复合物 IV 亚基Tg ApiCox25 的突变寄生虫中添加减少的 TMPD 来拯救（图 6C； Hayward等人，2021 年）。最后，复合 IV 抑制剂叠氮化钠 (NaN ₃) 通过端口 D 注入，以验证 TMPD 依赖的 OCR 是由复合 IV 上游的 ETC 介导的 (图 6B-D)。

我们注意到，可以轻松修改此测定以通过端口 A 提供不同的底物。应进行新底物的滴定以确定产生最大 OCR 响应的最低浓度。此测定法还可用于通过用 B 端口中的目标化合物取代 atovaquone 来确定 ETC 抑制化合物的靶标。在这种情况下，我们建议从高浓度的测试化合物开始以产生最大的抑制作用，然后滴定候选抑制剂的浓度以确定其靶向 ETC 的效力。

图 6. 透化寄生虫中底物诱发 OCR 的测量（ Hayward等人，2021 年）。

A. 测定示意图。弓形虫寄生虫在基础培养基中饥饿 1 小时以消耗内源性能源，然后用 0.002% (w/v) 洋地黄皂苷渗透，然后进行以下底物或抑制剂注射：端口 A、FCCP 加底物苹果酸（ Mal) 或甘油 3-磷酸 (G3P)； Port B，ETC 复合物 III 抑制剂 atovaquone (ATV)；端口 C，细胞色素c (CytC) 底物 TMPD (TMPD)；端口 D，ETC 复合物 IV 抑制剂叠氮化钠 (NaN ₃)。 B. 突出显示 WT 寄生虫的典型 OCR 响应的模拟轨迹，以及可以对结果数据执行的计算：即，非线粒体 OCR（粉红色）是通过在注射 atovaquone (ATV) 后平均 OCR 测量值获得端口 B。然后可以从通过端口 A 注射 Mal 或 G3P 后的测量值中减去非线粒体 OCR，以计算底物引发的线粒体 OCR（mOCR^底物，绿色）。也可以从通过端口 C 注射 TMPD 后的测量值中减去非线粒体 OCR，以计算 TMPD 引发的 mOCR（mOCR ^TMPD，橙色）。最后，作为衡量 TMPD 相对于底物如何有效刺激 OCR 的量度，还可以计算mOCR ^TMPD/mOCR^{底物的比率。}C. 描绘 WT（蓝色）、r Tg QCR11（橙色）和 r Tg ApiCox25 寄生虫（绿色）的 OCR 的真实痕迹，这些寄生虫在不存在 ATc 的情况下培养 3 天，或在存在 ATc 的情况下培养 1-3测定前几天，并通过端口 A 提供 Mal 作为底物。数据代表三个技术复制的平均值 ± SD，代表三个独立实验。 D. 描绘 WT（蓝色）和 r Tg QCR11（橙色）的 OCR 的真实迹线，如 (C) 中所述培养，但通过端口 A 提供 G3P 作为底物。数据代表三个技术复制的平均值 ± SD并且代表三个独立的实验。数据从 Wave 软件导出到 GraphPad Prism 以生成图形。海沃德等人先前描述了数据。（2021 年）。

Seahorse XFe96 检测模板准备用于 Wave 软件中的透化检测：

1. 在“组定义”选项卡下（图 5A），填写注入策略如下：

a. 端口 A：FCCP + 苹果酸盐或 FCCP + 3-磷酸甘油。

b. 港口 B：阿托瓦昆。

c. 端口 C：TMPD + 抗坏血酸。

d. 端口 D：叠氮化钠。

2. 在“组定义”选项卡下（图 5A），添加“组”，使用下面概述的约定命名它们（必须严格遵循用于分析数据的 Python 和 R 脚本才能工作）：

a. X 天（其中 x 是寄生虫在 ATc 上生长的天数）。

b. 正在使用的寄生虫线的名称（例如， WT、r Tg QCR11）。

c. 烫发（表示检测是在透化的寄生虫上进行的，而不是在程序 B 部分中发生的完整寄生虫上）。

3. 在 "板图" 选项卡 (图 5B) 下, 配置板图, 确保包括适当的背景井 (没有单元格的井, 空白)。

4. 在“协议”选项卡（图 5C）下，通过在基线读数后添加注入来指定要注入的端口。

5. 在 "协议" 选项卡 (图 5C) 下, 指定混合和测量周期的时间和数量:

a. 3 个测量周期（在提供的测试数据集中，我们做了 5 个周期）。

b. 30 秒混合。

c. 0 秒等待。

d. 3 分钟测量。

6. 保存此模板。在 Seahorse XFe96 机器上打开时，打开顶部的“运行检测”选项卡以开始检测。

透化寄生虫测定的实验程序：

1. 在水浴中将未添加的 Seahorse XF 基础培养基 (BM) 加热至 37°C。

2. 在线粒体测定溶液 (MAS) 缓冲液中制备 0.002% (w/v) 数字素：将 8 μL 数字素库存 (5% w/v) 添加到 20 mL 的 MAS 缓冲液中。这对于过量的整个盘子来说已经足够了。

注意：使用前，可能需要将 5% w/v 洋地黄皂苷原液加热至约 90°C 约 5 分钟，以完全溶解洋地黄皂苷。

笔记：

a. 0.002% (w/v) 的洋地黄皂苷浓度通过滴定洋地黄皂苷并确定消散 ECAR（表明质膜已被透化）但保留对苹果酸和 TMPD 等底物的 OCR 响应的最低浓度进行优化。优化洋地黄皂苷的浓度至关重要，因为过低的浓度可能无法渗透质膜并限制化合物进入，而过高的浓度会破坏线粒体膜。

b. MAS 缓冲液是一种高 [K ⁺]、低 [Na ⁺] 缓冲液，旨在模拟细胞内离子浓度。在透化寄生虫的这些化验中使用 MAS 缓冲液而不是 BM 至关重要。

3. 在 MAS 缓冲液中制备底物/药物； 5 毫升足以覆盖过量的盘子：

a. 8 × FCCP（8 μM 用于 1 μM 最终溶液），连同 8 ×底物苹果酸盐（为 10 mM 最终溶液制备 80 mM）或 3-磷酸甘油（为 25 mM 最终溶液制备 200 mM）。

注：在之前的研究中，我们使用了苹果酸和谷氨酸的组合（ Hayward et al., 2021 ）；然而，随后的测试表明，苹果酸有助于 OCR，因为单独的谷氨酸在这些测定中不会产生 OCR 反应。

i. 苹果酸 (5 mL)：将 1.25 mL 的苹果酸库存 (320 mM) 和 0.8 μL 的 FCCP 库存 (50 mM) 添加到 3.75 mL 的 MAS 缓冲液中。

ii. 甘油 3-磷酸 (5 mL)：将 0.8 μL 的 FCCP 库存 (50 mM) 添加到 5 mL 的甘油 3-磷酸库存 (200 mM) 中。

注意：由于 G3P 是一种更昂贵的底物，因此可以按每孔制备（每孔 25 μL）而不是制备 5 mL。

b. 9 × Atovaquone（为 1 μM 最终制备 9 μM）。将 4.5 μL 的 atovaquone 库存（10 mM）添加到 5 mL 的 MAS 缓冲液中。

注意：在之前的研究中，我们还加入了第二种复合物 III 抑制剂 Antimycin A（制备 90 μM 最终 10 μM）与 atovaquone 组合（ Hayward 等人，2021 年）；然而，这是不必要的，因为 atovaquone 对 OCR 产生了足够的抑制作用。

c. 10 × TMPD（为 0.2 mM 最终溶液准备 2 mM）和抗坏血酸（为 3.3 mM 最终溶液准备 33 mM）。在 4.155 mL MAS 缓冲液中加入 835 μL 的抗坏血酸库存（200 mM）并混合。然后，加入 20 μL 的 TMPD 库存（500 mM）并再次混合。溶液应为浅棕色。

注意：重要的是先将抗坏血酸添加到 MAS 缓冲液中，然后再添加 TMPD。抗坏血酸的目的是使 TMPD 保持在还原状态。如果溶液呈绿色/蓝色而不是浅棕色，则 TMPD 处于氧化状态。在这种情况下，我们建议重新制作抗坏血酸盐溶液，以确保在检测前降低 TMPD。

d. 叠氮化钠（NaN ₃，为 10 mM 最终制备 110 mM）。叠氮化钠原液 (110 mM) 可提前制备，并可按原样使用。

注意：上述底物和抑制剂的浓度是通过滴定每种化合物并选择产生最佳响应的最低浓度来确定的。根据弓形虫寄生虫的菌株，可能需要额外的优化。

4. 检查寄生虫感染的宿主细胞瓶。理想情况下，寄生虫应在检测当天从宿主细胞中新鲜排出或存在于宿主细胞内的大细胞内液泡中，以确保最佳的寄生虫活力。

a. 如果大部分寄生虫是细胞内的，则通过使用细胞刮刀从烧瓶中刮下受感染的宿主细胞并将受感染的宿主细胞通过 26 号针头，从宿主细胞中机械地排出寄生虫。

b. 如果寄生虫是细胞外的，请跳过刮擦和穿针步骤。

5. 通过将排出的寄生虫培养物通过 3 μm 聚碳酸酯或 5 μm PVDF 过滤器进入 15 mL 管，去除宿主细胞碎片。这一步很重要，因为污染宿主细胞会导致 OCR。

6. 使用血细胞计数器计数寄生虫。计算寄生虫总数。获得准确的寄生虫计数以确保在每种情况下使用相似数量的寄生虫至关重要，因此我们建议一个人对特定检测的所有样本进行计数，以确保内部一致性。

7. 将含有寄生虫的 15 mL 管在 RT 处以 1，500 × g离心10 分钟以沉淀寄生虫。

8. 从管中吸出培养基。

9. 在 ~ 1-2 毫升的非补充 BM 中清洗寄生虫颗粒。

10. 将寄生虫溶液保存在 15 mL 试管和上述离心机中，或转移到无菌 1.5/2 mL 试管和 12,000 ×离心机中 g在室温下 1 分钟。

11. 从管中吸出介质。

12. 在未补充的 BM 中轻轻地将颗粒重新悬浮到每毫升 1.5 × 10 ^{7 个寄生虫。}

13. 将寄生虫在 37°C 培养箱中孵育 1 小时，以使它们缺乏内源性底物。注意：优化每个寄生虫菌株的饥饿时间很重要。在我们手中，过度饥饿的寄生虫会导致明显的活力丧失，最终导致 OCR 读数低于预期。饥饿不足的寄生虫可能导致初步 OCR 读数高于预期，这可能会使后续数据分析复杂化。我们的初步实验表明，可能需要不同长度的时间来最佳地饿死不同的寄生虫菌株。

14. 将 100 μL 的寄生虫悬浮液（包含 1.5 × 10 ⁶寄生虫）添加到 Cell-Tak 涂层 Seahorse XFe96 培养板的指定井中。

15. 用 100 μL 的 BM 填充空白井（不含寄生虫）。

16. 在低速制动器上以 800 ×离心板 g在室温下 3 分钟。

17. 使用显微镜检查井底是否形成了寄生虫单层。这也是一个很好的机会，可以直观地检查每种情况下是否存在相似数量的寄生虫。

18. 从校准板上取下传感器盒并将其放在一边，使传感器探头朝上。用 200 μL 的 XF 校准溶液替换校准板孔中的水。将传感器盒放回校准板中，确保传感器探头下方没有气泡。

19. 将含有寄生虫的 Seahorse XFe96 培养板、校准板中的传感器盒、步骤 2 中制备的 MAS 缓冲液中的洋地黄皂苷和步骤 3 中制备的试剂放入 Seahorse Xfe96 机器。还请携带可分配 25 μL 和 200 μL 体积、吸头和试剂容器的多通道移液器。

20. 将含有寄生虫的 Seahorse XFe96 培养板在 37°C 下在大气 CO _{2的加湿培养箱中孵育}。

21. 打开之前使用 Wave 软件准备的检测模板。

22. 按照下面概述的注射策略，将 25 μL 的药物溶液装入传感器盒的适当端口。

a. 端口 A：FCCP + 苹果酸盐或 FCCP + 3-磷酸甘油。

b. 港口 B：阿托瓦昆。

c. 端口 C：TMPD + 抗坏血酸。

d. 端口 D：叠氮化钠。

注意：需要注意确保将溶液正确加载到端口中。请参阅程序部分 B 注释中提供的提示。

23. 加载后，单击 Wave 软件中的“Run Assay”。

24. 出现提示并确保已取下盖子时，将装入的传感器盒放入校准板中，放入 Seahorse XFe96 机器。

25. Seahorse XFe96 机器随后会进行大约 30 分钟的校准/验证过程，以确保传感器探头正常工作。

26. 在校准/验证过程即将结束时，从 37°C 培养箱中取出含有寄生虫的 Seahorse XFe96 培养板。

27. 使用 P200 多通道移液器，轻轻地从井中取出 BM。注意：在此步骤中需要注意不要干扰寄生虫单层。

28. 使用 P200 多通道移液器在 MAS 缓冲液中小心地将 175 μL 的 0.002% (w/v) 数字素添加到每个孔中。该溶液可渗透寄生虫的质膜。

笔记：

a. 我们建议将移液器尖端倾斜靠在井壁上并缓慢释放溶液，以便在此步骤中不会干扰寄生虫单层。

b. 为获得最佳结果，我们建议在检测开始之前限制寄生虫透化的时间，并在检测的独立复制之间保持该时间一致。我们发现，自渗透以来，对底物的反应随着时间的增加而降低。

29. 出现提示时，从机器中取出校准板并更换为含有透化寄生虫的培养板，确保盖子已被移除。

30. 测定从此时开始，根据选择的混合和测量循环次数，运行时间为 1-2 小时。

31. 结果数据的分析在数据分析部分 B 中描述。

数据分析

A. 完整的 MitoStress 测定的数据分析

对程序 B 部分中描述的完整寄生虫进行的测定基于典型的 MitoStress 测定：首先测量基础 OCR，然后注入 FCCP（端口 A）以评估最大 OCR 和备用容量，然后最后注入 atovaquone（端口 B）评估非线粒体 OCR（图 4A 和 4B）。 Seahorse XFe96 检测的输出是随时间推移对每种测试条件的 OCR 或 ECAR 痕迹，提供了寄生虫如何响应各种化合物注射的信息直观表示（图 4C）。描述该实验数据的另一种方法是计算基础线粒体 OCR (mOCR)、最大 mOCR、mOCR 中的备用容量和基础 ECAR 从原始数据 (图 4B), 并将这些数据呈现为柱形图。这种表示可以更清晰地在寄生虫菌株和条件之间进行统计比较。这些计算的第一步是平均注射 atovaquone 后获得的值，以获得非线粒体 OCR（图 4B）。然后可以从每个基础 OCR 点和注射 FCCP 后的每个点中减去非线粒体 OCR，以分别产生基础和最大 mOCR（图 4B）。备用容量是最大和基础 mOCR 之间的差异（图 4B）。基础 ECAR 是注射 FCCP 之前的 ECAR 测量值。

虽然这些计算非常简单并且可以在 Excel 中手动完成，但我们提供了一个 Python 脚本“pre_R_script.py”，它可以清理原始 Excel 数据文件，执行这些计算并输出四个包含基本 mOCR、最大 mOCR、备用容量 mOCR 和基础 ECAR。然后，Python 脚本使用这些 csv 文件作为输入，以便使用 R 脚本“treat_seahorse_data.r”在 R 软件环境中进行后续分析。首先，我们使用线性混合效应模型来分析数据。在线性混合效应模型中，板（实验变异之间）和孔（实验内，测量变异之间）被设置为随机效应，细胞系和药物（例如，ATc）天数被设置为固定效应。这样做时，线性混合效应模型会比较板内的条件，以提高处理效应估计的精度（有关数据统计分析的进一步考虑，请参见数据分析部分 C）。线性混合效应模型的估计边际均值（以前称为最小二乘均值； Hayward等人，2021 年）的分析也在 R 中进行，并使用使用 Tukey 方法调整的p值评估统计差异。 Python 脚本将这些分析的结果输出到另外四个 csv 输出文件中，然后可以使用这些分析的数据在 GraphPad Prism 中创建图形。我们为( Hayward et al ., 2021 )中描述的 r Tg QCR11 完整 MitoStress 实验提供了三个测试数据文件（rep1_intact、rep2_intact 和 rep3_intact）。这些可以从 Bitbucket 存储库 ( https://bitbucket.org/ngMiaNG/seahorse-scripts/src/master/ ) 中的“test_data”子文件夹下载。

1. 分析完成后，保存 Wave 结果文件，并在您将执行后续分析的计算机上访问该文件（例如，保存到 USB 闪存驱动器或通过电子邮件将其发送给您自己）。

1. 使用 Wave 程序打开文件。

2. 单击“添加 - 概述”以同时查看板图和结果。

3. 确保已勾选“背景校正”框 - 这会从实验孔中减去空白孔的耗氧率。

注意：如果背景孔内的 OCR 高于样品孔内的 OCR，则会产生负值。这在我们的实验中有时确实会发生，尤其是在敲除 ETC 蛋白时。我们当前的分析策略将这些负值包含在分析中；有关这一点的进一步讨论，请参见数据分析部分 C。

4. 有时，化合物不能从一个或多个端口正确注入，或者在分析中的错误时间注入，从而导致数据中的错误值。检查每个数据井中是否存在任何大的异常值。如果您有充分的理由相信发生了不正确的进样，则应取消选择这些孔，将其从后续分析中排除。您还可以在化验后检查传感器盒的端口，以识别端口内容物未能注入的孔。

5. 单击“导出”按钮以 Microsoft Excel 格式导出结果。

6. 相关数据位于“比率”选项卡中。数据由“测量”、“井”、“组”、“时间”、“OCR”、“ECAR”和“PER”列组成，行表示 96 孔板中每个孔的数据实验的时间点。

7. 为了了解数据的可变性，重要的是在不同的日子使用相同的实验条件和不同的寄生虫制剂进行多个独立实验（即生物复制）。我们通常进行三个独立的实验。

8. 独立重复测定 3 次后，将每个 Excel 结果文件（名称为 rep1_intact、rep2_intact 和 rep3_intact）保存到仅包含这些文件的文件夹中。

这就是创建 r Tg QCR11 完整 MitoStress 测试数据文件（rep1_intact、rep2_intact 和 rep3_intact）的方式。请注意，在每个板上测试了其他条件，但已删除了无关孔的名称。

9. 转到https://bitbucket.org/ngMiaNG/seahorse-scripts/src/master/ ，下载存储库中的文件并保存到文件夹中。这包含“pre_R_script.py”Python 脚本、“treat_seahorse_data.r”R 脚本、“README”和“requirements”文本文件以及从 r Tg QCR11 Seahorse XFe96 实验获得的测试数据。

10. 阅读“自述文件”以了解要求以及脚本的工作方式。

11. 例如， CMD）从命令行运行“pre_R_script.py”Python 脚本。

a. 该脚本具有内置帮助，可以通过在命令行中键入：python3 “pre_R_script.py” -h 来访问。

b. 运行脚本的命令的一般结构如下： python3 “pre_R_script.py” -i “输入目录路径” -o “输出目录路径” -n “测量周期数，3 或 5” --完好无损的。注：测试数据由 5 个测量周期组成。

c. 当指定 --intact 时，“pre_R_script.py”Python 脚本使用 Excel 结果文件（rep1_intact、rep2_intact 和 rep3_intact）作为输入来执行基础 mOCR、最大 mOCR、备用容量 mOCR 和基础 ECAR 的计算。

d. 执行这些计算后，“pre_R_script.py”Python 脚本调用“treat_seahorse_data.r”R 脚本以将线性混合效应模型拟合到数据并执行统计分析（ANOVA 和事后 Tukey 检验）。

12. 包含 R 分析结果的 CSV 文件将写入指定为输出目录的文件夹。这将包括来自拟合线性混合效应模型的估计边际均值、标准误差、自由度和 95% 置信区间，以及调整后的p值 (Tukey)。

13. 这些结果可用于在 GraphPad Prism 中绘制图形。我们通常将数据呈现为基础 mOCR 和基础 ECAR 的柱形图，以及基础 mOCR 与基础 ECAR 的图表（图 7）。还计算了最大 mOCR 和备用容量，如果它们显示出值得注意的东西，可以绘制出来（ Seidi等人，2018 年）。

弓形虫寄生虫的基础 mOCR 和基础 ECAR 分析示例（ Hayward等人，2021 年）。

AB。柱形图描绘了在不存在 ATc 或存在 ATc 1-3 天的情况下，WT（蓝色）和 r Tg QCR11（橙色）弓形虫寄生虫的 ( A)基础 mOCR 和 ( B)基础 ECAR。将线性混合效应模型拟合到数据中，并且值描述了三个独立实验的估计边际平均值 ± 95% CI。进行了 Tukey 的多重成对比较测试，显示了调整后的p值。 (C)基础 mOCR 与 WT (蓝色) 和 r Tg QCR11 (橙色) T. gondii寄生虫的基础 ECAR 如上所述生长。数据描述了拟合线性混合效应模型的三个独立实验的估计边际平均 mOCR 和 ECAR 值 ± 95% CI。数据来自海沃德等人。（2021 年）。

B. 底物诱发OCR的数据分析与计算

在程序部分 C 中描述的对透化寄生虫进行的测定中，如果寄生虫已被有效地饿死，则第一个 OCR 读数应接近于零。如果不是，则可能需要增加 Seahorse 基础培养基中的饥饿时间或洗涤次数。首先，注入底物（苹果酸或甘油 3-磷酸加 FCCP）（端口 A）以产生底物引发的 OCR，然后注入 atovaquone（端口 B）以评估非线粒体 OCR（图 6A 和 6B）。注入 TMPD（端口 C）以产生 TMPD 引发的 OCR，并注入复合物 IV 抑制剂 NaN ₃（端口 D）作为验证 TMPD 依赖性 OCR 由复合物 IV 上游的 ETC 介导（图 6A 和 6B） .

Seahorse XFe96 检测的输出是随时间推移对每种测试条件的 OCR 痕迹，显示寄生虫对各种注射的反应（图 6B-6D）。描述该实验数据的另一种方法是对数据执行计算（图 6B）并将这些数据显示为柱形图（图 8）。这些计算的第一步是平均注射 atovaquone 后获得的值，以获得非线粒体 OCR（图 6B）。然后可以从注射苹果酸/甘油 3-磷酸后的每个点和注射 TMPD 后的每个点中减去非线粒体 OCR，以产生底物引发的线粒体 OCR（mOCR^底物）和 TMPD-分别引发线粒体 OCR (mOCR ^TMPD) (图 6B;图 8A-B)。然后可以取这两个值的比率来说明 TMPD 能够挽救 OCR 缺陷的程度（mOCR ^TMPD/底物）（图 8C）。

虽然这些计算非常简单并且可以在 Excel 中手动完成，但我们提供了一个 Python 脚本“pre_R_script.py”来执行这些计算并输出三个包含 mOCR ^Substrate、mOCR ^TMPD和 mOCR ^{TMPD/Substrate的 csv 文件}。然后，Python 脚本使用这些 csv 文件作为输入，以便使用 R 脚本“treat_seahorse_data.r”在 R 软件环境中进行后续分析。如数据分析部分 A 中对完整 Seahorse XFe96 数据的分析所述，我们使用线性混合效应模型来分析数据。线性混合效应模型的估计边际均值（以前称为最小二乘均值； Hayward等人，2021 年）的分析也在 R 中进行，并使用使用 Tukey 方法调整的p值评估统计差异。 Python 脚本将这些分析的结果输出到 3 个 csv 输出文件中，然后可以使用这些分析的数据在 GraphPad Prism 中创建图形。我们提供了三个补充数据文件（rep1_perm、rep2_perm 和 rep3_perm），用于使用 WT、r Tg QCR11 和 r Tg ApiCox25 寄生虫（ Hayward等人，2021 年）中描述的可用作测试数据集（图 8)。这些可以从 Bitbucket 存储库 ( https://bitbucket.org/ngMiaNG/seahorse-scripts/src/master/ ) 中的“test_data”子文件夹下载。

1. 测定完成后，将 Wave 结果文件保存到 USB 驱动器或通过电子邮件将数据发送给您自己。

2. 使用 Wave 程序打开文件。

3. 单击“添加 - 概述”以同时查看板图和结果。

4. 确保已勾选“背景校正”框 - 这会从实验孔中减去空白孔的耗氧率。

注意：如果背景孔中的 OCR 高于样品孔中的 OCR，则会产生负值。这在我们的实验中有时确实会发生，尤其是在敲除 ETC 蛋白时。我们当前的分析策略将这些负值包含在分析中；有关这一点的进一步讨论，请参见数据分析部分 C。

5. 检查数据中是否存在任何大的异常值——有时，化合物不能从其中一个端口正确注入或在分析期间注入的时间不正确，从而导致数据中的值错误。如果您有充分的理由相信发生了不正确的进样，则应取消选择这些孔，将其从后续分析中排除。

6. 单击“导出”按钮以 Microsoft Excel 格式导出结果。

7. Excel 文件中的相关数据位于“比率”选项卡中。请注意，数据由“测量”、“井”、“组”、“时间”、“OCR”、“ECAR”和“PER”列组成，其中行代表 96 口井的每个井的数据板在实验的时间点。

8. 独立执行 3 次测定后，将 Excel 结果文件（名为 rep1_perm、rep2_perm 和 rep3_perm）保存到仅包含这些文件的文件夹中。

这就是如何创建 r Tg QCR11 透化测试数据文件（rep1_perm、rep2_perm 和 rep3_perm）。请注意，在每个板上测试了其他条件，但已删除了无关孔的名称。

9. 转到https://bitbucket.org/ngMiaNG/seahorse-scripts/src/master/ ，从该存储库下载文件并保存到文件夹中。这包含“pre_R_script.py”Python 脚本、“treat_seahorse_data.r”R 脚本、“README”和“requirements”文本文件以及从 r Tg QCR11 Seahorse XFe96 实验获得的测试数据。

注意：这是包含用于分析完整的 MitoStress Seahorse XFe96 实验（数据分析部分 A）的文件的同一存储库。

a. 阅读“自述文件”以了解要求以及脚本的工作方式。

b. 例如， CMD）从命令行运行“pre_R_script.py”Python 脚本。

i. 该脚本具有内置帮助，可以通过在命令行中键入：python3 “pre_R_script.py” -h 来访问。

ii. 运行脚本的命令的一般结构如下： python3 “pre_R_script.py” -i “输入目录路径” -o “输出目录路径” -n “测量周期数，3 或 5” --烫发。

注：测试数据由 5 个测量周期组成。

iii. When --perm is selected, the “pre_R_script.py” Python script perform calculations of substrate dependent mOCR (sub_dependent_mOCR), TMPD dependent mOCR (TMPD_dependent_mOCR), and the ratio of TMPD to substrate dependent mOCR (ratio_TMPD_to_substrate) using the raw Excel results files （rep1_perm、rep2_perm 和 rep3_perm）作为输入。

注意：在 ratio_TMPD_to_substrate 的计算中，我们通常排除与底物相关的 mOCR 值小于 1 的样本，因为这些值不成比例地影响（并且可能高估）比率计算。

iv. 执行这些计算后，“pre_R_script.py”Python 脚本调用“treat_seahorse_data.r”R 脚本以将线性混合效应模型拟合到数据并执行统计分析（ANOVA 和事后 Tukey 检验）。

10. CSV。包含 R 分析结果的文件将写入指定为输出目录的文件夹。这将包括线性混合效应模型的估计边际均值、标准误差、自由度和 95% 置信区间，以及事后 Tukey 检验的统计显着性值。

11. 这些结果可用于在 GraphPad Prism 中绘制图形。柱形图描述了依赖于底物的 mOCR、依赖于 TMPD 的 mOCR 以及 TMPD 与依赖于底物的 mOCR 的比率是我们呈现数据的典型方式（图 8）。

图 8. 提供各种底物的透化寄生虫的 mOCR 分析示例（ Hayward等人，2021 年）。

广告。描述 ( A)苹果酸依赖性 mOCR (mOCR ^Mal)、( B) TMPD 依赖性 mOCR (mOCR ^TMPD)、( C) TMPD 相对于苹果酸对 mOCR 的刺激倍数 (mOCR ^TMPD/Mal) 和 (D) 3-磷酸甘油依赖性 mOCR (mOCR ^G3P)、WT（蓝色）、r Tg QCR11（橙色）和 r Tg ApiCox25（绿色）在不存在 ATc 或存在 ATc 的情况下生长的刚地弓形虫寄生虫1-3天。将线性混合效应模型拟合到数据和值描述了来自三个独立实验的估计边际平均值 ± 95% CI。进行了 Tukey 的多重成对比较测试，显示了调整后的p值。该图中的数据来自之前的一项研究（ Hayward等人，2021 年）。

C. 对数据统计分析的评论

如数据分析 A 和 B 部分所述，我们使用线性混合效应模型来分析来自完整 MitoStress 和透化T. gondii Seahorse XFe96 检测的输出数据。我们使用线性混合效应模型，因为它有助于处理这些实验相当复杂的数据结构。不同的组（例如， WT 和 r Tg QCR11）和服药天数（例如，ATc 天 0-3）有助于我们希望估计的 OCR 和 ECAR 的平均差异。但是，板内的重复孔和时间点测量值（即技术重复）之间以及在不同日期进行的实验（即独立的生物重复）中的重复孔和时间点测量值之间会发生变化。线性混合效应模型使我们能够将由于我们感兴趣的因素（“固定效应”）导致的 OCR 和 ECAR 差异与技术和生物复制中的“随机”变化区分开来。为了说明这一点，我们将 WT 和 r Tg QCR11 寄生虫的基础 mOCR 绘制为箱线图，其中三个独立实验中的每一个都以不同的颜色显示，并且还显示了在实验的不同孔和时间点中获得的值（图 9A）。在这些实验中，生物复制 2（rep_2，绿色）在不同条件下具有始终较高的基础 mOCR 值（图 9A）。

线性混合效应模型比较板内（即实验内）的条件，以帮助解释实验之间的这种变化，从而尽可能精确地测量处理效果。为此，我们将板（实验之间，或“生物复制”）和孔（实验内，或“技术复制”）之间的差异设置为随机效应，以及细胞系和药物天数之间的差异（例如，ATc ) 在与固定效应相同的实验中。线性混合效应模型对数据的方差进行分析，并使用基于 Tukey 方法的调整后的p值测试估计边际均值之间的统计差异。该分析的结果表明，虽然 ATc 对 WT T. gondii寄生虫的 OCR 没有影响，但 ATc 对Tg QCR11 的敲低导致基础 mOCR 显着降低，在 ATc 上到第 3 天基本上为零（图 9B）。

使用这种方法时要考虑的一点是，ANOVA 假设样本之间的方差相等。当比较 WT 和 r Tg QCR11 寄生虫的盒子大小时，很明显，在 ATc 上生长 2-3 天的 r Tg QCR11 寄生虫的方差小于其他条件（图 9A），因此等方差的假设是这个数据集没有严格满足。解决此问题的一种方法是在进行线性混合效应模型分析之前记录转换数据（可以轻松修改 R 脚本来执行此操作）。当我们在对数尺度上绘制相同的基础 mOCR 数据时（图 9C），条件之间的差异更加相等。因此，在分析之前对数据进行对数转换可以更好地满足方差相等的 ANOVA 假设。当使用线性混合效应模型分析对数转换的基础 mOCR 值时，可以从数据中得出相同的一般结论；具体而言，ATc 对Tg QCR11 的抑制导致基础 mOCR 显着降低，到第 3 天基本为零（图 9D）。虽然平均值通常相同，除了在对数转换期间排除负值的情况（见下文），95% 置信区间误差条已经改变。此外，使用第一种方法具有统计学意义的一些比较不再如此（例如， WT 第 0 天与 r Tg QCR11 第 0 天）（图 9D）。

对数转换数据的一个关键限制是，如果数据集包含负值（如我们的 r Tg QCR11 数据集所做的那样），则在对数转换期间会排除这些值。理论上，负 mOCR 值在生物学上是不可能的，因为寄生虫不会产生氧气。因此，当出现负值时，这些孔中的 mOCR 可能刚好接近背景并且基本上为零。由于我们在敲除在 ETC 中起作用的蛋白质时经常观察到负 mOCR 值（例如，在 ATc 上生长 3 天的 r Tg QCR11 寄生虫），我们不想简单地从数据集中排除这些值，因为它们仍然有意义（即，它们反映了这些井中的 mOCR 接近于零）。如果我们希望将这些值包含在使用对数转换数据的分析中，那么我们需要一种方法在进行对数转换之前使它们为非负数。关于如何最好地做到这一点，没有明确或简单的解决方案。一种方法是给负值分配一个极小的正值。另一种是识别最低的负值并将该值添加到数据集中的所有其他值（实际上是将数据标准化为最低的负值）。然而，这两种方法都不是特别令人满意，因为第一种方法会人为地减少包含负值的条件的变化（例如，在 ATc 上生长 3 天的r Tg QCR11 寄生虫），而第二种方法可能会导致在数据集过度影响数据集的其余部分。

我们在本节中描述的数据处理和分析方法可以在不同的实验条件之间进行比较。我们注意到，根据数据的处理和分析方式，计算出的 mOCR 和 ECAR 值可能会有所不同，研究人员在将其解释为绝对值时应谨慎。在进行统计分析之前可视化数据集对于了解数据的特征（例如，总体趋势、分布、方差、负值）非常重要。这将有助于告知哪种分析方法适合数据集，例如在使用线性混合效应模型之前是否需要对数据进行对数转换。就您的特定数据集咨询统计学家也是一个好主意。也许最重要的是，在您的出版物的方法部分清楚和开放地说明数据分析的执行方式将有助于提高 Seahorse XFe96 实验的透明度和可重复性。

图 9 。基础 mOCR 数据的两种分析策略的比较。

A、C.描绘 WT 或 r Tg QCR11 T. gondii寄生虫在 ATc 不存在或存在下生长 1-3 天的基础线粒体耗氧率 (mOCR) 的箱线图，呈现在 ( A) 线性或 (C)上对数刻度。描述了三个独立的生物复制中的每一个（红色复制 1，绿色复制 2，蓝色复制 3），技术复制（不同的孔和不同的时间点测量）显示为点。 B、D. 柱形图，描绘了 WT（蓝色）和 r Tg QCR11（橙色）弓形虫在不存在或存在 ATc 的情况下生长 1-3 天的基础 mOCR。将线性混合效应模型拟合到 (B) 线性或 (D) 对数转换的基础 mOCR 数据。数值描述了三个独立实验的估计边际平均值 ± 95% CI。进行了 Tukey 的多重比较检验，显示了调整后的 p 值。 (B) 与图 7A 相同，源自Hayward等人。 (2021 ) ，并在此处显示以便与 (D) 进行比较。

食谱

1. 碳酸氢钠 (0.1 M)

将 420 毫克碳酸氢钠溶解在 50 毫升 MilliQ 水中。

使用 0.2 µm 过滤器过滤消毒。

存储在 RT。该溶液用于激活 Cell-Tak 溶液以涂覆 Seahorse XFe96 培养板。

2. 谷氨酰胺原液（200 mM）

D将 1.461 g L-谷氨酰胺溶解在 ~45 mL Seahorse XF 基础培养基中，将 pH 调节至 7.4，并将体积调节至 50 mL 。

使用 0.2 μm 过滤器过滤消毒。

储存在 -20°C 直到需要。

3. 葡萄糖储备 (1 M)

D将 9 g D-葡萄糖溶解在 ~45 mL Seahorse XF 基础培养基中，测量 pH 值，必要时调节至 7.4，并将体积调节至 50 mL 。

使用 0.2 μm 过滤器过滤消毒。

储存在 4°C 直到需要。

4. 含有葡萄糖 (5 mM) 和谷氨酰胺 (1 mM) (BM+Glc+Gln) 的基础培养基

将 250 μ L的葡萄糖储备 (1 M) 和 250 μ L的谷氨酰胺储备 (200 mM) 添加到 50 m L的 Seahorse XF 基础培养基中。

我们建议每次进行测定时都使该溶液新鲜。

5. FCCP 库存 (50 毫米)

L DMSO中溶解 10 mg FCCP 。

等分小体积并储存在 -20°C 直到需要。

6. Atovaquone 库存 (10 毫米)

D在 2.726 m L DMSO中溶解 10 mg atovaquone 。

等分小体积并储存在 -20°C 直到需要。

7. 洋地黄皂苷原液 (5% w/v)

D在 2 毫升 MilliQ 水中溶解 100 毫克洋地黄皂苷。

可保持在 4°C 直至需要。

洋地黄皂苷会在较冷的温度下沉淀，因此在约 90°C 下短暂加热，以便在使用前立即将洋地黄皂苷重新溶解。

8. 线粒体检测溶液 (MAS) 缓冲液 (1 × , 500 m L )

甘露醇 20.039 克，220 毫米

蔗糖 11.981 克，70 毫米

KH ₂PO ₄680 毫克，10 毫米

氯化镁₂508 毫克，5 毫米

HEPES 238 毫克，2 毫米

EGTA 190 毫克，1 毫米

不含脂肪酸的 BSA*，0.2% (w/v)

将除 BSA 以外的所有试剂溶解在 ~400 m L o的MilliQ 水中；用氢氧化钾 (KOH) 将 pH 值调节至 7.4；补足 500毫升。使用 0.2 μm 过滤器进行过滤灭菌，以便在 4°C 下长期储存。

*注意：在检测当天将 100 mg 不含脂肪酸的 BSA 添加到 50 mL MAS 缓冲液中。

9. 苹果酸原液（320 毫米）

D将 858 毫克 L-苹果酸溶解在 ~10 毫升MAS缓冲液中。

用氢氧化钾 (KOH) 调节 pH 至 7.4；补足 20毫升。

等分小体积并储存在 -20°C 直到需要。

10. 甘油 3-磷酸原液 (200 mM)

D溶解 741 mg 的sn-甘油 3-磷酸双（环己基铵）盐在 ~5 m L MAS 缓冲液中。

用氢氧化钾 (KOH) 调节 pH 至 7.4；补足 10毫升。等分小体积并储存在 -20°C 直到需要。

11. TMPD 库存（500 毫米）

D在 5 mL乙醇中溶解 411 mg N,N,N',N'-四甲基-对苯二胺。

等分小体积并储存在 -20°C 直到需要。

12. 抗坏血酸原液 (200 mM)

D在约 10 m L MAS 缓冲液中溶解 704 mg L-抗坏血酸。

用氢氧化钾 (KOH) 调节 pH 至 7.4；补足 20毫升。

等分小体积并储存在 -20°C 直到需要。

13. 叠氮化钠原液 (110 mM)

D在 20 毫升MAS缓冲液中溶解 143 毫克叠氮化钠。

等分小体积并储存在 -20°C 直到需要。

致谢

这项工作得到了对 JAH 的澳大利亚政府研究培训计划奖学金、对 ER 和 GGvD 的澳大利亚国立大学生物研究学院的创新赠款以及对 GGvD 的国家健康和医学研究委员会的创意赠款 (GNT1182369) 的支持。

利益争夺

作者声明不存在相互竞争的利益。

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