材料和试剂

1. 8 至 12 周大的无特定病原体 (SPF) 雄性和雌性 C57BL6 小鼠（杰克逊实验室、查尔斯河或哈伦）（通常每组 8 只小鼠，基于功率计算，见下文）

2. 血琼脂板（Biomerieux，目录号： 1008498740)

3. 丝线缝线（Mersilk 5-0，Ethicon，目录号： W580）

4. 1 mL注射器（BD Plastipak，目录号： 2102196）

5. 25 G针（BD Microlance，目录号： 300600 ）

6. 22 G IV插管（ICU Medical，目录号： 95-201-KY ）

7. PE50 聚乙烯管 (Becton Dickinson, 7248724)

8. 砂纸（3M，目录号： P240 ）

9. 50 mL聚丙烯管（S arstedt，目录号： 1040721）

10. 5 mL 聚丙烯管（Greiner Bio-One，目录号： 21130132)

11. 1.5 mL eppendorf 管（Greiner Bio-One，目录号： 616201)

12. 2.0 mL eppendorf 管（Sarstedt，目录号： 0084421）

13. Micronic 管( Micronic, 目录号： MP22400）

14. 96孔U底板（Greiner Bio-One，目录号： E21023FE）

15. 0.5 mL 肝素微量收集管（ Greiner Bio-One，目录编号： CA20074MH )

16. 细菌

a. 铜绿假单胞菌菌株 PAK ( ATCC -25102; Qin et al ., 2021a ) 和 PAO1 ( ATCC-15692; Anas 等人，2016； Qin et al ., 2020 )，15% 甘油冷冻原液和 4 mm 无菌玻璃珠。

b. 肺炎克雷伯菌血清型 2（美国典型培养物保藏中心，目录号： 43816），15% 甘油中的冷冻原液和 4 mm 无菌玻璃珠。

17. 胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，Becton Dickinson，目录号：211825 ）

18. 无菌 0.9% NaCl（Baxter Healthcare AS，目录编号： 21BO3BB1B)

19. 无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fresenius Kabi，目录号： 16PK9479)

20. 70% 乙醇（添加 Pharma，目录号： ROL1642610)

21. 异氟醚（Isoflutek，Laboratories Karizoo，目录号：注册 NL 118938)

22. 10%（100 mg/mL）氯胺酮（Alfasan，目录号：注册。 NL 5811 UDD)

23. 0.5 mg/mL 右美托咪定（Dexdomitor，目录号：注册。 NL 10306)

24. 0.5 M EDTA 溶液（ ThermoFisher，目录号： 15575020）

25. RNaseZap（ThermoFisher，目录号： AM9780）

26. 病理学盒（Epredia，目录号： 22272418）

27. 4% 甲醛（10% 福尔马林，ProPath）

28. 蛋白酶抑制剂鸡尾酒片抑制剂（Merck，目录号： 11836145001）

29. NucleoSpin 柱 RNA 分离试剂盒（Macherey Nagel，目录号： 1911/004）

30. MMLV 逆转录酶（Promega，目录号： M1705)

31. 细胞计数珠阵列（CBA）小鼠炎症试剂盒（BD Biosciences，目录号： 552364)

32. ELISA 试剂盒（研发系统，目录号： DY401 [IL1β ]、 DY406 [IL6]、DY410 [TNF]、 DY453 [CXCL1 ]、DY443 [CXCL5]、DY760 [CCL20]、DY3667 [髓过氧化物酶]和 DY4517 [弹性蛋白酶]）

33. 流式细胞仪抗体

大鼠抗小鼠 CD11b PE-Cy7（克隆 M1/70；BD Biosciences ，目录号：561098 ）

大鼠抗小鼠 Siglec-F Alexa Fluor 647（克隆 E50-2440；BD Biosciences ，目录编号： 562680 )

大鼠抗小鼠 Ly-6C Alexa Fluor 700（克隆 AL-21；BD Biosciences ，目录号：561237 ）

大鼠抗小鼠-CD45 PE-eFluor610（eBiosciences，30-F11，目录号： 61-0451-82 )

大鼠抗小鼠 Ly-6G FITC（克隆 1A8；Biolegend，目录号：127605 ）

34. 计数珠（Biolegend，目录号： 424902)

35. Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（ThermoFisher，目录号： 23225）

36. 苏木精溶液（VWR International，目录号： VWRK4085.9002）

37. 曙红Y二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号： E6003-25G）

38. Tris 碱基（Merck，目录号： 11814273001）

39. MgCl ₂· 6H ₂O（Merck，目录号： 1058330250）

40. Triton X-100（默克，目录号： X100-1L）

41. 32% HCl溶液（Merck，目录号： 1003191011）

42. Luria 肉汤（LB，Becton Dickinson，目录号：244620）

43. Luria-Bertani (LB) 培养基（见配方）

44. 胰蛋白酶大豆肉汤 (TSB) 培养基（参见食谱）

45. 氯胺酮/右美托咪定（见食谱）

46. 2 ×细胞裂解缓冲液（CLB，参见配方）

47. 2 mM EDTA-PBS 溶液（见配方）

设备

1. ABSL-2 生物安全柜（Biohazard，目录号： EN12469 ）

2. 微生物培养箱（松下，型号：MIR-254-PE）

3. 分光光度计（Merck ，型号：分光光度计 Pharo 100）

4. 离心机（海蒂诗，型号： Riotina 380R）

5. DNA/RNA UV-cleaner box（Biosan，型号：UVT-B-AR）

6. 涡流（VWR 国际，目录号： 111336624 ）

7. 麻醉蒸发器（Datex-Ohmeda，型号：Tec7）

8. 切片机（徕卡，型号： RM2245）

9. 手术剪

10. 细镊子

11. 移液器（Sartorius，型号：P20、P200 和 P1000 ）

12. 多道移液器（赛多利斯，型号：P50 和 P300s）

13. 均质机（Qiagen，型号：985370-395）

14. pH计（Hanna Instruments，目录号：HI2210-02）

15. L 形一次性吊具（Thomas Scientific，目录号：1202F84）

16. -80°C冰箱（Panasonic，目录号： 13010003）

17. -20°C冰箱（Sanyo，目录号： alt-314）

18. LightCycler 480实时PCR系统（Roche，目录号： D10003）

19. Synergy 多模式酶标仪（BioTek，目录号： 232560）

20. Cytoflex S（Beckmann Coulter，目录号： B75442）

软件

1. GraphPad 8.0 版（GraphPad 软件）

2. FlowJo 软件 (Becton Dickinson )

3. 组大小的功率计算 ( https://clincalc.com/stats/samplesize.aspx )

程序

注意：在生物安全 2 级实验室执行所有程序。此外，在所有程序中应用无菌条件。

A. 铜绿假单胞菌诱发急性肺炎和器官取样

1. 铜绿假单胞菌的制备接种物

a. 铜绿假单胞菌转移一个玻璃珠将冷冻原液中的 PAK 细菌放入装有 50 mL 液体 LB 培养基的烧瓶中，并在 37°C 下培养过夜，在细菌培养箱中以 200 rpm 的速度搅拌。

b. 将 1 mL 的隔夜生长的细菌培养物转移到 100 mL 的新鲜 LB 肉汤中。在 37°C 下以 200 rpm 搅拌培养细菌约 3 小时。使用分光光度计测量 OD _{620nm ，当 OD 620nm}达到 0.5时，将细菌培养物置于冰上。

c. 将 100 mL 细菌收集到两个 50 mL 管中并以 4,000 ×离心 g在 4°C 下持续 10 分钟，刹车 5。

d. 用冷无菌 0.9% 盐水清洗细菌两次，并将细菌颗粒重新悬浮在 10 mL 的 0.9% 盐水中。如果 OD _620nm不是 0.5，则根据公式调整 0.9% 盐水的最终体积：最终体积 (mL)= 10 × OD ₆₂₀/0.5。

e. 在冷盐水中将细菌稀释 10 倍，以获得 1 × 10 ⁹菌落形成单位 (CFU)/mL（即5 × 10 ⁶CFU/50 µL）的最终浓度。制备后立即使用细菌，并在转移到小鼠设施时将细菌保持在冰上。

f. 为了验证接种物的细菌浓度，取一份接种物并在无菌 0.9% 盐水中稀释 10、100 和 1000 倍。使用 L 形吊具在血琼脂 (BA) 板上稀释 50 μL，并将每个稀释液一式三份。在 37°C 培养过夜并计数每个板上的菌落。计算接种物的实际细菌浓度：10、100 或 1000 倍稀释的平均 CFU 乘以稀释 = CFU/50 μL = CFU/小鼠。

g. 其他铜绿假单胞菌菌株以类似方式制备。

2. 肺炎的诱导（图1A）

a. ₂，2 L/min）麻醉小鼠约 2 分钟。检查每只鼠标是否已正确麻醉。

b. 将鼠标翻转到背面，将其放在左手手掌中，然后将头部轻轻固定在拇指和食指之间。将鼠标保持45 °角。

c. 用 100 μL 移液器取 50 μL 的细菌悬浮液。将尖端靠近鼠标的一个鼻孔。慢慢地用移液管接种到鼻孔上，等到细菌悬浮液被完全吸入。

d. 吸入液体后，将鼠标放回笼子中。

e. 几分钟后检查小鼠是否从手术中恢复。

注意：当感染持续时间很短（即少于6小时）时，等待3分钟再感染下一只小鼠，并标记所有小鼠以跟踪被感染小鼠的顺序。

图 1.铜绿假单胞菌诱发急性肺炎和器官取样程序的示意图。

A.通过气道用500 万个铜绿假单胞菌感染小鼠诱导急性肺炎。 B.器官取样。 1.放一个在左肺叶上方的左支气管周围进行丝线缝合； 2. 使用塑料 IV 插管收集支气管肺泡灌洗液 (BALF) ； 3. 使用粗糙的短 PE50 管进行支气管刷。光盘。样品处理和测量。有关详细步骤，请参见程序 A。

3. 器官取样(图 1B)

注意：在生物安全柜中执行所有程序。对每只小鼠的所有器官进行采样大约需要 3 分钟。当小鼠被感染的时间少于 6 小时时，需要按照与接种期间相同的顺序和时间处死小鼠。

a. 在接种后 2、6 或 24 小时，通过腹腔注射 200 μL 氯胺酮/右美托咪定溶液对小鼠进行麻醉。

b. 完全镇静后（通常需要约 3 分钟），将动物仰卧在手术板上，并在颈部和腹部喷洒 70% 乙醇对皮肤进行消毒。

c. 使用 1 mL 注射器和 25 G 针头通过心脏穿刺采集血液。

d. 用镊子和剪刀打开胸腔，露出肺部和气管。

e. 从右肺叶收集 BALF（图 1B1-2）

i. 为防止灌洗液进入左肺叶，请使用一对镊子在左肺叶上方的左支气管周围放置丝线缝合。

ii. 用小剪刀小心地在气管上部剪一个小孔。注意不要进一步损坏气管。

iii. 小心地将塑料 IV 套管针（丢弃金属内针）插入气管，直到气道的右分支。确保导管没有插入气管太深，以保持肺结构的完整性。

iv. 通过使用丝线缝合或用镊子将气管绑在导管周围来稳定导管。

v. 将装有 0.5 mL 冷无菌PBS 并辅以 2 mM EDTA 的 1 mL 注射器连接到塑料套管的末端。

vi. 小心缓慢地将溶液注入肺部。 1 分钟后，慢慢吸出溶液，同时轻轻按摩肺部。

vii. 中的液体并置于冰上。

viii. 用另外 0.5 mL 的 PBS-EDTA 溶液重复步骤 v 和 vii

ix. 将两个灌洗样品汇集在一起，并将 BALF 保持在冰上，直到进一步处理。

f. 收集肺刷（图 1B3）

i. 在器官取样前准备支气管刷。将 PE50 管切成 3 厘米长的块。用砂纸将管道表面粗糙化，并用 RNaseZap 处理粗糙的管道。将管子放在紫外线清洁盒中 30 分钟，使其干燥。

ii. 将粗糙的短 PE50 管（支气管刷）插入右主支气管，轻轻刷（扭转），并立即将支气管刷放入2 mL Eppendorf 管中，其中含有 750 μL 来自 RNA 分离试剂盒的 RA1 缓冲液，用于 RNA 分离。

iii. 彻底涡旋管并置于冰上。回实验室后转移至-80°C保存至RNA分离。

g. 收集左肺叶。用剪刀剪断支气管的左分支，小心地收获左肺叶，并将其放入病理盒中。通过将病理盒放入装有新鲜制备的 4% 甲醛的容器中过夜来固定组织，以进行组织化学分析。

h. 小鼠尸体根据国家处置（转基因）小鼠和病原体指南进行处置。

4. 样品处理和测量（图 1C 和 1D）

a. 肺泡腔细菌负荷评估

i. 使用 P300 多通道移液器，用无菌冷 PBS（180 μL/孔）从第 1 列到第 8 列填充 96 孔 U 型底板的 64 个孔。

ii. 涡旋 BALF 样品，并将 20 μL 的 BALF 流体添加到板的第一列中的 180 μL 的 PBS 中，进行 10 倍的连续稀释。通过上下吹打 10 次充分混合。使用 P50 多通道移液器，将 20 μL 的第一列转移到含有 180 μL PBS 的第二列，并重复稀释步骤最多 8 次。

iii. 使用 P50 多通道移液器，将 50 μL 的 4 种稀释剂点样到血琼脂板上，并立即将板倾斜到 45 °角，以使液体流动约 3-4 厘米长。一个 BALF 样品的 8 次稀释需要两个板。将板在 37°C 下孵育过夜（或 14 小时），并计数菌落。

b. 肺泡室内可溶性介质的检测

i. 将 500 μL BALF 样品从每只小鼠转移到新的 1.5 mL Eppendorf 管中，并以 400 ×离心管 g在 4°C 下 8 分钟。

ii. 使用 1 mL 移液器小心地将 BALF 上清液转移到新的 1 mL 微管中，不要接触细胞沉淀，并将 BALF 样品储存在 -20°C 直至使用。（有关细胞沉淀的处理，请参见下文）。

iii. 炎症介质 [细胞因子如白细胞介素 (IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子 (TNF)-α 和趋化因子如趋化因子（CXC 基序）配体 (CXCL)-1、CXCL-2、CXCL-5、趋化因子（CC 基序）配体 20]、中性粒细胞脱粒产物（髓过氧化物酶和弹性蛋白酶）或 BALF 中的其他可溶性介质可通过 ELISA 检测

iv. 可以通过ELISA测量BALF中的肺损伤指标，例如白蛋白和IgM。 BALF中的总蛋白浓度可以通过BCA来测量。

c. 流式细胞仪检测白细胞流入

i. 重悬细胞沉淀（来自步骤 4b ii ）并以 400 ×离心 g在 4°C 下 8 分钟。丢弃上清液并再次重复此步骤。

ii. 将细胞沉淀重悬于 100 μL 冷 PBS 中，并用抗体混合物对细胞进行染色以进行流式细胞术分析（例如，抗 Siglec-F 和抗 CD11c 用于肺泡巨噬细胞，抗 Ly6G 和抗 CD11b 用于中性粒细胞，或单核细胞的抗 Ly6C 和抗 CD11b）。

iii. 在 4°C 避光孵育 30 分钟后，用冷 PBS 洗涤细胞，离心 500 × g在 4°C 下 5 分钟，然后重悬于正好 100 µL 的 PBS 中。大力涡旋计数珠。将 10 μL 的计数珠（10,000 个珠子）添加到每个样品中，并用多通道移液器彻底混合。通过流式细胞仪分析细胞。可以根据其表面标志物检测先天免疫细胞群；肺泡巨噬细胞 Siglec-F ⁺CD11c ⁺、中性粒细胞 Ly6G ⁺CD11b ⁺和单核细胞，Ly6G ^-CD11b ⁺Ly6C^高或 Ly6G ^-CD11b ⁺Ly6C^低。获取细胞和足够数量的珠子（例如，3,000-5,000 个珠子）。

iv. 总 BALF 细胞和每个细胞群的数量可以根据所使用的计数珠的数量以及流式细胞仪分析中细胞和珠的比例来计算。

d. 气道上皮细胞基因表达的检测

i. 根据制造商的说明，使用 NucleoSpin 柱 RNA 分离试剂盒从支气管刷中分离RNA 。

ii. 制造商的说明使用 MMLV 逆转录酶从 RNA 合成 cDNA 。

iii. RT-qPCR 用于测量上皮细胞特异性基因的表达（例如如 Qin 中所述的趋化因子和上皮屏障蛋白的编码基因等人，2021a 和 2021b ）对肺先天免疫很重要。

e. 肺组织病理学分析

i. 在福尔马林中过夜固定后，将肺叶嵌入石蜡中。

ii. 根据标准组织学程序，在切片机上切割 4 µm 厚的切片并用苏木精和伊红染色（ Fischer等人，2008 年）。

iii. 肺切片由对治疗或基因型不知情的病理学家评分，如所述（ Meijer 等人，2021 年）。

B. 肺炎克雷伯菌诱导传播性肺炎和器官取样

1. 肺炎克雷伯菌的制备接种物

a. 肺炎克雷伯菌的玻璃珠，然后转移到装有 50 mL 液体 TSB 介质的烧瓶中。将细菌在 37°C 的细菌培养箱中培养过夜，不要摇晃。

b. 将 1 mL 的隔夜生长的细菌培养物转移到 100 mL 的新鲜温暖 TSB 液体培养基中。在 37°C 下培养细菌约 2.5 小时，直到 OD _620nm达到 1.0。

c. 将 10 mL 的细菌培养物转移到 50 mL 管中，并加入 40 mL 的冷无菌 0.9% 盐水。 4,000×离心机 g在 4°C 下持续 10 分钟，制动为 0。

d. 小心地从“松散”的细菌细胞沉淀中取出上清液。用冷盐水清洗细菌两次，并用 10 mL 盐水重新悬浮细菌颗粒。如果 OD _620nm不是 1.0，则根据公式调整 0.9% 盐水的最终体积：最终体积 (mL) = 10 × OD ₆₂₀/1.0。

e. 中将细菌稀释 2,000 倍至最终浓度为 200,000 CFU/mL（即10,000 CFU/50 μL）。制备后立即使用细菌，并在转移到小鼠设施期间将细菌保持在冰上。

f. 为了验证接种物的细菌浓度，取一份接种物，并在无菌 0.9% 盐水中稀释 10、100 和 1,000 倍。在 BA 板上将 50 μL 的稀释液分成三重，并使用一次性 L 形吊具在琼脂表面传播细菌。在 37°C 培养过夜并计数菌落。计算接种物的实际细菌浓度。

2. 传播性肺炎的诱导（图 2A）。该过程与上述步骤A2中描述的相同。每 12 小时或更频繁地检查动物的不适（整体行为），以确保不适保持在预定义的人道端点内。

图 2.肺炎克雷伯菌诱导传播性肺炎和器官取样程序的示意图。

A.通过气道用 10,000 CFU 的肺炎克雷伯菌感染小鼠，诱导肺炎和肺炎衍生败血症。公元前。器官（血液、肺、脾和肝）的取样和处理。 D. 测量（肺、肝和脾的病理变化；血液、肺、肝和脾中的细菌负荷；通过 ELISA 检测到的血液、肺、肝和脾中细胞因子和趋化因子的产生）。 4V生理盐水：4体积生理盐水； CLB：细胞裂解缓冲液。

3. 采样器官（图 2B）

a. 在接种后 12、24 或 42 小时，通过腹腔注射 200 μL 氯胺酮/右美托咪定溶液对小鼠进行麻醉。

b. 完全镇静后（通常需要约 3 分钟），将动物仰卧在手术板上，并在颈部和腹部喷洒 70% 乙醇对皮肤进行消毒。

c. 使用 1 mL 注射器和 25 G 针头通过心脏穿刺采集血液。将 500 μL 的血液转移到每个涂有肝素的 minicollect 管中，轻轻摇晃，然后放在冰上。可以从一只老鼠身上获得大约 700 µL 的血液。

d. 收集器官组织：

i. 用镊子和剪刀打开腹部和胸部，露出肺、肝脏和脾脏。

ii. 收集右肺叶、半个脾脏和一小块肝脏；将它们分别放入三个 4 mL 聚丙烯管中，顶部分别标有蓝色（肺）、红色（脾脏）和绿色（肝脏）颜色，管侧有鼠标 ID。

iii. 称量组织 (mg) 并添加 4 倍重量的冷 PBS (以微升为单位)。验证器官是否位于浸没在 PBS 中的试管底部。将管子放在冰上。

iv. 收集左肺叶、剩余的一半脾脏和一小块肝脏，放入标有小鼠 ID 的病理盒中。将病理盒转移到装有新鲜制备的 4% 福尔马林的容器中，以便稍后进行病理（组织学）分析。

v. 或者，可以按照上述程序 A 中的描述收集 BALF 和 BALF 细胞，而不是病理学分析。

4. 样品处理和测量（图 2C 和 2D）

a. 评估血液和器官中的细菌负荷：

i. 用均质机以最大速度将器官均质化 10 秒。匀浆后立即将匀浆置于冰上

ii. 每次均质化后，将尖端分别浸入 25 mL 盐水、25 mL 70% 酒精和 25 mL 盐水的 50 mL 管中，清洁均质器。在每种溶液中清洗尖端 10 秒，并在最后用盐水清洗后用组织干燥均质器。

iii. 如程序 A 第 4ai-iii 段所述，对血液和均质器官进行连续稀释，将样品铺板在 BA 板上并培养细菌菌落。

b. 检测血浆和器官匀浆中的可溶性介质

i. ×离心血液样本 g在 4 °C 下 10 分钟。小心地，用 200 μL 移液器收集血浆并将其转移到微管（带鼠标 ID）。将血浆储存在 -20°C 直至使用。

ii. 添加蛋白酶抑制剂（使用制造商建议的浓度） HYPERLINK "https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/roche/coro" 的相同体积的 2 × CLB稀释器官匀浆，以最大速度剧烈涡旋5 秒，并在冰上孵育 30 分钟。以 3,000 ×离心组织裂解物 g ，在4°C 下 10 分钟。小心地将上清液收集在微型管中（标有小鼠 ID），并储存在 -20°C 直至分析

v. 血浆和组织匀浆中的炎症介质（细胞因子和趋化因子）和中性粒细胞产物（髓过氧化物酶和弹性蛋白酶）可以通过 CBA 试剂盒或商业 ELISA 检测。

vi. 可以测量小鼠血浆中的器官损伤标志物，包括肝损伤标志物[丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）]、肾损伤标志物（血尿素和肌酐）和一般损伤[乳酸脱氢酶（LDH）]通过常规临床化学。

c. 器官的病理学分析。

i. 对于石蜡包埋、切片和组织学染色，请参见上文第 4e 段的程序 A。

ii. Meijer等人，2021 ），由对小鼠治疗或基因型不知情的病理学家对肺、脾脏和肝脏的病理变化进行评分。

数据分析

通过量化支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织和器官中的细菌计数来确定肺和器官中的抗菌反应（秦等人，2020 年和 2021 年a ）；肺中的炎症反应参数，例如细胞因子水平，通过 ELISA（使用内部标准）确定。通过病理学分析和通过使用ELISA测量肺匀浆中的髓过氧化物酶和弹性蛋白酶水平来确定肺部炎症。在 BALF 中，使用流式细胞仪测定白细胞流入量（ Qin等人，2020 和 2021 a ）。通过使用 RT-qPCR 分析测量肺刷中炎症基因（相对于管家基因）的 mRNA 水平来评估上皮细胞反应（ Qin等人，2020、2021 a和2021 b ）。通过评估血浆和器官匀浆中的细胞因子水平来确定全身炎症反应。通过测量血浆中的 ALT、AST、血尿素、肌酐和 LDH 浓度来确定器官损伤（ van Lieshout等人，2014；de Porto 等人，2019 年），并通过病理学分析。通过 Mann-Whitney U 检验比较两组之间的统计差异（例如未感染与感染，或野生型小鼠与转基因小鼠）。

食谱

1. Luria-Bertani (LB) 培养基

将 20 g LB 粉末溶解在 1 L双蒸水中。

在 121°C 高压灭菌 20 分钟。

冷却至室温后使用或储存在 4°C 以备后用。

2. 胰蛋白酶大豆肉汤 (TSB) 培养基

将 30 g TSB 粉末溶解在 1 L 双蒸水中。

在 121°C 高压灭菌 20 分钟。

冷却至室温后使用或储存在 4°C 以备后用。

3. 氯胺酮/右美托咪定溶液

用氯胺酮（12.5 mg/mL）和右美托咪定（30 μg/mL）制成氯胺酮/右美托咪定溶液）。使用实验前刚准备好的。

每只鼠标使用 0.2 mL。

4. 2 ×细胞裂解缓冲液/ CLB (500 mL)

8.77 克氯化钠（300 毫米）

1.82 克 Tris 碱基（30 毫米）

0.2 g MgCl ₂· 6H ₂O (2 mM)

5 毫升 Triton X-100 (1% v/v)

溶解在 750 mL 的双蒸水中。

使用 HCl 将 pH 值调节至 7.4。

用双蒸水将体积调整至 1,000 mL。

4℃保存，一个月内使用。

在 50 mL 管中分装 25 mL，并在使用前加入一片蛋白酶抑制剂。

5. 2 mM EDTA-PBS 溶液

将 200 µL 的 0.5 M EDTA 溶液添加到 500 mL 的 PBS 中，保持无菌并在 4°C 下储存长达两个月。

致谢

我们感谢 MS 10 Brink 对动物实验的帮助。 WQ 和 ZL 由中国国家留学基金委 (CSC) 提供奖学金支持。该方法源自Qin et al ., 2021 a (DOI: 10.1371/journal.ppat.1009491) 的原始出版物。

利益争夺

作者宣称不存在竞争利益。

伦理

所有实验均由阿姆斯特丹大学阿姆斯特丹-UMC 动物科学程序中央管理局 (CCD) 和动物福利机构 (IvD) 审查和批准。除了 2009 年 5 月 6 日的指令（指令 2009/41/EC）之外，动物护理和使用协议还遵守荷兰动物实验法 (WOD) 和 2010 年 9 月 22 日的欧洲指令（指令 2010/63/EU）。

参考

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