材料和试剂

1. 1.5 mL Eppendorf（EP）管（Eppendorf，目录号：022363204）

2. 50 mL 试剂容器（康宁，目录号：CLS4870）

3. 200 μL 多道移液器（吉尔森，目录号：FA10012）

4. 广口聚丙烯标准喷口清洗瓶（SP SCIENCEWARE，目录号：46C798）

5. 纸巾（Skilcraft，目录号：5LA76）

6. Costar 96孔平底EIA板（Bio-Rad，目录号：2240096）

7. 12 × 75 mm FACS管（BD Biosciences，目录号：342065）

8. DPBS，不含氯化钙和氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）

9. RPMI 培养基 1640（Sigma-Aldrich，目录号：R8758-24X500ML）

10. 胎牛血清（Fisher Scientific，目录号：16140089）

11. 青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15-140-122）

12. L-谷氨酰胺（Thermo Scientific，目录号：25030081）

13. 抗体：

Ultra-LEAF ^TM纯化的抗人 CD16（Bioledgend，目录号：302050）

抗 CD3-AF700（BD Biosciences，目录号：557943）

抗 CD14-APC/Cyanine7（BioLegend，目录号：301820）

抗 CD19-APC/Cyanine7（BioLegend，目录号：302218）

抗 CD56-PE/Cyanine7（Beckman Coulter，目录号：A51078）

抗 CD107a-BV786（BD Biosciences，目录号：563869）

抗-IFN-γ-APC（BioLegend，目录号：502512）

抗 TNF-α-Pacific Blue（BioLegend，目录号：502920）

14. LIVE/DEAD ^TMFixable Far Red Dead Cell Stain Kit，用于 633 或 635 nm 激发（Invitrogen，目录号：L34973）

15. Brefeldin A 溶液（1,000 × ）（BioLegend，目录号：420601）

16. BSA（Sigma-Aldrich，目录号：12133C）

17. 叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：71289）

18. 甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）

19. 皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036-250G-F）

20. R10 培养基（见配方）

21. FACS 缓冲液（见配方）

22. 固定缓冲液（见配方）

23. 烫发缓冲区（见食谱）

设备

1. 37°C 5% CO ₂加湿培养箱（Being Instrument）

2. Countess 3 自动细胞计数仪（Thermo Fisher Scientific）

3. LSR Fortessa 流式细胞仪 (BD Biosciences)

软件

1. FlowJo 软件（版本 10.6.1）

程序

A. 板材涂层

1. 用 DPBS 稀释抗 CD16 抗体，以达到 2 μg /mL 的最终浓度。每个样品使用100 μL 的 DPBS。（抗体按瓶上标明的浓度装瓶，通常在 2 mg/ mL和 3 mg/ mL之间。旧批次也可能以 1 mg/ mL装瓶。请联系 Biolegend 技术支持以了解浓度和总 µg 量，或使用带有批号的Biolegend 查找工具 ( https://www.biolegend.com/en-us/concentration-expiration-lookup )。）

2. 反转/短暂涡旋稀释的抗 CD16 抗体以充分混合并将它们转移到试剂库中。

3. 使用 200 μL多通道移液器将 100 μL稀释的抗 CD16 抗体分配到 96 孔 EIA 板的每个孔中（要填充的孔数取决于要刺激的 NK 细胞样本的数量）。用 DPBS 填充相同数量的井作为无刺激控制。

4. 用盖子盖住盘子，在37 °C 5% CO ₂加湿培养箱中孵育盘子 90 分钟。

5. 洗去未结合的抗体。首先使用喷洗瓶用 DPBS 填充孔，然后从盘子中倾倒液体，将盘子清洗两次。要倾倒液体，请从底部抓住盘子，拇指在一侧中间，手指在另一侧。将盘子放在水槽上方，将盘子倒置并迅速加速手臂和手向下。立即将盘子放在纸巾上以吸干盘子。

6. 如果 NK 细胞已准备好接种（通过程序 B 完成），请立即继续执行程序 C。确保涂有抗体的孔在任何给定步骤中干燥时间不超过 10 秒。如果 NK 细胞还没有准备好，用 100 μL DPBS 填充孔，盖上板并将其储存在 37°C 5% CO ₂加湿培养箱中，直到细胞准备好。

B. NK细胞制备

用于刺激的 NK 细胞可以在新鲜制备的 PBMC（新鲜 NK 细胞）中，也可以预先分离和扩增（扩增的 NK 细胞）。

对于新鲜的 NK 细胞：

1. 在机构审查委员会 (IRB) 批准后获取全血。

2. 根据样本总数，制备含有 R10 培养基、抗 CD107a-BV786 抗体和 BFA（v:v:v = 100:2:0.1）的主混合物。每个样品所需的总体积为 200 μL + 4 μL + 0.2 μL = 204.2 μL 。

3. 遵循任何 PBMC 分离方案分离 PBMC 样品，例如STEMCELL Technologies的EasySep ^TM直接PBMC 分离 ( https://www.stemcell.com/isolating-mononuclear-cells-from-whole-blood-by-density-gradient-离心.html )。

4. Countess 3 自动细胞计数器计算每个 PBMC 样本中的细胞数。

5. 从每个 PBMC 样本中，将 0.4 × 10 ^{6 个}细胞转移到 EP 管中。

6. 使用台式微量离心机在 150 ℃下离心沉淀 PBMC × g 5 分钟。

7. μL的主混合物在每个 EP 管中重新悬浮颗粒状的 0.4 × 10 ^{6 个细胞。}（BFA 具有细胞毒性，因此仅在程序 A 步骤 4 中接近 90 分钟潜伏期结束时进行步骤 7。不要收集超过 0.4 × 10 ^{6 个}细胞/EP 管。细胞将接种到涂有CD16 抗体。细胞过多会阻止细胞-抗体相互作用。）

对于扩增的 NK 细胞（显示了 FcRγ KO 细胞的示例，图 1）：

1. Countess 3 自动细胞计数器计算每个样本中的细胞数量。

2. 根据样本总数，制备含有 R10 培养基、抗CD107a-BV786 抗体和 BFA（v:v:v = 100:2:0.1）的主混合物。每个样品所需的总体积为200 μL + 4 μL + 0.2 μL = 204.2 μL 。

3. 从每个样品中，将 0.02 × 10 ^{6 个}细胞转移到 EP 管中。

4. 使用台式微量离心机在 800 ×下沉淀细胞 g 5 分钟。

5. 使用适量的 R10 培养基重悬细胞（此步骤会洗去 NK 细胞培养物中的刺激成分，并使细胞休息）。

6. 使用台式微量离心机在 150 ×下沉淀细胞 g 5 分钟。

7. 用 204.2 μL 预混液重悬每个 EP 管中沉淀的 0.02 × 10 ^{6 个细胞}。（BFA 具有细胞毒性，因此仅在程序 A 步骤 4 中的 90 分钟潜伏期结束时进行步骤 7）。

C. NK细胞刺激

1. 对于每个样品，将 100 μL 细胞接种到一个涂有抗 CD16 抗体的孔中，将另外 100 μL 细胞接种到一个涂有抗 CD16 抗体的孔中。

2. _{2加湿培养箱中}孵育细胞6-9 小时。

D. 流式细胞仪分析

1. 在收集细胞之前，准备表面染色鸡尾酒（需要避光）。使用以下指南制备预混液：对于每个要染色的样品，使用 50 μL FACS 缓冲液，其中包含 0.2 μL LIVE/DEAD ^TMFixable Far Red Dead Cell Stain、1 μL Anti-CD3-AF700、1 μL Anti-CD3-AF700 -CD14-APC/Cyanine7、1 μL 抗 CD19-APC/Cyanine7 和 1 μL 抗 CD56-PE/Cyanine7 抗体。（如果染色量不同，请使用制造商建议的浓度。）

2. 将盘子放在冰上以减缓细胞活动。

3. 将 100 μL 的冰冷 FACS 缓冲液添加到每个有细胞播种的井中。

4. 将细胞转移到 FACS 管中。多次上下移液，以确保所有细胞都离开板。

5. 350 ×离心沉淀细胞 g 5 分钟。

6. 短暂涡旋以驱散细胞。

7. 在每个细胞悬液中加入 54.2 μL 表面抗体混合物，并在冰上染色 30 分钟。

注意：从这一步开始保护细胞免受光照。

8. 用 3 mL 冰冷的 FACS 缓冲液以 350 ×洗涤细胞两次 g 5 分钟并弃去上清液。

9. 短暂涡旋以驱散细胞。

10. 用固定缓冲液（工作浓度：1% v/v 甲醛）在冰上固定细胞 30 分钟。

11. 中加入 3倍体积的冰冷 Perm 缓冲液来渗透细胞。

12. 将细胞置于冰上 30 分钟。

13. 准备细胞内染色鸡尾酒。使用以下指南准备主混合物：对于每个要染色的样品，使用 50 μL 的 Perm 缓冲液，其中含有 2.5 μL 的抗 IFN-γ-APC 和 2.5 μL 的抗 TNF-α-太平洋蓝抗体。（如果用不同的体积染色，请使用制造商建议的浓度。）

14. 用 3 mL 冰冷的 Perm 缓冲液以 600 ×洗涤细胞两次 g 5 分钟并弃去上清液。

15. 短暂涡旋以驱散细胞。

16. 在每个细胞悬浮液中加入 55 μL 的细胞内抗体混合物，并在 RT 处染色 30 分钟。

17. 用 3 mL 冰冷的 Perm 缓冲液以 600 ×洗涤细胞两次 g 5 分钟并弃去上清液。

18. 用 3 mL 冰冷的 FACS 缓冲液以 600 ×洗涤细胞一次 g 5 分钟并弃去上清液。

19. 通过 LSR Fortessa 流式细胞仪获取细胞。

20. 使用 FlowJo 软件分析数据。

数据分析

此处显示了一个刺激扩增 NK 细胞的示例（图 1 ）。首先扩增来自不同献血者的 NK 细胞，然后用靶向 FCER1G 的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白（FCER1G 编码 FcRγ）进行电穿孔。所得细胞是 FcRγ ⁺和 FcRγ ^-细胞的混合物。在用板结合的抗 CD16 抗体刺激期间，对细胞进行表面 CD107a（脱粒标记物）染色。刺激后，首先对细胞进行表面标记染色，然后对细胞内细胞因子（IFN-γ 和 TNF-α）进行染色。在使用 FlowJo 软件分析数据时，细胞由 FSC-A/SSC-A 选通以排除碎片，并由 FSC-H/FSC-A 选通以选择单个细胞。排除死细胞、CD3 ⁺T 细胞、CD19 ⁺B 细胞、CD14 ⁺单核细胞，而选择 CD56 ⁺NK 细胞进行细胞内细胞因子和脱粒标记分析。

图1 。扩增的 NK 细胞中 FCER1G（编码 FcRγ）的缺失导致 ADCC 增强（以细胞毒性细胞因子释放为例）。

AC ⁾等值线图显示来自没有 (-) 或有 (-) 或有⁽+) CD16 交联 (CXL)。数字代表产生指定细胞因子或展示 CD107a的 FcRγ ⁺或 FcRγ ^{-子集的相对百分比。}线形图显示了 FcRγ ⁺或 FcRγ ^–子集的相对百分比，这些子集产生指定的细胞因子或显示来自多个供体的 CD107a 以响应 CD16 CXL (n = 10)。由一条线连接的圆圈表示从同一供体样本中获得的数据。

食谱

1. R10 中型

补充有 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基 1640。

100 U/mL 青霉素-链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。

2. 流式细胞仪缓冲器

PBS 添加 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠。

3. 固定缓冲液

PBS 中添加了 4% 的甲醛。

4. 烫发缓冲区

PBS 补充有 1% BSA 和 0.1% 皂苷。

致谢

该协议改编自 Liu等人。（2020 年）。刘等人的工作。 (2020) 得到了 NIH 赠款 (AI110894) 的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

本协议中使用人体样本举例说明的研究得到了加州大学戴维斯分校机构审查委员会的批准。

参考

1. 奥尔德森，KL 和 Sondel，PM（2011 年）。 NK细胞通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性进行临床癌症治疗。 J Biomed Biotechnol 2011：379123。

2. Du, N.、Guo, F.、Wang, Y. 和 Cui, J. (2021)。 NK 细胞疗法：癌症治疗的新星。 癌症（巴塞尔） 13（16）。

3. Euchner, J.、Sprissler, J.、Cathomen, T.、Furst, D.、Schrezenmeier, H.、Debatin, KM、Schwarz, K. 和 Felgentreff, K. (2021)。由人类诱导的多能干细胞产生的自然杀伤细胞成熟至 CD56^明亮的CD16 ⁺NKp80 ^+/- 体外和表达 KIR2DL2/DL3 和 KIR3DL1 。前免疫12：640672。

4. Gong, Y.、Klein Wolterink, RGJ、Wang, J.、Bos, GMJ 和 Germeraad, WTV (2021)。用于癌症治疗的嵌合抗原受体自然杀伤 (CAR-NK) 细胞设计和工程。 J Hematol Oncol 14（1）：73。

5. Kohrt, HE, Colevas, AD, Houot, R., Weiskopf, K., Goldstein, MJ, Lund, P., Mueller, A., Sagiv-Barfi, I., Marabelle, A., Lira, R.等人_ （2014）。靶向 CD137 可增强西妥昔单抗的疗效。 临床投资杂志 124（6）：2668-2682。

6. Liu, W.、Scott, JM、Langguth, E.、Chang, H.、Park, PH 和 Kim, S. (2020)。 FcRgamma 基因编辑重新编程常规 NK 细胞以显示自适应人类 NK 细胞的关键特征。 iScience 23（11）：101709。

7. Vivier, E.、Raulet, DH、Moretta, A.、Caligiuri, MA、Zitvogel, L.、Lanier, LL、Yokoyama, WM 和 Ugolini, S. (2011)。先天免疫还是适应性免疫？自然杀伤细胞的例子。科学331（6013）：44-49。