材料和试剂

1×8 孔条带 96 孔板（Corning，目录号：9102）
奥林巴斯真空过滤系统，500 毫升，0.22 微米过滤器（Genesee Scientific，目录号：25-227）
各种玻璃瓶
各种移液器和吸头
量筒
标记的 Eppendorf 管
各种锥形管
溶液储液器（Fisher Scientific，目录号：07-200-130）
Immobilon-P 膜，PVDF，0.45 mm，26.5 cm × 3.75 m 卷（Millipore Sigma，目录号：IPVH00010）
Ocy454 细胞
胶原蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：C7661）涂层的 150 mm 培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：130183）
无菌 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）（Lonza，目录号：10-547F）
完全的 αMEM 培养基（Corning，目录号：10-022-CV），含有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素抗生素混合物
青霉素/链霉素溶液（Corning，目录号：30-002-CI）
0.25% 胰蛋白酶/EDTA（Corning，目录号：25-053-CI）
无菌 HBSS（Lonza，目录号：10-547F）
奥林巴斯真空过滤系统，500 ml（Genesee Scientific，目录号：25-227）
10× RIPA 缓冲液（EMD Millipore，目录号：20-188）
100×HALT蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Scientific，目录号：78440）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-500），10% MilliQ 水溶液
4× Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610747）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
Mini-PROTEAN TGX 预制凝胶（10% Tris/甘氨酸），具有各种孔数 (Bio-Rad)
10×Tris/甘氨酸/SDS罐缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610772）
甲醇（American Bio，目录号：AB01350-04000）
干脱脂牛奶
牛血清白蛋白（BSA）（Gemini Bio-Products，目录号：700-100P）
磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4（PBS）（Fisher Scientific，目录号：BP39920）
Tween-20（聚氧乙烯-20）（Bio Basic，目录号：TB0560）
抗硬化蛋白抗体（R&D Systems，目录号：AF1589）
抗过氧化物酶-AffiniPure 牛抗山羊 IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch，目录号：805-035-180）
SuperSignal West Femto 最大灵敏度化学发光底物（Thermo Scientific，目录号：34096）
TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596026）
MilliQ水
冰
1× 含钙的林格氏溶液（见配方）

NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）

KCl（Fisher Scientific，目录号：BP366）

MgSO 4 （Fisher Scientific：目录号：BP213）

HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP310）

蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）

NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S6014）

CaCl 2 （Fisher Scientific，目录号：BP510）

转移缓冲液（见配方）

Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP152）

甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）

SDS（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP166）

甲醇（American Bio，目录号：AB01350-04000）

1× RIPA/SDS/HALT 裂解缓冲液（见配方）

设备

3D 打印流体剪切应力提示（Lyons等人，2016 年，图 1）或其他 FSS 设备（在整个协议中称为 FSS 提示）
哈佛蠕动泵（Harvard Apparatus，目录号：P-230）
紫色/紫色 2 档 Tygon ® E-Lab 管，2.06 毫米（内径 0.081 英寸）（Harvard Apparatus，目录号：73-1860）
自动细胞计数器（Bio-Rad，目录号：1450102）或血细胞计数器（ThermoFisher Scientific，目录号：02-671-51B）
加热垫设置为 37°C（例如 KentScientific Corporation RightTemp ® Jr.）
台式烤箱设置为 37°C
费雪声波分离器
台式离心机
定时器
抽吸用真空泵

图 1. 用于诱导硬化蛋白降解的 FSS 尖端尺寸。

(A) 3D 打印 FSS 尖端的横截面切割。(B) 具有代表性的 3D 打印 FSS 尖端。(C) 装满有色水的 96 孔板的孔中的 FSS 尖端。请注意，尖端“裙边”与孔顶部齐平，孔中没有气泡。请注意，Ibidi Chambers 也复制了用该装置刺激的硬化蛋白降解（Lyons等人，2016 年）。

程序

用钙制备无菌过滤林格氏溶液（见食谱）。
1. 无菌林格氏液在 4°C 下储存直至使用，然后将其分装并加热至 37°C。

电镀Ocy454细胞
1. Ocy454 细胞保持在 33°C、5% CO 2的胶原涂层 150 mm 培养皿中，在完整的 αMEM 中以低于 50% 的汇合度维持硬化蛋白表达（图 2）。

可以将同一代细胞的多个平板混合在一起，以确保有足够的细胞用于实验，因为它们是在如此低的密度下培养的。

图 2. FSS 实验电镀前 Ocy454 培养融合度。

Ocy454 细胞应保持在 33°C、5% CO 2的完整 αMEM 中，在胶原蛋白涂层培养皿上以低于 50% 的汇合度维持硬化蛋白表达。接种 FSS 后，Ocy454 细胞在 37°C、5% CO 2下培养。比例尺 = 0.4 毫米。

吸出镀细胞的培养基。
用 10 ml HBSS 冲洗 Ocy454 细胞并吸出。
将 2 ml 胰蛋白酶/EDTA 溶液添加到 150 mm 培养皿中并旋转以覆盖培养皿。
吸出多余的胰蛋白酶/ETDA，让细胞在 37°C、5% CO 2下分离 5 分钟或更短时间，直到所有细胞都自由漂浮。
每 150 毫米培养皿添加 2 ml 完整的 αMEM 以中和胰蛋白酶/EDTA，收集细胞，并将细胞悬液转移到锥形管中。
1. 如果混合多个培养皿，请将所有细胞合并到一个锥形管中进行细胞计数，以获得均匀的细胞悬浮液，并防止因同一实验使用的不同细胞板而产生差异。
2. 由于细胞以如此低的密度接种，因此使用最少量的培养基/胰蛋白酶可使细胞更加浓缩，从而可以进行小体积接种。
使用细胞计数器或血细胞计数器对细胞进行计数。
以 125,000 个细胞/cm 2的密度（在 96 孔板中为 40,000 个细胞/孔）在总体积为 200μl/孔插入 1×8 孔条带 96 孔板中所需数量的孔中（示例板设置如图 5A 所示）。
在 37°C、5% CO 2下培养细胞过夜。

在 37°C、5% CO 2 条件下，更长的培养时间（许多实验室使用 14 天）会增加硬化蛋白的丰度（Spatz等，2015）。

准备 FSS 并校准蠕动泵

打开保温垫和烤箱，并将两者都设置为 37°C。
将适量的林格氏溶液分装到 50 毫升锥形管中，并将其加热至 37°C。
打开 FSS 泵，这将带您进入主屏幕（图 3）。

图 3.哈佛仪器泵上的运行屏幕。

在此屏幕中，您可以输入正在使用的管道类型，设置流速、时间和体积，转到运行屏幕，然后转到校准屏幕。

确保管道类型正确（建议使用来自哈佛仪器的紫色/紫色 2.06 毫米管道）并装入泵盒。
校准蠕动泵以确保流速正确（在连接 FSS 尖端之前完成校准）。
1. 用 MilliQ 水填充 50 毫升锥形管。
2. 将一个管子入口放入 50 毫升锥形管中，并用水填充整个管子（确保水从出口流出并且管子中没有大气泡）。
3. 将填充管的出口放入一个空的量筒中。
4. 按校准选择按钮进入校准屏幕（图 3）。
5. 在校准选项卡（图 4A-4C）下，启动泵（图 4A），让它运行一分钟，然后停止泵。

确保进水口停留在锥形水管内且水不会流出，或进水口停止进水。确保出口留在量筒中。

确定分配到量筒中的体积，按 Enter Volume Delivered 按钮（图 4B）使用键盘按钮输入分配的体积（图 4C），然后按绿色复选按钮。
校准周期完成后，泵现在将自动返回主屏幕。

图 4. 泵校准的工作流程。

(A) 校准屏幕。按绿色三角形“播放”按钮开始泵。分配的理论体积将随着泵的运行而增加。(B) 流动约 1 分钟后，按红色方形“停止”按钮停止泵。按“输入分配的体积”按钮。(C) 使用数字键盘，输入分配到量筒中的实际体积，然后按下绿色复选按钮。

泵上的设置现已重置。将泵上的流速设置为 35 毫升/分钟，并将流动时间设置为 1 分钟（图 3）。
将空量筒放回 50 毫升锥形水管中，并将出口管放回现在空的量筒中，并将入口放入锥形水管中。
在运行屏幕中，以 35 ml/min 的速度在量筒中运行一个完整的泵循环 1 分钟，以确保校准正确。
如果泵是 ± 从设定的速率中取出 2 ml，使用步骤 C5-C8 中描述的程序重新校准。
如果在 2 ml 误差范围内无法实现校准，则可能需要更换管道并润滑转子。
设置所需的流速（通常为 35 毫升/分钟）和流动时间（通常为 1-5 分钟）。

这些参数允许评估快速机械转导事件，例如 CaMKII 激活和硬化蛋白降解，如本文所述（Lyons等，2017；Williams等，2020；Gould等，2021）。

在每次流体剪切应力实验之前或在泵关闭时运行校准协议。

流体剪切应力
1. 准备足够体积的裂解缓冲液，以每孔使用 20-30 μl RIPA 裂解 96 孔板的适当数量的孔。
2. 从细胞培养箱中取出一条 Ocy454 细胞，放入 1×8 孔 96 孔板中，然后放入新的 96 孔架中（图 5A）。

这允许当前未处理或暴露于 FSS 的任何细胞保持停滞并处于完整的 αMEM 中。

将这条电池条移到 FSS 泵和台式烤箱附近的加热垫上。
1. 一旦细胞被移入林格氏，实验就可以在大气 CO 2 下进行。
2. 工作台设置应包含用于抽吸的真空泵、哈佛仪器泵、加热垫和烤箱，以便在细胞处于林格氏细胞时尽可能减少移动。
吸出 MEM 培养基并用温热的 Ringer 将每个孔填充到顶部（每个孔大约需要 350 μl）。
将架子放入 37°C 烤箱或将盘子放在台面上的加热垫上 15-20 分钟，让细胞在林格氏溶液中达到平衡，并确保通过更换林格氏溶液而激活的任何机械事件都可以重置（Donahue等等，2003）。
在这 15-20 分钟的等待时间内，将 FSS 尖端连接到泵管上，确保每个尖端的入口和出口处于正确的流动方向。

泵盒上有箭头指示流入和流出方向（图 5B）。

将温热的 Ringer's 倒入储液罐中。
将连接到油管的 FSS 尖端放入储液器中。

将它们放在两侧，入口朝上，并在它们放置的位置错开以帮助防止气泡循环（图 5C）。

用温热的林格溶液填充管组，确保从管中去除所有气泡。
1. 每管需要大约 3 毫升的林格液才能完全充满。
2. 根据需要启动和停止泵；您不需要运行一个完整的定时循环来填充管道和 FSS 吸头。
将 3D 尖端插入每隔一个孔中，因为如果 FSS 尖端重叠，则它们不会与板齐平（图 1C、5D）。事实上，这种方向允许相邻的井，没有 FSS 尖端，被用作时间/处理匹配无流量控制（图 5D）。

将 FSS 尖端直接向下推入井中。一旦 FSS 尖端在井中，不要摆动，因为这可能会引入气泡。确保 FSS 尖端的唇部与井的顶部齐平，并且井中没有气泡是安全的（图 1C）。

图 5. FSS 的 96 孔板和泵的设置。

(A) 将接种了 Ocy454 细胞的单个 1×8 条带移入新机架，以便转移到 FSS 的台式。在 FSS 之前，媒体被 Ringer's 取代。(B) FSS 尖端连接到油管，确保尖端上的长入口连接到泵的入口方向。(C) 要在放入 FSS 的井中之前用 Ringer's 填充油管和 FSS 尖端，请将它们放在 Ringer's 填充溶液储液器的一侧。这允许更少的气泡被吸入管中，并且更容易有效地填充管。(D) FSS 吸头放置在每隔一个孔中，这样它们就可以与每个孔的顶部齐平。没有 FSS 尖端的孔可以作为时间/处理匹配无流量控制。NF - 无流量控制，FSS - 很好地暴露于 FSS。

启动泵并应用 FSS。
在 FSS 结束并发生适当的后流孵育后 [例如，我们发现在 FSS 后，立即裂解或 10 分钟后裂解使我们能够评估 CaMKII 激活和/或硬化蛋白损失（Lyons等，2016 和 2017； Williams等人，2020 年；Gould等人，2021 年)]，从每口井中抽吸林格氏液，包括无流量井和 FSS 井。

如果等待裂解细胞，请移除 FSS 吸头，但不要吸出林格氏液，并在吸出林格氏液以进行裂解之前，将板平放在加热垫上并保持所需时间不动

要裂解细胞，请快速向每个孔中加入 20-30 μl 制备好的裂解缓冲液，然后将整个板置于冰上
对每个孔或每组混合孔使用新的移液器吸头，刮掉单层细胞以确保充分裂解，并将裂解物转移到标记的 Eppendorf 管中。

为了增加细胞裂解物的量以允许增加硬化蛋白丰度或增加多个蛋白质印迹的样品体积，可以将两个或更多细胞裂解物混合在一起。确保为每个无流量和 FSS 样本汇集相同数量的井。

丢弃使用过的 FSS Ringer 的解决方案。或者，这可以收集来分析分泌因子。

根据需要启动和停止泵以从管道中取出所有响铃。

根据需要对尽可能多的 1×8 条重复 FSS（D 部分）协议。

15-20 分钟的等待时间可以根据需要错开以提高时间效率。

收集所有样品后，可以对它们进行蛋白质印迹处理，以评估细胞反应。
在对最后一批细胞进行 FSS 后，从管道中取出所有 Ringer。通过运行 1 分钟的协议，用 MilliQ 水冲洗所有管道和 FSS 尖端，然后清空管道中的所有液体。

通过蛋白质印迹检测硬化蛋白降解
1. 在冰上使用探针超声仪对样品进行超声处理，在台式离心机中以 15,000 RPM 离心 2 分钟以沉淀细胞碎片，并在不同的管中收集上清液。
2. 添加4×Laemmli样品缓冲液+的足够体积 β巯基乙醇至1的最终浓度×。

将 100 μl β-巯基乙醇添加到 900 μl 4×Laemmli 样品缓冲液中，使最终浓度为 355 mM β-巯基乙醇。

将样品加热至 95°C 5 分钟并在冰上冷却，然后在 Tris/甘氨酸 SDS-PAGE 凝胶上运行。
使用半干法转移到 PVDF 膜上。
转移后，将膜完全干燥至少 2 小时或过夜。
在甲醇中重新润湿膜，用水冲洗以去除多余的甲醇，并在室温 (RT) 下在 5% 脱脂牛奶 + 3% BSA 中的 1× PBS + 0.1% Tween-20 中封闭 1 小时，同时振荡。

笔记：

检测硬化蛋白需要 5% 脱脂牛奶 + 3% BSA 的封闭溶液，因为仅脱脂牛奶是不够的。
对于检测其他目标，例如 CaMKII，1× PBS 中的 5% 牛奶 + 0.1% Tween-20 就足够了。

在 5% 脱脂牛奶 + 3% BSA 的 1× PBS + 0.1% Tween-20 中以 1:500 的比例使用 R&D System 硬化蛋白一抗，并在 4°C 下摇动过夜。
用 1× PBS + 0.1% Tween-20 在室温下振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。
在 5% 脱脂牛奶 + 3% BSA 在 1× PBS + 0.1% Tween-20 中以 1:1000 的比例与抗山羊 HRP 二次孵育，并在室温下在室温下摇动 1 小时。
用 1× PBS + 0.1% Tween-20 洗涤 3 次 5 分钟，并在室温下摇晃。
用水冲洗并使用 WestFemto ECL 试剂成像（图 6）。

图 6. FSS 诱导的硬化蛋白降解的代表性蛋白质印迹。

Ocy454 细胞以 35 毫升/分钟的速度暴露于 FSS 5 分钟，并在 FSS 结束后立即裂解。使用 R&D Systems 抗硬化蛋白抗体 (n = 2) 通过蛋白质印迹检测硬化蛋白丰度。

可能的实验调整
1. 逆转录聚合酶链反应

不要在 1× RIPA + 2% SDS + HALT 蛋白酶/磷酸酶抑制剂缓冲液中裂解，而是使用100 μl 冷 TRIzol 裂解细胞。然后，进行 RNA 分离、逆转录和 RT-qPCR 分析。

活细胞成像

电镀 Ocy454 细胞时，请使用光学透明的玻璃底 96 孔板。细胞可以用核染色剂、钙指示剂、活性氧指示剂等进行标记，然后可以在倒置的范围内进行 FSS，可以在游戏中时光倒流成像。这将允许监测活细胞反应。可以调整 FSS 速率和时间以优化所用指标的细胞反应。

分泌因子分析

在 FSS 之后，来自每个管道的流动缓冲液和来自无流动井的上清液可以收集在锥形管中，用于分析分泌因子。需要注意的重要一点是要考虑 FSS 油管和无流量井之间的体积差异。在分析协议中加入稀释因子以补偿不同的体积。

药物抑制剂治疗

为了确定某些信号蛋白或细胞反应的贡献，可以在 FSS 之前用药理学抑制剂处理细胞。如果处理时间超过 20 分钟，则在 5% CO 2和 37°C 的完全 MEM 中预处理细胞。然后，在治疗时间的最后 20 分钟，吸出药物介质，并用药物林格溶液完全填充孔。让细胞在 37°C 下平衡 20 分钟，然后按上述方法将 FSS 与药物林格氏液一起使用。加药林格氏液应用于 FSS 应用，以确保不会发生抑制作用的冲洗和逆转。

笔记

15-20 分钟的等待时间对于重现性至关重要。我们已经观察到轻微的运动会引起钙事件，从而导致最佳机械激活的不应期。先前已在培养的成骨细胞中报道了这种不应期（Donahue等，2003）。虽然 15-20 分钟足以重置观察硬化素降解所需的机械转导级联，但可能需要更改其他结果测量时间。FSS 速率、时间和 FSS 后裂解前的时间也可能需要针对特定结果进行优化。对于硬化素降解，5 分钟的 FSS 和长达 10 分钟的后流等待时间足以观察硬化素降解，尽管最佳 CaMKII 激活先于这个 10 分钟后流时间点（Gould等，2021）。通过蛋白质印迹法检测硬化蛋白需要 5% 牛奶和 3% BSA。通过比较来自野生型和全球性硬化蛋白敲除小鼠的皮质骨裂解物之间的条带模式，证实了电泳后硬化蛋白的预测分子量为 27 kDa（Williams等，2020）。

食谱

1 ×含钙的林格氏液
1. 在干净的玻璃瓶中，加入 400 毫升 MilliQ 水。
2. 称取以下试剂适量，加入玻璃瓶中，混匀。

140 毫米氯化钠

4 毫米氯化钾

1 mM 硫酸镁4

10 毫米 HEPES

10 mM 蔗糖

5 毫米碳酸氢钠3

1.8 毫米氯化钙2

使用 HCl 和 NaOH 将溶液的 pH 值调整到 7.2-7.4。使用尽可能少的量，以免显着改变离子浓度。
将总体积调整为 500 毫升。
使用 0.22 µm 无菌过滤器设置，对林格溶液进行无菌过滤。
在 4°C 下储存直至使用当天，然后在锥形管中将所需体积加热至 37°C。

确保原瓶中没有任何生长（即外观浑浊、瓶底有沉淀物）。

传输缓冲区

48 mM Tris 碱

39 mM 甘氨酸

0.04% SDS

20% 甲醇

用 MilliQ 水将总体积调节至 1 L

1× RIPA/SDS/HALT 裂解缓冲液
1. 首先，将 10 克 SDS 混合到 80 毫升 MilliQ 水中，制成 10% SDS 储备溶液。
2. 一旦溶解，用额外的 MilliQ 水将总体积调节至 100 毫升。
3. 要制备 1 ml 1× Lysis Buffer，一起稀释：

100 μl 10×RIPA 缓冲液

200 μl 10% SDS 溶液

700 微升 MilliQ 水

10 μl HALT 蛋白酶抑制剂混合物

涡旋溶液以充分混合；这将产生含有 1× RIPA、2% SDS 和 1× HALT 蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液。

致谢

这项工作得到了 NIH (AR071614, JPS 和 CWW; AR063631, JPS; AR071618, HL142290, CWW; GM008181 和 AR077974, NRG) 的资助。该协议（3D 打印的 FSS 提示、CaMKII 激活和硬化蛋白降解）源自之前的出版物（Lyons等人，2016 年，2017 年；Williams等人，2020 年；Gould等人，2021 年 [DOI：10.7554/eLife] .64393]）。

利益争夺

Joseph P Stains 拥有两项与这项工作相关的专利。一个用于这些实验的定制流体剪切装置（美国专利号 US 2017/0276666 A1）和第二个用于靶向微管（该机械转导通路的一部分）以改善骨量（美国专利号 US 2019/0351055 A1））。Ramzi J Khairallah 的秋水仙碱类似物治疗肌肉骨骼疾病的专利正在申请中 (PCT/US2018/038300)。Ramzi J. Khairallah 隶属于 Myologica, LLC。作者没有要申报的经济利益。Christopher W Ward 拥有两项与这项工作相关的专利。一个用于这些实验的定制流体剪切装置（美国专利号 US 2017/0276666 A1）和第二个用于靶向微管（该机械转导通路的一部分）以改善骨量（美国专利号 US 2019/0351055 A1））。另一项用于治疗肌肉骨骼疾病的秋水仙碱类似物专利正在申请中（PCT/US2018/038300）。其他作者声明不存在竞争利益。

参考

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