材料和试剂

1.5 ml Eppendorf 管安全锁（Eppendorf，目录号：0030120086）
15 ml Falcon 管（Dutscher，目录号：352095）
鼠笼（Animalab，目录号：031200260）
0.3 ml Terumo胰岛素注射器（Terumo，目录号：3BS30M2913）
注射器针规 27，L ½ 英寸（Sigma-Aldrich，目录号：Z192384）
手术刀（Fisher Scientific，目录号：3120032）
去纤维羊血（Alliance-bio-expertise，目录号：23689）
细菌琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5306）
Todd Hewitt 培养基（ThermoFisher，目录号：BD249240）
酵母提取物（ThermoFisher，目录号：210929）
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
OCT 冷冻嵌入基质（Fisher Scientific，目录号：23-730-625）
异戊烷（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1661）
多聚甲醛（默克，目录号：158127）
乙醇（默克，目录号：493511）
山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：G9023）
Triton X-100（默克，目录号：X100）
氯胺酮（默克，目录号：Y0000450）
甲苯噻嗪（默克，目录号：46995）
DAKO（DAKO，目录号：83023）
Trizol（Invitrogen，Life Technologies，目录号：15596026）

菌株：

野生型血清型 4肺炎链球菌TIGR4（ATCC，目录号：BAA-334 TM ）
C57/BL6 6-8 周龄雄性小鼠（查尔斯河）

抗体：

抗 PN 荚膜兔多克隆抗体（Statens Serum Institute，Copenhagen，Denmark）。
抗 GFAP 小鼠单克隆抗体（ThermoFisher，目录号：G3893）
AlexaFluor 563 偶联的异凝集素 IB4（ThermoFisher，目录号：A11029）
AlexaFluor 488 偶联山羊抗小鼠 IgG（Life Technologies，目录号：A11029）
AlexaFluor 555结合的山羊抗兔IgG（Life Technologies，目录号：A11034/A21429）
6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（ThermoFisher，目录号：D9542）
RNeasy Lipid Tissue 试剂盒（Qiagen，目录号：74804）
Superscript II逆转录酶试剂盒（ThermoFisher，目录号：18064014）
SYBR 绿色 PCR 主试剂盒（ThermoFisher，目录号：A46012）

设备

生物安全二级实验室
CO 2培养箱（三洋，型号：MCO-18AIC）
分光光度计（WPA、Biowave）
Eppendorf 离心机（Eppendorf，型号：5810）
Eppendorf 离心机（Eppendorf，型号：5424）
无菌罩（Telstar，Bio II A）
蠕动泵（Gilson，Minipuls Evolution）
4°C 冰箱（利勃海尔、Comfort）
Nanodrop（Thermo Scientific，型号：NanoDrop 2000）
PCR扩增仪灯（罗氏生命科学，型号：的LightCycler ® 480）
低温恒温器（Cryostar，型号：NX70）
TissueLyser II（Qiagen，型号：85300）
-80°C 冷冻机（三洋，型号：MDF-U53V）
配备有 Plan Apo Lambda 60 ×物镜 /1.40 NA 油的电动 XYZ 载物台（尼康，型号：Eclipse Ti）倒置荧光显微镜
配备横河 CSU-W1 扫描仪单元的旋转圆盘共聚焦显微镜 (Roper Scientific)，405 nm，100 mW —— 491 nm、150 mW – 561 nm、50 mW – 642 nm、25 mW 激光和 C-MOS 相机（Andor，ORCA-FlasH 4.0）

软件

斐济
微软Excel
变形金刚 7.7

程序

肺炎球菌培养

将 PN 血清型 4 野生型菌株 TIGR-4 从甘油原液中连到 THY 5% 血琼脂平板上。在 37°C的 10% CO 2培养箱中孵育 16-24 小时。
在 15 ml 无菌 Falcon 管中接种 2 ml THYE 预培养物，并带有一个单菌落。在 10% CO 2培养箱中无搅拌孵育 16 小时。
用 1:100 稀释的预培养物接种 5 ml THYE 培养物。在 10% CO 2培养箱中孵育，直到 0.2 < OD 600nm < 0.4。由于其能够进行群体感应依赖的自溶，因此生长 PN 培养物可能很棘手。特别是，生长前的滞后期可能持续时间不定，有时会持续数小时。然而，一旦细菌生长超过 OD 600nm > 0.15，倍增时间可能短至 15 分钟。此步骤的孵育时间会有所不同，但一般不应超过 4 小时。
将培养物在 21°C 下以 7,000 × g离心 5 分钟，然后弃去上清液。
将沉淀重悬在 5 ml 无菌 PBS 中。
通过读取 OD 600nm确定细菌密度。由于其能够进行群体感应依赖的自溶，因此生长 PN 培养物可能很棘手。特别是，生长前的滞后期可能持续时间不定，有时会持续数小时。然而，一旦细菌生长超过 OD 600nm > 0.15，倍增时间可能短至 15 分钟。
将培养物在 21°C 下以 7,000 × g离心 5 分钟，然后弃去上清液。
调整 PBS 体积以获得最终 OD = 1.0 ( ca. 2 × 10 8 CFUs/ml)。请注意，OD-CFU 对应关系可能因 PN 应变而异，可能需要凭经验确定。

小鼠 RO 注射和采样（图 1）

图 1. 小鼠 RO 注射后 PN 脑膜炎分析流程图。

主要步骤用数字表示并按顺序执行。除了步骤 7，所有其他步骤都在 P2 环境中执行。步骤 3-6 在层流无菌罩中进行。

如果小鼠不是在现场繁殖而是从外部供应商处交付，则在实验前让小鼠在当地动物设施中调整 3 天。实验当天，将在 P2 环境中进行操作的小鼠与其他小鼠隔离。这些措施是为了限制与动物压力相关的潜在变化。

用 100 µl 10% (vol:vol) 氯胺酮 (100 mg/ml) 和 2% 甲苯噻嗪的 PBS 腹腔注射麻醉 C57/BL6 小鼠。使用带有 27 号针头的结核菌素注射器进行注射。
用 50 µl (10 7 CFU) 的 PN 悬浮液在 RO 中注射小鼠。RO 注射的程序在参考资料（Yardeni等人，2011 年）中有详细描述，在线提供了许多教程视频（例如，https://www.research.psu.edu/animalresourceprogram/training/videos/retro-小鼠轨道注射）。简而言之，通过对眼睛背侧和腹侧的皮肤施加温和的压力，鼠标右眼球会轻微地过度收缩。可以加入一滴眼科麻醉剂，如 0.5% 盐酸丙对卡因，以防止眼睛干燥。为了限制对眼球的潜在损害，将针斜向下插入。缓慢注射和取出针头，以利于 RO 窦内细菌悬浮液的扩散。
在潜伏期将小鼠放回笼中。醒来后，小鼠通常很活跃，在感染后的头几个小时内几乎没有表现出任何症状。感染后 9 小时清楚地检测到立毛和活动减慢，24 小时后，即处死小鼠，然后用 70% 乙醇擦拭时，会出现虚脱和呼吸困难。
用针将鼠标爪子固定在板上。
切开隔膜上的皮肤。
切开隔膜以露出胸廓。在握住剑突的同时，切开胸廓两侧的肋骨。
首先对血液进行心脏采样以进行 CFU 测定 [图 1 (6)]。
用 20 毫升无菌 PBS 进行心内灌注，以洗去器官血管中受污染的血液。Wu等人详细描述了该过程。(2021)。
为此，切开右心房，让灌注的 PBS 流过。
将装有 PBS 的 22G 钝灌注针插入左心室，朝向主动脉。
使用蠕动泵在管道中流动 PBS，直到在 Luer 锁连接器的尖端可见一滴，以避免气泡。
将灌注针连接到 Luer 锁连接器。
以 2.5 毫升/分钟的速度流动 PBS 8-10 分钟。老鼠应该被放血。
用手术刀打开头骨，取出大脑。
预先称量空的无菌 Eppendorf 管。分离大脑半球，将每个半球转移到 Eppendorf 管中，并立即称重。计算半球的权重。
立即用于 CFU 测定。或者，快速冷冻 qRT-PCR 或用于脑切片免疫荧光标记的共聚焦显微镜分析的过程，如下所述。

CFU 计数（图 2）

图 2. PN 跨血脑屏障易位在感染的最初几个小时内发生在受控菌血症下。

C57/BL6 6-8 周龄小鼠通过 RO 窦静脉注射 10 7 PN 等效 CFU。在感染后的不同时间点处死小鼠。A.从脑和血液样本中测定 CFU。请注意，在感染后的前 13 小时内，菌血症保持不变（约10 5 CFU/ml），而脑 CFU 呈指数增长。B. qRT-PCR 分析来自大脑样本的总 RNA（每次测定 N > 3 只小鼠）。分别通过 ICAM-1 和 GFAP 的 mRNA 转录物评估的内皮和星形胶质细胞炎症显示在感染后 13 小时显着增加。

在 2 ml 无菌 PBS 中均质化大脑半球。
在 PBS 中对大脑匀浆进行 10 倍的连续稀释。方便地，通过在含有 90 µl PBS 的无菌 Eppendorf 管中连续转移 10 µl 匀浆来进行稀释。
在 THYE 血琼脂平板上加入 50 µls 的每种稀释液。
在 10% CO 2培养箱中于 37°C孵育 16-48 小时。
计算 CFUs 并标准化为稀释因子和大脑重量。

qRT-PCR (图 2)

半球要么立即处理，要么在液氮中快速冷冻并储存在 -80°C，直到对使用商业试剂盒（例如，RNeasy Lipid Tissue，Qiagen）提取的总 RNA 上的炎症标志物进行 qRT-PCR 处理。

在 1.5 ml Eppendorf 管中的 1 ml Trizol 中向半球添加玻璃珠。
使用 TissueLyser 设备均质化样品。
加入 200 µl 氯仿匀浆并在 21°C 下混合。
在 4°C 下以 14,000 × g离心15 分钟。
将 500 µl 上清液转移到新的 Eppendorf 管中，并加入 500 µl 70% 乙醇。
按照制造商的说明进行总 RNA 提取过程。使用 Nanodrop 装置确定在无 RNAse 水中洗脱的样品的 RNA 浓度。
使用逆转录试剂盒进行逆转录，并使用 SYBR Green PCR master Kit 进行定量 PCR，按照制造商的说明，使用 QuantiTect Primer 检测或以下 GFAP 引物：5'-GGGGCAAAAGCACCAAAGAAG-3' 和 5'-GGGACAACTTGTATTGTGAGCC -3'。结果通常表示为相对于 18S RNA 控制获得的值的比率（图 2）。

脑切片制备、免疫荧光染色和共聚焦荧光显微镜分析（图 3）

图 3. GFAP 标记的脑切片的共聚焦显微镜分析。

C57/BL6 6-8 周龄小鼠通过 RO 窦静脉注射 10 7 PN 等效 CFU。在感染后 6 小时切除大脑，并用低温恒温器切割 20 μm 厚的脑切片用于免疫荧光染色。A.共焦平面的代表性最大投影。箭头：PN 相关的 GFAP 碎片。绿色：PN胶囊；蓝色：GFAP；红色：异凝集素 IB-4；灰度级：核 DNA。B.右：左侧面板中显示的插图的更高放大倍数。虚线轮廓：对应于 PN 微菌落和囊状残余物 (PN-CS) 的区域，与 GFAP 细丝网络的碎片相关。右图：使用斐济的粒子分析插件（方法）检测 GFAP 片段。C. PN-CS (PN) 或控制区域 (CTRL) 中每 μm 2 GFAP 碎片的定量（N = 2，> 10,000 个碎片）。曼和惠特尼。*：P < 0.05。比例尺 = 5 μm。

在 OCT 中嵌入新鲜解剖的半球，在 -25°C 的异戊烷中冷冻，并在-80°C 下储存或切片。
在低温恒温器中执行冷冻半球的连续 20 μm 冠状切片。
将切片有序地铺在幻灯片上，以便跟踪相应的大脑区域。这些记录随后用于分析 BBB 的 PN 交叉是否发生在特定站点。
将脑切片固定在用 PBS 稀释的 4% 多聚甲醛中，21°C 下 15 分钟。所有后续步骤均在 21°C 下进行。
将样品在含有 0.25% Triton X-100 和 5% 新生山羊血清 (NGS) 的 PBS 中渗透 60 分钟，然后在 PBS 中洗涤 3 次。使用载玻片架可以同时将样品浸入连续的烧杯中，便于处理多个样品。
在以下稀释度下与一抗进行孵育：抗 GFAP (1:500)；抗 PN 胶囊 (1:300); AlexaFLuor 568-IB4 (1:100)，在含有 5% NGS 的 PBS 中，在潮湿室或染色盘中放置 60 分钟。通过毛细作用在最后一次洗涤后小心排出多余的 PBS，将载玻片与接触纸巾的载玻片边缘垂直放置，可以方便地最小化孵育体积。将载玻片正面朝上放置，并在每个脑切片上放置 20 µl 一抗溶液。将一片封口膜或 13 毫米直径的盖玻片放在液滴的顶部，以使抗体分布在切片上并限制蒸发。
去除封口膜或盖玻片。
在 PBS 中清洗样品 3 次。
使用 Alexa 共轭二抗、1:200 稀释使用的鬼笔环肽和 100 使用的 DAPI 进行孵育 μg/ml 最终浓度在潮湿室或染色托盘中保持 60 分钟。
在 PBS 中清洗样品 3 次。
在每个切片上方添加 20 µl DAKO 荧光封固剂，并放置一个 13 毫米直径的盖玻片。
让 DAKO 在黑暗中聚合至少 30 分钟。样品应在黑暗中稳定保存数周。
使用配备 60 倍油浸物镜、CSU1-W1 旋转圆盘共焦头和由 Metamorph 7.7 软件控制的 ORCA Flash 4.0 CMOS 相机的 Eclipse Ti 倒置显微镜分析样品。该相机的大芯片 (2,048 pxl × 2,048 pxl) 能够实现脑切片的大区域的可视化，有助于在早期时间点分析罕见的事件，例如跨 BBB 的 PN 易位。例如，在感染后 6 小时，我们在 100 个 60x 目标视野中的大约 1 个视野中检测到大脑皮层中的 PN 易位。

图像采集

抗 PN 囊染色提供了清晰的对比，能够明确检测脑切片中的细菌（图 3）。然而，这种明确的检测需要对切片进行 3D 分析，因此需要采集覆盖脑切片 20 µm 宽度的 Z 平面。由于采集过程的延长和与重复样本照明相关的潜在漂白，当分析多个荧光团时，该过程可能变得具有挑战性；因此，对于所有的定量收购，都应特别注意基本的注意事项。我们不会在这里讨论能够对相邻场进行 3D 采集的自动化程序，当可编程电动显微镜载物台可用时，可以有利地应用这些程序。

为了限制焦平面的过采样，并且由于 PN 大致对应于 1 µm 直径的球菌，400 nm 的平面间距可确保沿切片宽度进行细菌检测。
需要根据经验为每个荧光团确定采集参数。由于在分析给定样品期间无法更改采集参数，因此应针对每个荧光团确定它们并在开始大规模采集之前进行固定。理想情况下，对最暗和最亮的物体进行初步样品分析，以设置最佳曝光时间，同时防止饱和。
当荧光强度受到限制时，倾向于增加曝光时间而不是激光功率，以帮助限制光漂白。应首先对强度定量敏感的荧光团进行采集。
为每个荧光团设置激光功率和曝光时间后，继续获取相邻平面。对于 C-MOS 相机，平均强度荧光信号的通常曝光时间范围在 200 到 400 毫秒之间。如果为四种不同的荧光团采集了 50 个焦平面，则每个场的采集可能需要 2-4 分钟。

图像分析

在我们的分析中，我们关注 PN 跨脑实质血管的易位及其对星形胶质细胞原纤维酸性蛋白 (GFAP) 中间丝网络的影响。具体而言，分析的参数是 PN 簇与血管的关联以及与易位 PN 簇相关的 GFAP 的碎片。对于这些参数，虽然注意保留荧光以检测染色结构，但不执行荧光强度的量化。在将获取的 Z 堆栈转换为 2D 图像最大投影时，这些注意事项很重要。GFAP 染色显示典型的丝状网络，对应于星形胶质细胞过程。在接触细菌的过程水平上观察到 GFAP 细丝的碎片（图 3A，箭头）。对于较大的 PN 簇，在细菌簇的远处附近也观察到 GFAP 碎裂。因此，我们量化了与 PN 簇相关的区域中 PN 诱导的 GFAP 碎片，这些区域由荚膜脱落染色（图 3B，虚线区域）划定。

对 ImageJ 中的所有荧光团执行堆栈的最大投影。在“图像”菜单中，选择“堆栈”，然后选择“Z 投影”，然后选择“最大投影”。
通过调整每个荧光团的亮度/对比度显示来组合相应的图像。如图 3A 所示，在感染后 6 小时，可以清楚地检测到 PN 簇从脑血管中挤出到脑物质中。对于在感染后 6 小时和 13 小时检测到的所有 PN 簇，建立了与用异凝集素 IB-4 标记的血管 100% 的关联（图 3）。
GFAP 通道图像转换为 8 位图像。
通过设置阈值来执行图像的二值掩码。这样做时，请注意重叠结构与检测到的 GFAP 片段忠实匹配（图 3）。
使用 PN 荚膜染色通道来划定与荚膜脱落相对应的区域。
将此区域转移到GFAP通道对应的图像上。
使用以下参数运行粒子分析斐济插件：粒径 > 0.05 µm 2和圆形指数 > 0.9。
将检测到的 GFAP 片段的数量标准化为该区域。
用非参数检验评估动物组之间的统计差异。

致谢

这项工作部分由 ANR 项目 CALPLYCX 资助（资助号：ANR-20-CE15-0001）。

该协议改编自Bello等人。(2020)。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

此处报告的实验和技术符合法国动物实验机构和药物、毒理学、化学和环境研究所动物伦理委员会（巴黎笛卡尔大学，协议 86-23）的伦理规则。

参考

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