材料和试剂

60 mm培养皿（Corning Life Sciences，目录号：08757100B）
单刃超锋利刀片（电子显微镜科学，目录号：71962）
50 ml Falcon锥形管（Corning，目录号：352070）
15 ml Falcon锥形管（Corning，目录号：430790）
MACS SmartStrainers 30 µm（Miltenyi Biotec，目录号：130-098-458）
40 µm 无菌细胞过滤器（Corning，目录号：07-201-430）
迷你 20 µm 细胞过滤器（pluriStrainer，目录号：43-10020-50）
微型载玻片（康宁，目录号：2940-75x25）
盖玻片（Thermo Scientific，目录号：12450S）
Eppendorf 微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-402-25）
移液器吸头 [Rainin RT LTS，目录号：30389226（10 µl）、30389240（200 µl）、30389213（1,000 µl）、30389218（1,000 µl 宽孔口）]
CelLytic TM PN 分离/提取缓冲液4x （Sigma-Alrich，目录号：CELLYTPN1）用无 DNAse 的水稀释，以达到 1x 的最终工作浓度。我们将此稀释的缓冲液命名为“NIB 培养基”。
无核酸酶水（Invitrogen，目录号：AM9937）
不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CV）
牛血清白蛋白 50 mg/ml（BSA；Invitrogen，目录号：AM2616）
7-AAD（eBioscience，目录号：00-6993-50）
SYTOX Green 核酸染色剂（Invitrogen，目录号：S7020）
Triton X-100（Sigma，目录号：T8787-100ml）
细胞核缓冲液 20×（10× Genomics，目录号：2000207；Chromium Next GEM Single Cell ATAC Library Kit v1.1，PN-1000163/4 的一部分）
台盼蓝染色 0.4%（Invitrogen，目录号：T10282）
1% BSA-PBS（见食谱）
补充有 2% Triton X-100 的 NIB 培养基（见配方）
1% BSA-PBS 补充 2% Triton X-100（见食谱）

设备

解剖钳，细尖（VWR，目录号：82027-386）
Countess 细胞计数室载玻片（Invitrogen，目录号：C10228）
BD FACSAria II 细胞分选仪（BD Biosciences, San Jose, CA）
微量移液器（Rainin，型号：Lite – XLS、P1000、P200、P20）
平台摇杆（Fisherbrand，目录号：13-687-704）
Sorvall Legend X1R Centrifuge with Swinging Bucket Rotor（Thermo Scientific，目录号：75004261）
Countess II 自动细胞计数器（Invitrogen，目录号：AMQAX1000）

程序

在收集植物样品前 30 分钟，将所有材料和试剂冷却至 4°C（即培养皿、刀片、尖端、试管、细胞过滤器）。在整个过程中将样品和分离的细胞核保持在 4°C，以降低应力水平并最大限度地提高核膜的完整性，这一点至关重要。最终，核膜完整性的降低会在文库构建过程中产生更高的细胞核爆裂率、更低的细胞核回收率以及每个细胞核 sNucATAC-seq DNA 片段的产量下降。

植物细胞核的分离

收集 100 至 1,000 毫克的新鲜植物样品，并将其放入装有 500 微升预冷 NIB 培养基的 60 毫米培养皿中。

注意：该测定在连续光照下在 MS 培养基上生长 7 天的 1 g 拟南芥根以及在 B&D 培养基上在黑暗中生长 6 天的大豆根上成功进行了测试（有关生长条件的更多详细信息，请参见 Pingault 等人。 , 2018)。

用刀片将 NIB 介质中的植物组织切碎约 30 秒。
用预冷的 NIB 培养基覆盖切碎的植物组织以保持样品湿润（平均而言，1 g 切碎的植物组织需要 1 ml NIB 培养基）。但是，避免使用过多体积的 NIB 介质，因为它会使样品难以切碎。
将植物组织再切碎 4 分钟（即，因此，切碎的样品应该很容易使用 1 ml 宽口径吸头移取）
将 40 μm 过滤器放在倾斜在冰上的 50 ml 锥形管的顶部。用 500 μl 预冷的 NIB 培养基预先润湿。这个体积也将作为核锥形管底部的垫子。
使用 1 ml 大口径吸头，将细胞核-NIB 培养基混合物轻轻转移到滤网顶部。
在 60mm 培养皿中加入 1 ml 预冷的 NIB 以清洗并收集剩余的细胞核。用 1 ml 宽口径吸头轻轻地将这个体积转移到 40 μm 过滤器上。

细胞核的纯化

当处理直径小于 30 µm 的植物细胞核（例如，拟南芥根核）时，请使用选项 1。如果细胞核直径大于 30 µm，请使用选项 2。强烈建议这些额外的纯化步骤去除在开始构建 sNucATAC-seq 文库之前，先处理大型碎片。在油基微珠形成过程中，碎片可能会堵塞微流体系统，阻止乳液相并导致文库部分或完全丢失。

选项 1：无荧光活化核分选 (FANS) 纯化

如步骤 A5 所述，准备另一个 50 ml 锥形管，但使用 30 μm 过滤器。
使用 1ml 大口径吸头，将步骤 A7 中过滤后的细胞核-NIB 培养基混合物轻轻转移到 30 μm 过滤器上。
在显微镜下进行第一次细胞核质量检查；检查是否被碎片污染（图 2）：

轻轻旋转含有细胞核混合物的 50 ml 锥形管，并将其中的 10 μl 移液到微量载玻片上。
添加最终浓度为 0.5 μM 的 SYTOX Green DNA 染色。用盖玻片盖住微型载玻片。
使用荧光显微镜，寻找细胞碎片对细胞核悬浮液的潜在污染。要去除剩余的碎片，请使用另一个 30 μm 或在可能的情况下使用 20 μm 过滤器过滤细胞核重悬液，如选项 1 中所述—— 步骤 1 和 2。

在验证分离的细胞核的质量和纯度后，继续执行步骤 C. 细胞核的透化。

图 2. 使用 20 µm 细胞过滤器纯化前 (A) 和纯化后 (B) 的植物细胞核显微图片（物镜 40 倍）。

细胞核用 SYTOX Green 染色。白色箭头表示超过 40 μm 的碎片可能会堵塞微流体系统。比例尺：100 μ米。

选项 2：FANS 选择

设置细胞分选器。

使用 100 µm 喷嘴和 20 psi 的默认系统压力，以最大限度地减少分选过程中对原子核的物理应力。
在分拣前和分拣过程中，将样品室和收集室冷却至 4°C。

转移和分类 200 µl 未染色的细胞核，以建立细胞核分类的基线。
为了对植物细胞核进行分类，将 DNA 嵌入剂 7-AAD 以 v/v 1/40 的比例添加到细胞核悬浮液中（即每 1 毫升细胞核混合物中加入 25 μl 7-AAD 原液）。分选前在冰上孵育至少 30 分钟。

注意：迄今为止，7-AAD 是唯一一种经 10x Genomics 验证可进行 sNucATAC-seq 实验的染料。根据 10x Genomics，与其他 DNA 染色染料相比，7-ADD 不会干扰 Tn5 转座酶的活性 ( https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360027640311-Can- I-sort-nuclei-for-Single-Cell-ATAC-sequencing-or-Single-Cell-Multiome-ATAC-GEX-）。

使用 BD FACSAria II 细胞分选仪（BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞；图 3）或具有类似光谱特性的细胞分选仪对样品进行分类。
1. 用 561 nm 激光器激发 7-AAD 信号，用 635 长通 (LP) 滤波器和 660/20 带通 (BP) 滤波器的组合检测其发射。
2. 在前向散射与侧向散射（FSC 与 SSC）上显示和选通初始信号，以去除不需要的非核事件和碎片。随后，在 7-AAD 高度（7-AAD – H）与 7-AAD 宽度（7-AAD – W）图上显示数据，以去除额外的污染物（图 3A-3B）。
3. 将 7-AAD 染色的细胞核与自发荧光细胞器区分开来可能很困难。使用显示 7-AAD 与相邻荧光（即488 nm 激发激光和 600LP 和 610/20BP 滤光片组）的双变量图，我们能够更好地区分样品的 7-AAD 阳性核部分（图3C) 与细胞器 (图 3D)。在这种配置中，核分数稍微远离细胞器（图 3C 与 3D），允许染色的细胞核被门控和分类。图 3E 提供了使用此策略排序的核的 DNA 含量分布的示例。

图 3. 使用 BD FACSAria II 细胞分选仪分离细胞核的门控策略。

A. 前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 用于可视化初级粒子簇。B. 使用 7-AAD 面积 (W) 与高度 (H) 来选择单线态。C 和 D. 显示 7-AAD 和相邻荧光参数 (AFP) 的图，以更好地区分染色细胞核 (C) 与自发荧光细胞器 (D)。E. 直方图显示分选核的 DNA 含量。每个图中的数字（A 到 D）代表每个步骤所选粒子/原子核（黑框）的百分比。

在含有 1 ml 预冷 1% BSA-PBS 的 15 ml 锥形管中收集分选的细胞核。
为了确认收集到的细胞核的纯度，在 SYTOX Green 染色（最终浓度为 5 nM）后对样品的等分试样进行分类。Sytox Green 荧光用 488 nm 激光激发，并用 505 LP 和 530/30 BP 滤光片组收集。
在 4°C 下以 500 × g离心 7-AAD 分选的细胞核10 分钟。
弃去上清液，用 150 μl 1% BSA-PBS 轻轻重悬细胞核沉淀。

细胞核的透化

将 NIB 培养基（如果使用步骤 B.选项 1）或 1% BSA-PBS（如果使用程序 B.选项 2）并辅以 2% Triton X-100 到细胞核悬浮液中，以达到最终的 Triton X-100 浓度为 0.5 %（例如，每 1.5 ml NIB 过滤核悬浮液添加 0.5 ml NIB 培养基 + 2% Triton X-100 或每 150 μl 1% 的 50 μl 1% BSA-PBS + 2% Triton X-100 BSA-PBS 分选核悬浮液）。
在 4°C（平台摇杆的速度 2）下轻轻摇动拟南芥5 分钟（Farmer等，2021）。

注意：Triton X-100 的浓度和孵育时间可能因植物样品和物种而异。此步骤允许 Tn5 转座酶渗透到细胞核中。然而，过度暴露于 Triton X-100 可能会导致微流体系统中的细胞核爆裂。要测试细胞核的完整性，请按照选项 1 步骤 3 中的描述对分离的细胞核的子集进行显微观察。我们建议在实施 sNucATAC-seq 实验之前验证样品的透化条件。

离心机细胞核8分钟，在500 ×克和4℃下沉淀拟南芥核，并在500 5分钟×克和4 ℃将大豆核压成颗粒（时间和速度可能因植物种类和核大小而异）。丢弃上清液。
用 4 ml 1% BSA-PBS 清洗沉淀。通过旋转非常轻柔地重新悬浮细胞核颗粒。
如步骤 C3 所述离心细胞核悬浮液。丢弃上清液。
用 20 μl 10x Genomics 提供的 1x 细胞核缓冲液重悬细胞核沉淀。体积可以根据细胞核浓度进行调整，以满足 10x Genomics 的要求（即，每个样品使用的最大体积限制为最大 5 μl，细胞核浓度介于 155 和 7,700 个细胞核/μl 之间，以达到恢复 500 到 10,000 个原子核，等待用户选择）。

核浓度估计
1. 将 9 μl 细胞核悬浮液（来自步骤 C6）转移到新的 Eppendorf 管中。
2. 加入 1 µl 0.4% 台盼蓝并轻轻混合。
3. 在细胞计数室幻灯片中加载整个染色细胞核体积。
4. 选择大小在 2 到 30 µm 之间的台盼蓝阳性细胞核 ( https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/BID/manuals/MAN0014293_Countess_II_Automated_Cell_Counter_UG.pdf )。

注意：寻找任何团块。细胞核可能在 10× Genomics 1× 细胞核缓冲液中形成聚集体。结块的细胞核可以通过温和的旋转分离。

估计核密度。理想情况下，此密度应介于 500 至 1,500 个核/微升之间。
按照 10x Genomics 协议并使用 Chromium Next GEM Single Cell ATAC Library & Gel Bead Kit (PN-1000175/6)、Chromium Next GEM Chip H Single Cell Kit (PN-1000161/ 2），单指数套件N，设置A（PN-1000212），和铬控制器（4分之1000202）（https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/2NEwsG0Yu3RuxvtQiWXZo3/1e939394fa43a4f0bd88d79383833b16/CG000209_Chromium_NextGEM_SingleCell_ATAC_ReagentKits_v1.1_UserGuide_RevE.pdf） .

数据分析

合成 sNucATAC-seq 文库后，必须使用安捷伦生物分析仪或类似技术评估克隆片段的概况。根据植物种类的不同，染色质片段的轮廓可能会发生变化，如图 4 所示。最近发表了使用本手稿中描述的方法处理的 sNucATAC-seq 数据集示例（Farmer等人，2021 年）。

图 4. A.拟南芥和 B. 大豆在标记和 scATAC-seq 文库构建后克隆的 DNA 片段的代表性配置文件。

这些概况说明了植物物种之间核小体周期性的差异。这些配置文件是使用高灵敏度 DNA 试剂盒和 Agilent 2100 生物分析仪生成的。

食谱

1% BSA-PBS

将 200 µl BSA（原液浓度：50mg/ml）加入 800 µl PBS。

含 2% Triton X-100 的 NIB 培养基

将 20 µl Triton X-100 添加到 980 µl NIB 培养基 1 次。

缓慢吸取 Triton X-100，因为它非常粘稠。

1% BSA-PBS 补充 2% Triton X-100

将 20 µl Triton X-100 添加到 980 µl 1% PBS-BSA。

缓慢吸取 Triton X-100，因为它非常粘稠。

致谢

这项工作得到了美国国家科学基金会 (IOS# 1339194 和 1854326 )、植物科学创新中心以及内布拉斯加大学林肯分校农学和园艺系的支持。该协议改编自之前的工作（Thibivilliers等，2020）。

利益争夺

作者没有竞争利益。

参考

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