材料和试剂

使用超纯、无核酸酶水和分析级试剂制备所有缓冲液和溶液。

至少用 0.2 µm 过滤器过滤一次，并在 4°C 或 -20°C 下储存。始终使用无核酸酶管和棉花过滤器技巧。

1.黑色底板【黑色底板96孔，聚丙烯，平底（烟囱孔）】是减少背景和串扰以及吸收光的荧光分析所必需的（Greiner Bio-One，目录号：655209。）

2.链霉亲和素（Pierce，目录号：PIER21122）链霉亲和素 (SA) 对生物素三甘醇 (BITEG) 具有很强的亲和力。寡核苷酸与添加 2 μl 后，3'、5' 或两端的这种修饰不受核酸酶活性的影响(0.02 mg/ml) 链霉亲和素加入到反应混合物中。在超纯水中制备 1 mg/ml。

3.寡核苷酸订购冻干的未改性 HPLC 纯化的寡核苷酸底物和生物素或 BITEG改良的 HPLC 纯化寡核苷酸（集成 DNA 技术）。将它们稀释1 倍用于 DNA 底物的退火缓冲液 (Sigma-Aldrich)（100 μM 原液）和 siMAX TM稀释缓冲液(Eurofins; 30 mM HEPES, 100 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , pH = 7.3) 适用于所有 RNA 底物。

注意：可以在合成的寡核苷酸中订购修饰的 DNA 或 RNA 碱基。我们这样做了过去成功地测量碱基修饰对酶促功能的影响。

我们文库中的寡核苷酸是针对二级结构进行设计和优化的形成使用这'预测一种中学结构网络服务器'

( https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html )。

基本的80bp序列如下：

向前：

GATGGTTTGTTGGTCTATTACTACTTGGAGCTTGTATGATTCGAAACCTTGGAGTACTTGCC

TACTTGGAGTGAACTTAG

逆转：

CTAAGTTCACTCCAAGTAGGCAAGTACTCCAAGGTTTCGAATCATACAAGCTCCAAGTAGT

AATAGACCAACAAACCATC

对于设计所有类型的文库寡聚体，基本寡核苷酸序列可以是从两端缩短或分裂成两个分子以在双链 DNA 中产生间隙或切口。可以交换单个核苷酸以添加错配、底物偏好等（图 1 和图 2）。

图 1. 对于校准曲线，提供了两个示例集，有和没有链霉亲和素阻断末端。这些需要与用于检测的 DNA 底物相匹配。实验

图 2. 一组 80 聚体寡核苷酸底物

4.核酸酶使用已知活性的商业核酸酶对方法进行校准，并且优选以与待测酶的预测活性相似的机制起作用。例如，要测试从双链 DNA 中去除 5' 单核苷酸，请使用核酸外切酶 T7（T7，新英格兰生物实验室，目录号：M0263S）。对于作用于 3' 到 5' 的核酸酶，使用核酸外切酶 III（ExoIII，Thermo Scientific，目录号：EN0191）（图 3）。

图 3. 核酸酶处理后从 dsDNA 中释放 PG 的方案 (ExoIII)

5. 1 M Tris，pH 7.5-8.0（ThermoScientific，目录号：15567027）

6. 5 M NaCl，无RNase（ThermoScientific，目录号：AM9759）

7. 0.5 M EDTA pH 8.0（ThermoScientific，目录号：15575020）

8. 10× Tango Buffer（ThermoScientific，目录号：BY5）

9. CutSmart（新英格兰生物实验室，目录号：B7204S）

10.甘油（ThermoScientific，目录号：15514011）

11. Quant-iT TM PicoGreen TM dsDNA 检测试剂盒（Invitrogen，目录号：P7589）

12. Quant-iT TM microRNA 检测试剂盒（Invitrogen，目录号：Q33140）

13.退火缓冲液组合物（1×）（见配方）

14.存储缓冲区（见食谱）

15.反应缓冲液（见配方）

16.二价阳离子（见配方）

17. PG 缓冲液（见配方）

18.核酸染料（见配方）

设备

1. 读板机（Tecan 或 BMG）

选择合适的测量参数（温度、波长、闪光次数、和稳定时间）用于您的检测。将酶标仪预热至酶活性的最佳温度（通常为37°C）。要减慢反应速度，请设置较低的温度（例如20°C）。使用波长483-15 nm 用于激发（483 nm 是中间激发峰，带宽为 15 nm；即激发范围为 475-490 nm）和 530-30 nm 的发射（530 nm 是中间发射峰值带宽为 30 nm；即，发射范围为 515-545 nm）。增加数量每孔闪烁直到空白孔的噪音没有进一步改善或直到测量每口井的时间变得不可接受。根据酶的不同，每 45- 读取一次样品每次读取前摇晃 60 秒，持续 15 分钟至 2 小时。样品中发生的光漂白导致荧光信号随着时间。因此，在每个实验中与样品同时运行控制曲线测量这种效果。由于完全光漂白，较长的读数可能不准确PicoGreen 到背景的水平。

我们测试了无限 M Plex (TECAN) 和CLARIOstar (BMG Labtech) 读板机。这核酸酶检测也可以在 qPCR 阅读器中进行，但我们发现酶标仪提供一致的结果并提供更多选项，例如在读取前摇动板。

虽然关于每孔读数的最佳实践因每种酶而异，但一般而言，读取的最佳持续时间约为 1 小时。如果使用 CLARIOstar，请考虑整个时间需要逐个读取整个板，对于整个板大约需要 48 秒。所以，每个孔只能每 50 秒读取一次。如果读板器允许，请尝试使用双向逐行阅读，并按相同顺序添加酶。

程序

A. 板准备

在冰上准备板并保护样品免受光照。对于每个反应，准备混合物和运行三次以获得最佳准确度。使用多通道移液器可加快设置反应板，但也可能导致孔中出现气泡。离心板以去除它们。始终标记板以帮助移取底物和反应混合物并清除任何空井。如果使用胶带标记行和列，请在装入盘子之前将其撕下读者。花时间计划实验并提前计算体积。每孔反应混合物：

10 µl 寡核苷酸 500 nM

10 微升反应缓冲液

25 µl ddH 2 O（如果是 SA，则为 23 µl）

2 µl 链霉亲和素（用于生物素化寡核苷酸）

50微升PG

5微升酶

注意：对于 RNA 反应，可以遵循类似的程序，用 RNA 染料代替 PG。

1. 在热循环仪或加热块中对互补寡核苷酸进行退火，然后使用摩尔比 1:1。一种。在 PCR 管中混合等体积的等摩尔寡核苷酸 (每个 100 µM)。湾在 95°C 下孵育 5 分钟。

C。关闭加热块，让样品缓慢冷却或使用热循环仪（每 30 秒降低 1°C）。

d. 将退火双链体保持在 -20°C 以进行长期储存。

e. 将退火的寡核苷酸稀释到 500 nM。

F。每个反应/孔使用 10 µl (50 nM)。

例如，要退火包含缺口的寡核苷酸双链体，退火三个寡核苷酸各使用 2.5 µl，并添加 2.5 µl 退火缓冲液。的浓度最终产物为 25 µM。

笔记：

一种。使用适合酶的反应缓冲液。广泛的活动缓冲区，像 10 × CutSmart (New England Biolabs, B7204S) 或 10 × Tango (ThermoScientific,BY5），可以方便数据分析（不需要额外的控制），并与许多酶。进行试验实验以测试不同反应的有效性缓冲以获得最佳结果。湾使用无核酸酶的水。

2. 记住为 BIOTEG 或生物素化寡核苷酸添加 2 µl 链霉亲和素。孵化为在跷跷板摇床上冰上 15 分钟以增强结合。

3. 将 PicoGreen 试剂 (PG) 添加到保护板避光的每个孔中。尝试快速工作并用盖子/铝箔覆盖已经补充了 PG 的行/列。

4. 将指定的酶（或储存缓冲液作为阴性对照）添加到每个孔中。从现在开始在室温下在工作台上工作，以避免酶沉淀的风险。

在 5 µl 中制备所需数量的酶单位/浓度。带上一整盒过滤嘴并在吸头盒和板的相应位置使用，以避免移液错误。这个这样，如果板上的位置丢失，尖端盒可以定位加工。各加 5 µl好吧，尽量不要产生任何可能影响荧光读数的气泡。反应开始现在，所以快速工作，以便能够捕捉到预热板中反应的最初几分钟读者。记住要保护盘子免受光照。

笔记：一种。避免使用多道移液器，因为它们往往会向孔中添加气泡，并且较少加入正确量的酶是一致的。湾 将板短暂离心以除去气泡。对于速效酶，这可能不会由于酶促反应可能在此期间已经开始，因此是可取的。

C。尝试滴定酶。如果溶液中存在过多的酶，则反应

速度非常快，导致反应早期读取的数据丢失。

B. 实验设计

带有 T7 和 ExoIII 核酸外切酶测试实验的平板。样品制备于复制。还包括校准控制曲线，如图 4 所示。

图 4. 用于测试实验的板方案。A. A1-6 行包含阴性对照两种测试的核酸外切酶的寡聚体。生物素修饰-之间的正确结合添加到混合物中的寡核苷酸和链霉亲和素可保护 3' 和 5' 末端不被消化。All4block 表示寡核苷酸上的所有四个末端都被生物素-链霉亲和素结合阻断。B.第 B1-6 行包含在 12bp 到 3' 末端（这是ExoIII 作用于 3' 到 5' 方向的底物）。T7 只能消化 12bp 的短片段导致最后一个核苷酸被生物素-链霉亲和素阻断。C. C1-6 行包含接近 3bp 间隙的寡核苷酸，从 12bp 到 5' 末端（这是 T7 的底物）作用于 5' 到 3' 方向的外切核酸酶）。ExoIII 只能消化 12bp 的短片段导致最后一个核苷酸被生物素-链霉亲和素阻断。D. D1-6 行包含在 5' 上具有 15bp 突出端的寡核苷酸。E. E1-6 行含有 15bp 的寡核苷酸悬垂在 3'。在第 1 列和第 2 列中，将来自 ExoIII（或 T7）的存储缓冲液添加到样品中。第 3 和第 4 列：每孔 ExoIII 5U。第 5 和第 6 列：每孔 T7 5U。A7 和 A8：80mer_3block（具有两个 3' 末端的 80 聚体被阻断的寡核苷酸）。B7 和 B8：40mer_3block（40mers 的寡核苷酸）3' 端都被封闭）。C7 和 C8：ssDNA，80bp 单株 DNA，作为完全对照消化的双链寡聚体，实验的荧光最小值。

数据分析

1.从具有不同标称长度的寡核苷酸创建校准线：80、40 和0（单股）。获取作为时间函数的寡核苷酸读数，可能每个标称长度两个或三个重复。接下来，在每个时间点，计算线性标称长度 (80, 40, 0) 和原始荧光读数之间的关系。其结果，将控制信号与控制标称相关联的斜率和截距的时间演变得到长度。

2.将相同寡核苷酸的数据读数与适当的阴性对照分组，这必须与测试样品非常相似。它可以不含酶，或者最好是被测酶的非活性形式。DNA 80-寡聚体，它不是酶的底物，即., 80 mer_all4block，也可以是阴性对照。在零时间点，原始读数所有井都应该是相似的。

3.通过划分reads，修正光漂白和背景reads的影响样本的平均读数来自阴性对照孔。

4.使用校准线的斜率和截距，将校正后的荧光单位转换为每次都指向双链 DNA 的长度。见补充材料（带测试的 Excel 文件实验和计算）用于数据输入和计算的模板。

5.结果应反映低聚物的长度，其中 80mer 为最大尺寸，单ssDNA 显示总溶解双链体。乙OTH核酸酶从文库五个不同的低聚物进行测试。80mer-all4block 双链体不是任何测试核酸酶的底物（无切口酶活动）。因此，我们在计算中使用 80mer-all4block 作为阴性对照。复式不能在测定过程中，因为通道被降解安格斯在荧光只发生因PG 试剂的光漂白。

一种。ExoIII 活性核酸酶测定ExoIII 具有3' 到 5' 脱氧核糖核酸酶活性，从3'端。它对 80 mer-3block-5′-15 bp_overhang 和 80mer-all4block- 有效3bpgap-3'。80mer-all4block-3bpgap-5' 在距离寡聚体 5' 端 12bp 处有一个缺口。这荧光信号的降低反映了 ExoIII 从3'-端从间隙开始。与 80mer-3block-3'- 相比，较低的 80mer_all4block 对照荧光信号15bp_overhang 确认 PG 试剂仅插入双链 DNA而不是与作为寡核苷酸一部分而不是 ExoIII 底物的 ssDNA 悬垂。与 ExoIII 的反应很快开始，在这个实验中，底物低聚物为ExoIII 在时间点 0 分别注册为 60bp 和 50bp 片段（图 5A）。湾 T7活性核酸酶测定具有 5' 到 3' 活性的 T7 核酸外切酶非持续性地水解寡聚体80mer-3block-3'-15bp 和 80mer-all4block-3bpgap-5' 上的游离 5'-末端。T7还可以从 80 mer-all4block-3bpgap-5' 间隙的 5' 端去除几个 bp（图 5B）。

图 5.核酸酶活性结果的样本。A. ExoIII 核酸酶活性，每孔 5U。B.T7 核酸酶活性，每孔 5U。来自 ExoIII 核酸外切酶测试实验的图表和 T7 核酸外切酶。分别提供每种酶的数据。80bp 寡聚体和 ssDNA 显示在图表上。x 轴表示以秒为单位的时间。y 轴表示碱基对中的 DNA 寡核苷酸长度。

总结：本协议中总结的核酸酶检测是一个功能强大且简单的工具包，可用于分析与 DNA/RNA 相关的酶的活性。应用广泛，测试简单准备、负担得起的试剂和易于使用的设备使其成为实施的好方法在每个分子生物学实验室。我们还假设该测定可用于各种变化通过非核酸酶活性测量核酸代谢。

食谱

1. 退火缓冲液组成（1×）

制备 100 µM 寡核苷酸库存（从 IDT [idtdna.com] 订购）

10 mM Tris，pH 7.5-8.0

50 毫米氯化钠

1 mM EDTA pH 8.0

2. 存储缓冲区

为对照孔（不含任何酶）和

稀释酶。不要添加甘油。

- 对于 ExoIII 酶：50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、50 mM KCl、1 mM DTT（使用前添加新鲜）。

- 对于 T7 酶：10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 mM EDTA、10 mM DTT（使用前添加新鲜的）。

注意：这些储存缓冲液因特定酶和制造商而异

生产它。它们通常由制造商在购买特定酶时提供。

3. 反应缓冲液

使用建议使用随核酸酶一起提供的反应缓冲液。对于未知的偏好测试过的核酸酶，尝试使用范围广泛的活性缓冲液，即10× Tango Buffer 和 10× CutSmart。

- ExoIII 的 10× 反应缓冲液：660 mM Tris-HCl（pH 8.0，30°C），6.6 mM MgCl2。

- 10 × 反应缓冲液 T7：10 × NEBuffer 4 (B7004S)：500 mM 醋酸钾，200 mM Tris

醋酸盐，100 mM 醋酸镁，10 mM DTT，pH 7.9，25°C。

注意：由于反应缓冲液可以产生很大的不同，研究每种酶的最佳缓冲液

仔细并使用最适合被测试的特定酶的酶。

4. 二价阳离子

需要时用 MgCl 2或 MnCl 2补充反应缓冲液。在第一个实验中使用两者；有关优选阳离子的信息可以稍后确定。

5、PG缓冲液

含 v/v 甘油的 TE 缓冲液，用于稀释 PG 试剂

10 mM Tris-HCl

1 mM EDTA，pH 7.5

40% 甘油

6. 核酸染料

DNA 染料：来自 Quant-iT TM PicoGreen TM dsDNA Assay Kit的 PicoGreen (PG) 试剂是

使用前立即制备（生产商推荐），通过 1:200 稀释

含 v/v 甘油的 TE 缓冲液中的 PG。

PG试剂在-20°C长期保存；解冻时，打开前擦去水分

管。光和湿气都会损害 PG 试剂。我们通常将 PG 等分并

冷冻，每管 5 µl（使用前加入 1 ml PG 缓冲液），置于避光盒中。

注（RNA 染料）：对于 RNase 检测，来自 Quant-iT TM microRNA 检测试剂盒的染料通过将 microRNA 试剂 A 稀释到缓冲液 B 中以 1/2,000 稀释来制备，详见在协议中。

致谢

RC 实验室由 BBSRC (BB/N017773/2)、SNF (CRSK-3_190550)、Rosetrees Trust 资助Fund (M713) 和 UZH 研究优先计划（URPP-转化癌症研究）。这个协议改编自 Sheppard等人的出版物。(2019)。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1. Bartosova, Z. 和 Krejci, L. (2014)。同源重组中的核酸酶作为癌症靶点治疗。F EBS Lett 588(15): 2446-2456。

2. Mozaffari, NL, Pagliarulo, F. 和 Sartori, AA (2021)。人类 CtIP：DNA 中的“双重代理”修复和肿瘤发生。 精细胞开发生物学113：47-56。

3. Paull, TT 和 Deshpande, RA (2014)。Mre11/Rad50/Nbs1 复合体：最近对催化活性和 ATP 驱动的构象变化。Exp Cell Res 329(1): 139-147。

4. Rigby, RE 和 Rehwinkel, J. (2015)。抗病毒免疫和自身免疫中的 RNA 降解。趋势免疫学36（3）：179-188。

5. Sheppard, EC, Morrish, RB, Dillon, MJ, Leyland, R. 和 Chahwan, R. (2018)。表观基因组学介导抗体成熟的修饰。前免疫学9：355。

6. Sheppard, EC, Rogers, S., Harmer, NJ 和 Chahwan, R. (2019)。通用荧光-基于工具包，用于实时定量 DNA 和 RNA 核酸酶活性。科学报告9(1): 8853。