材料和试剂

注：可使用等效材料和试剂。
将 cDNA 克隆到 GST/His 表达载体（pALS099 或 pALS343）
化学感受态大肠杆菌克隆株（例如，DH5 α ，Invitrogen公司，目录号：18265017或等同物）
高保真DNA聚合酶（例如，Q5 ，New England Biolabs ，目录号：M0491S ；Phusion ，New England Biolabs ，目录号：M0530S）
凝胶纯化试剂盒（例如，GeneAid ，目录号：DFH300）
目标 cDNA 或 cDNA 克隆的模板
选择克隆方法的试剂：
（ø ption 1）试剂为吉布森组件克隆：
质粒pALS343（pGEX-2TP-cTevHis-Gibson/MCS；Addgene ，目录号：139788）
FastDigest Pdi I限制酶（Fisher Scientific ，目录号：FD1524）
FastDigest Kpn I限制酶（Fisher Scientific ，目录号：FD0524）
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs ，目录号：E2621）或自制的 Gibson assembly master mix （Gibson et al. ，2009）
（Ô ption 2）试剂用于Gateway TM克隆
质粒 pALS099（pGEX-2TP-cTevHis-DEST ；Addgene ，目录号：139787）
Gateway TM供体载体（非氨苄青霉素抗性；例如，pDONR221，Fisher Scientific ，目录号：12536017）
LR Clonase TM II 酶混合物（Invitrogen ，目录号：11791-020）

表达标记蛋白
带密封盖的 Nalgene PPCO 离心瓶（500 毫升；Fisher Scientific，目录号：3141-0500或等效物，与可用转子匹配 - 参见设备）
0.22 μm 过滤瓶，500 ml（Fisher Scientific，目录号：09-741-05）
0.22 μm 过滤器单元，50 ml（Millipore Sigma ，目录号：SCGP00525）
上面克隆的表达质粒
化学感受态大肠杆菌蛋白表达菌株，例如，BL21（DE3）pLysS中（Invitrogen公司LSC606010）或C41（DE3）pLysS中（Novagen公司60444-1）（见注）
含有 100 μg/ml 氨苄青霉素和表达菌株所需的其他抗生素的LB 琼脂平板
脱水 2 × YT 培养基（Fisher Scientific，BD Difco TM ，目录号：DF0440-17-0）
葡萄糖（Sigma-Aldrich ，目录号：G7021）
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，MW 238.3 g/mol）（Calbiochem ，目录号：420322）
20% (w/v) 葡萄糖（见食谱）
2 × YTG 培养基（见配方）
0.5 M IPTG（见配方）

纯化标记蛋白
上面的细胞沉淀
Nalgene Oak Ridge 型圆底离心管（Fisher Scientific ，目录号：3114-0050或等效物，与可用转子匹配- 见设备）
空的小色谱柱（例如，Bio- R ad Biospin 色谱柱，目录号：732-6008）
谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B (Cytiva -原GE生命科学，目录号：17075601）（小号在4撕℃下）
GST标记的断前蛋白酶（Cytiva -原GE生命科学，目录号：27084301）（小号撕毁在-20 ℃下）
TALON金属亲和树脂（钴琼脂糖6B-CL ，宝酒，目录号：635501）（小号撕4 ℃下）
Fast Macro DispoDialyzer，截止值 > 10kDa（Harvard Apparatus ，目录号：74-0802）
NaCl（Sigma-Aldrich ，目录号：S3014）
KCl（Sigma-Aldrich ，目录号：P9541）
Tween-20（Sigma-Aldrich ，目录号：P9416）
Triton X-100（Sigma-Aldrich ，目录号：T8787）
苯甲磺酰氟（PMSF）（罗氏，目录号：10837091001）
完整TM迷你无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂（罗氏公司，目录号：4693159001）（小号在4撕℃下）
NaH 2 PO 4 （119.98 g/mol）（Sigma-Aldrich ，目录号：S0751）
Na 2 HPO 4 （141.96 g/mol）（Sigma-Aldrich ，目录号：S7907）
咪唑（68.08 g/mol）（Sigma-Aldrich ，目录号：I5513）
37％盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich ，目录号：258148）
1 M HEPES-NaOH pH 7.5（Tekno ，目录号：H1035）
0.5 M EDTA pH 8.0（Invitrogen ，目录号：LS15575020）
2-巯基乙醇（2-ME）（14.3 M）（Sigma-Aldrich公司，目录号：M3148）（小号撕4 ℃下）
1 M DTT 溶液（Sigma-Aldrich ，目录号：43816）（等分并储存在 -20 °C 下）
甘油（Sigma-Aldrich ，目录号：G5516）
SDS-PAGE试剂（可使用自制凝胶或其他供应商替代）：
4 × Laemmli 蛋白质样品缓冲液（Bio-Rad ，目录号：161-0747）
预制蛋白质凝胶（例如，适合您蛋白质的Bio-Rad Mini-PROTEAN ® TGX TM ）
10 × Tris-甘氨酸-SDS运行缓冲液（Bio-Rad ，目录号：161-0732）
Precision Plus Protein Dual Xtra Prestained Protein Standards（Bio- R ad ，目录号：161-0377）
考马斯亮蓝 R-250（Fisher Scientific ，目录号：BP101）
蛋白质定量试剂（例如，Bradford 测定法；Bio- R ad ，目录号：500-0006）
库存解决方案（见配方）
5 M 氯化钠
2M氯化钾
10% (v/v) 海卫 X-100
10% (v/v) Tween-20
100 毫米 PMSF
1 M NaH 2 PO 4
0.5 M Na 2 HPO 4
100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 8.0
( 5 × 还原型谷胱甘肽缓冲液– 可选 – 仅在从 GSH-琼脂糖凝胶洗脱而不是从 GST 裂解时才需要)
3 M 咪唑 pH ~7.5
5 ×裂解缓冲液
缓冲液（见配方）
1 ×裂解缓冲液
GST高盐洗涤缓冲液
GST低盐洗涤缓冲液
PreScission 蛋白酶缓冲液
Talon 结合/洗涤缓冲液
Talon 洗脱缓冲液
透析缓冲液
（Tris 预洗脱缓冲液 – 可选 – 仅在从 GSH-琼脂糖凝胶中洗脱而不是从 GST 上洗脱时才需要）
（谷胱甘肽洗脱缓冲液——可选——仅当从 GSH-sepharose 中洗脱蛋白质而不是从 GST 上裂解时才需要）
考马斯染色液
考马斯脱色液

组蛋白肽阵列检测
塑料食品包装纸
放射自显影尺（Diversified Biotech ARS-150，Sigma-Aldrich ，目录号：R8133）
薄膜（Carestream ® BioMax ® XAR Film ，目录号：1651454 ；Sigma-Aldrich ，目录号：F5513）
胶片盒（例如，Cytiva -以前的 GE Life Sciences，目录号：GERPN11649）
改性TM组蛋白肽阵列（Active Motif的，目录号：13001）（小号撕毁在-20 ℃下）
容器孵育1英寸× 3英寸载玻片阵列（例如，用于印迹条小塑料盒- Genhunter B123，B130 Genhunter，Nunc公司267061 ，或滑动杂交腔室）
纯化的目标蛋白（在 -80 °C 下储存的等分试样）
抗-His（C-末端）-HRP（Invitrogen公司，目录号：R931-25）（小号撕4 ℃下）
10 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Scientific ，目录号：BP399-1）
脱脂奶粉（EMD Millipore ，目录号：115363）
BOVIN ë血清白蛋白（BSA; Sigma-Aldrich公司，目录号：A7906）
增强的化学发光试剂（ECL）（例如，西闪电PLUS-ECL型，Perkin-Elmer公司NEL103E001EA）（小号撕4 ℃下）（见注）
缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液 (PBS-T)
阻塞缓冲区
预结合缓冲液
肽阵列结合缓冲液

设备

注：可使用等效设备。
Sonicator（例如，Branson Sonifier 250/450，具有适当的尖端尺寸）或类似的超声波匀浆器，或者用于细胞裂解的 French Press
冷藏高-与转子速度离心4000-7000 ×克为500ml瓶中并20000 ×克为Oakridge的30-50毫升的管（例如，贝克曼阿凡提-JE与JA-10和JA-25.50转子;或SORVALL RC-6使用 SLA-3000 和 SS-34 转子）
冷冻式低速离心机（例如，如上或带有摆斗转子 SX4750 的 Beckman Allegra X-14R）
冷冻离心（例如，的Eppendorf 5424R，或离心在寒冷的房间）
摇床培养箱（例如，New Brunswick TM I24，如果需要低感应温度，则带有冷藏 (I24R) –例如，16-18 °C ）
冷藏室(4 °C )或玻璃门冰箱
平台摇床（例如，VWR ，型号：3500 Standard Shaker，目录号：89032-092）
End-over-end管旋转器/烤肉架（例如，Fisher Scientific ，目录号：11676341）
磁力搅拌板（例如，Fisher Scientific ，目录号：1152016S）
垂直电泳系统，用于SDS-PAGE和Western印迹（例如，生物- [R广告的Mini-PROTEAN四细胞1658000）
分光光度计（OD 600和 OD 595用于蛋白质测定）
膜显影剂和暗室（或替代的检测方法，例如，一个生物ř广告Chemidoc 12003153）
扫描仪（例如，Epson Perfection V850 Pro）

软件

阵列分析软件（Active Motif，https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.zip)

程序

将 cDNA 克隆到表达载体中
为了最大化产生可溶的，稳定的机会，和活性蛋白，可取的是测试几个构建体，包括全长蛋白质及其片段截断的基于预测的结构域或二级结构的边界（Graslund等人，2008）。组蛋白修饰结合域构建体经常成功地用于组蛋白肽结合分析。然而，全长蛋白质的结合特征可能与分离的结构域略有不同。
提供了两个质粒用于双重亲和纯化。使用 Gibson 组装 (a) 或 Gateway TM克隆 (b)选择合适的质粒进行克隆。要启用双重标记，cDNA 不应具有起始或终止密码子：
使用 Gibson Assembly（也可以使用标准限制酶克隆）将感兴趣的 cDNA 克隆到质粒 pALS343（pGEX-2TP-cTevHis-Gibson/MCS；Addgene ，目录号：139788）中：
用Pdi I和Kpn I消化质粒。使用标准试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化片段。
设计如下所示的引物（图 1），其中 N 是与目标 cDNA 同源的 21-24 个碱基。在 FOR 引物中，确保您的序列与 AAA AAA (KK) 密码子在读框内。在 REV 引物中，确保您的序列与Kpn I 位点内的 TAC（Y，有义链）在读框内。为了保留Kpn I 位点，插入片段的最终密码子必须以 G 结尾。示例引物如下所示。

图1的方案pALS343矢量插入位点和用于克隆的引物序列。A. pALS343 (pGEX-2TP-cTevHis-Gibson/MCS) 的克隆插入位点，并显示了关键特征。B.指示阅读框和限制性位点的示例引物。N代表~18-24个模板特异性序列的碱基。

使用高保真聚合酶（PCR-扩增目标cDNA例如，Q5或的Phusion聚合酶）。使用标准试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化片段。
结合凝胶纯化消化的质粒，并用NEBuilder高保真DNA装配主混合物，孵育凝胶纯化PCR扩增子，并变换感受态细胞（例如，DH5 α）根据制造商的方案。
通过 Sanger 测序筛选菌落并确认插入片段的阅读框和完整序列。
或者，使用 Gateway TM克隆将感兴趣的 cDNA 克隆到目标载体 pALS099（pGEX-2TP-cTevHis-DEST；Addgene #139787）中：
设计引物以放大由att B 位点两侧的 cDNA ，如图所示（图 2），其中 N 是与目标 cDNA 同源的 21-24 个碱基。在 FOR 引物中，确保您的序列与 AAA AAA (KK) 密码子在读框内。插入片段的第一个密码子必须以 T 开头。在 REV 引物中，确保您的序列在指定的框架内。插入的最后一个密码子是 NAC（在有义方向上）。

图2 。用于为 Gateway TM克隆扩增att B 侧翼插入片段的示例引物。N代表模板特异性序列的~18-24个碱基。

使用高保真聚合酶（PCR-扩增目标cDNA例如，Q5或的Phusion聚合酶）。使用标准试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化片段。
根据制造商的协议，创建一个入口克隆，然后使用连续的 BP Clonase TM和 LR Clonase TM步骤创建一个表达克隆。或者，在1步反应（梁等人，2013），结合凝胶纯化ATT B-侧翼PCR扩增子与目的载体，供体载体，和LR克隆酶TM 。转化感受细胞（例如，DH5 α）根据制造商的方案。
通过 Sanger 测序筛选菌落并确认插入片段的阅读框和完整序列。

表达标记蛋白
第 I 部分. 测试诱导和溶解度的先导表达
在进行更大规模的生长之前，请按照本节所述测试诱导条件和蛋白质的溶解度。平行处理已知表达良好且可溶的蛋白质（例如，来自空 pALS343 载体的 GST-His）作为阳性对照。

第 1 天。将表达质粒转化为大肠杆菌表达菌株
为第二天准备无菌 2 × YTG 培养基、无菌玻璃器皿和 5 ×裂解缓冲液（参见食谱）。
变换E.大肠杆菌根据制造商的说明用表达质粒小量制备DNA BL21（DE3）pLysS中。[注1]，但按比例缩小了一半。
在含有100 μg/ml 氨苄青霉素和 34 μg/ml 氯霉素的LB 琼脂平板上平板。
在 37 °C 下孵育过夜。

第 2-3 天。培养大肠杆菌，诱导表达，收获细胞沉淀
在清晨，将单个菌落挑选到 3 ml含100 μg/ml 氨苄青霉素和 34 μg/ml 氯霉素（2 × YTG/Amp/Cam）的 2 × YTG 的起始培养物中[注 2] 。
在 37 °C 下剧烈摇晃（~250-300 RPM）生长~4小时，或直到培养物明显混浊。
要测试三种诱导条件，请准备一个装有 150 ml 2 × YTG/Amp/Cam [注 3]的无菌锥形瓶。通气时，确保烧瓶为培养物体积的4倍。
将起始培养物 1:50 稀释到 150 ml 培养物中。
在 37 °C 下剧烈摇晃生长，直到 OD 600达到 0.6-0.8。
在冰上的 1.5 ml 管中保存 0.5 ml 等分试样。
这将是 SDS-PAGE 分析的“非诱导”对照。
将此样品暂时放在冰上。
准备好后，通过在 4 °C的微量离心机中以最大速度离心 1分钟来沉淀细胞。去除上清液。在-20 °C 下冷冻颗粒，直到准备好处理 SDS 页。
为了诱导表达，添加 IPTG 至终浓度为 0.5 mM [注 4] 。
将培养物混合并分成三个无菌锥形烧瓶，每个烧瓶 40 毫升。
测试几个感应温度和持续时间。建议的条件是：
30 °C 4-5小时。
37 °C 3小时。
14-16 °C过夜（需要冷藏摇床）。
在每次诱导结束时，取出 0.5 ml 培养物。
这些将是“诱导”样本。将样品暂时放在冰上。
准备好后，通过在 4 °C的微量离心机中以最大速度离心 1 分钟来沉淀细胞。去除上清液。在-20 °C 下冷冻颗粒，直到准备好处理 SDS 页。
将剩余的 40 ml 培养物转移到离心管中。离心可以在一次性锥形管低速离心机来完成（3 ，000 ×克15分钟，在4 ℃下在SX4750转子）或高-速离心机中的Oakridge型管（6 ，000 ×克10分钟在 4 °C ）。
丢弃上清液。
继续在-20制备溶胞产物或冷冻粒料℃，或-80 ℃，对于较长-长期储存。

第2-3天继续。大号YSE大肠杆菌和单独的可溶性和不溶性级分
注意：将样品始终保持在 4 °C或冰上。
重悬细胞沉淀于1/40第1个体积（1ml）中的×裂解缓冲液含有还原剂和蛋白酶抑制剂（见配方）[注5]。
转移到冰上的 1.5 ml 管中。
在冰水浴中用管子进行超声处理。
带微尖端的 Branson 250/450 的建议起点。针对您的系统进行优化。
确保尖端完全浸没但不接触管壁：
设置输出= 4. 5和占空比= 50% 。
脉冲 12 次。在冰上休息 30 秒。
重复（12 个脉冲，休息 30 秒）最多 8 次。监测样品——裂解后，样品的不透明性会稍微降低，颜色会稍微变深。这对于对照蛋白质（例如 GST-His）来说应该是显而易见的。裂解也可以通过一段时间以小份监测。离心这些等分试样以除去不溶性物质，并确定总蛋白质浓度（例如，使用Bradford蛋白测定）。确定浓度何时达到平台期。
通过在 70% 乙醇中冲洗和短暂的超声处理来清洁尖端。
将两个 60 μl 等分试样放入新管中，以准备用于 SDS-PAGE 分析的“整体”和“颗粒”样品。
将“整个”裂解物 60 μl 等分放在冰上用于 SDS-PAGE 分析（不要离心）。
将大部分超声裂解液和“颗粒”等分试样在 4 °C 下以 ~20,000 × g离心30 分钟。
对于用于 SDS-PAGE 分析的 60 μl 'Pellet' 等分试样 - 取出并丢弃上清液。在裂解缓冲液或 PBS 中重悬沉淀至 60 μl的最终体积。
对于大部分超声裂解液 - 将上清液转移到新管中并丢弃沉淀。
取 60 μl 上清液到新管中——这是用于 SDS-PAGE 分析的“可溶性”样品。
冻结剩余的上清液在-20 ℃下或-80 ℃下较长-长期储存。如果需要，该上清液可用于小规模测试纯化。

第2-3天继续。在 SDS-PAGE 上分析样品
根据需要准备 SDS-PAGE 凝胶（或使用预制凝胶）来解析您感兴趣的融合蛋白。
根据需要用2-ME准备一份 4 × Laemmli 样品缓冲液（每 900 μl 4 ×样品缓冲液添加 100 μl 2-ME ）。
“未诱导”和“诱导样本”：
解冻颗粒。
添加 1 ×裂解缓冲液或 PBS，使体积达到 50 μl 。移液器或涡旋重悬。
添加 16.7 μl 4 × Laemmli 样品缓冲液和2-ME 。
在 95 °C 下加热5 分钟，间歇性涡旋。再重复 5 分钟。
在微量离心机（最大速度）中旋转 5 分钟，然后将上清液转移到新管中。
样品已准备好加载到 SDS-PAGE 凝胶上（加载 20-25 μl ）。
“整个”，“小球”和“可溶的”样品（60微升）：
添加 20 μl 4 × Laemmli 样品缓冲液和2-ME 。
在 95 °C 下加热5 分钟。
在微量离心机中旋转 5 分钟（最大速度）。
样品已准备好加载到 SDS-PAGE 凝胶上（加载 20-25 μl ）。
运行 SDS-PAGE 并进行考马斯染色。请注意，“整体”/“颗粒”/“可溶性”样品已浓缩 40 倍，而“诱导”/“未诱导”样品已浓缩 10 倍。
分析 – 检查染色凝胶中是否存在与您感兴趣的融合蛋白近似正确分子量的诱导依赖性条带。
如果没有明显的预期大小的诱导条带，重复 SDS-PAGE 并使用Anti-His(C-term)-HRP 偶联抗体进行蛋白质印迹。由于它对 C 端 6 × His 标签具有特异性，因此该抗体在检测大肠杆菌全细胞裂解物样品中的融合蛋白方面表现良好。
评估可溶性融合蛋白的比例，并为更大的制剂选择最佳条件。请注意，对于组蛋白肽阵列实验而言，适度水平的表达和溶解度可能就足够了，这通常可以用数十μg的蛋白质来实现（参见下面的图 3）。

（考马斯图3.来自代表性制备蛋白质纯化选择的组分-染色的SDS-PAGE）。分子量标记的大小（以 kDa 为单位）显示在凝胶的左侧。在 GST 切割之前和之后，与感兴趣的蛋白质 (POI) 相对应的条带位置显示在凝胶的右侧（橙色箭头）。凝胶下方显示了对相关协议步骤的引用。请注意，对于这种 POI 融合，很难检测到裂解液中考马斯染色的诱导（泳道 1-2）。然而，通过两步纯化（第 9-12 道）富集了足够的蛋白质。在泳道 6 中，橙色圆点标记切割的 GST (~26 kDa) 和 GST 标记的 PreScission Protease (~46 kDa) 的位置，它们仍然与 GSH-sepharose 树脂结合。

第二部分。制备性蛋白表达
融合蛋白的产率可以显着地变化，但是在0的范围1 - 10毫克每培养L的纯化的蛋白质的。在部分d中描述的组蛋白肽阵列的条件下，100 μ克就足够了几个实验因为这是kDa的蛋白质<70。

第 1 天。将表达质粒转化为大肠杆菌表达菌株
注意：我们发现新鲜转化的细胞通常表现更好，因此不会冷冻甘油储备。
为第二天准备无菌 2 × YTG 培养基和无菌玻璃器皿。
变换E.大肠杆菌根据制造商的说明用表达质粒小量制备DNA BL21（DE3）pLysS中，但按比例缩小了一半。
在含有100 μg/ml 氨苄青霉素和 34 μg/ml 氯霉素的LB 琼脂平板上平板。
在 37 °C 下孵育过夜。

第 2 天。培养大肠杆菌,诱导表达
注意：使用至少 4倍培养体积的烧瓶大小，以保证充分通气。
在清晨，用单个菌落接种 25 ml 2 × YTG/Amp/CAM 起始培养物。
在 37 °C下剧烈摇晃生长约 5-6小时。
将起始剂以 1:50-1:100 的比例稀释到 1 L 的 2 × YTG/Amp/CAM 中。
在剧烈摇动下生长 37 °C ，直到 OD 600达到 0.6-0.8 。
（可选）对于低温诱导，短暂冷却培养瓶。
去除 0.5 ml 未诱导的对照培养样品。储存在冰上。
通过添加 IPTG 至终浓度为 0.5 mM 进行诱导。
在 30 °C 下诱导 4小时，或根据您的试验表达式确定。
在此期间，预称重和预冷离心瓶，转子，和离心机4 ℃下。
将培养物转移到离心瓶中。
去除 0.5 ml 诱导对照培养物。如以上试点表达部分所述，储存在冰上并使用未诱导的过程进行处理。
平衡培养瓶并以~ 4 , 000 × g离心20 分钟或7 , 700 × g 4 °C离心10 分钟。
倒出上清液。称量瓶子并计算颗粒重量。
储存在-80 °C 。
为第二天准备缓冲液：
制作 1.8 L 透析缓冲液，不含 DTT。储存在 4 °C 。
化妆纯化缓冲液没有还原剂（2 -ME或DTT）或蛋白酶抑制剂（PMSF，蛋白酶抑制剂片剂），其将被添加新鲜（见配方）。储存在 4 °C 。

纯化标记蛋白
注意：所有步骤都应在冰上或 4 °C 下完成，以尽量减少蛋白质降解。在整个过程中保存等分试样，以便随后通过 SDS-PAGE 进行监测。

第 3 天。第 I 部分 – 裂解大肠杆菌
在过夜诱导的情况下，离心培养并进行沉淀。
将还原剂和蛋白酶抑制剂添加到用于谷胱甘肽-琼脂糖纯化的缓冲液中（参见食谱）。储存在冰上。
在冰上解冻冷冻的细胞沉淀。
在冰上预冷离心管。
在含有蛋白酶抑制剂和 DTT的冰冷 1 ×裂解缓冲液中重悬细菌沉淀，每克沉淀约 5毫升。对于 1 L 制备培养物，这通常约为 25 ml。
转移到预冷管进行超声处理。
在保持样品在冰水浴中冷却的同时进行超声处理。
注意：请参阅上面优化部分中的超声处理条件和注意事项。如果您的超声仪没有更大的吸头，请将重新悬浮的培养物分成适当数量的小体积管，并在超声处理后重新混合（合并）。
将裂解液转移到预冷的 30-50 ml Oakridge离心管中。
为“整体”和“颗粒”部分取出两个 60 μl 等分试样。在微量离心机中进行处理，如上述中试实验中所述。
确保准备精确平衡的管。在 4 °C 下以20,000 × g × 30 分钟将裂解液离心成不溶性物质。
在离心过程中，按如下所述制备 GSH-Sepharose 树脂。
在冰上预冷上清管。
将上清液（澄清的裂解液）转移到干净的、预冷的冰管中。

第 3 天。第 II 部分 – 在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B 上纯化
注意：所有步骤都应在冰上或 4 °C 下完成，以尽量减少蛋白质降解。在整个过程中，谷胱甘肽-琼脂糖树脂应与缓冲液一起保存。注意不要在移液步骤中丢失树脂。
制备 GSH-Sepharose 树脂：
用手重悬树脂（倒置和摇晃）。
对于 1 L 制备培养，使用 500 μl床体积 (BV) 。
树脂以 75% 的浆液形式提供。因此，对于 500 μl BV，将 666 μl (1.33 × BV) 转移到合适的管中（例如，15 ml 无菌锥形一次性管）。
洗涤树脂2-3 ×用冷的1 ×裂解缓冲液（或冷PBS中，然后冷的1 ×裂解缓冲液）。
对于每次洗涤，在 4 °C 下以500 × g旋转5 分钟（例如，在 Beckman Allegra 摆动桶转子中）并小心地取出缓冲液，不要干扰树脂。
使用最后一次洗涤将树脂分成两个 15 毫升管（或根据超声处理量的需要）。
将树脂储存在 1 ×裂解缓冲液中直至准备使用。
从树脂中取出缓冲液，并立即加入上述制备的澄清裂解液。
与 GSH-Sepharose 结合，在 4 °C × 2.5-3 h旋转。
在孵育过程中，根据需要将还原剂和蛋白酶抑制剂添加到其他纯化缓冲液中。
在冰上准备标记管以收集用于 SDS-PAGE 分析的等分试样：流通、高盐洗涤、低盐洗涤、PreScission 缓冲液洗涤、PreScission 裂解。
在 4 °C 下以500 × g离心5 分钟。
保存 10 µl上清液（“流通”或未结合部分）。
用 10 × BV (5 ml) 高盐洗涤缓冲液洗涤 GSH-Sepharose 。在 4 °C下旋转孵育5 分钟，并在 4 °C 下以 500 g 离心树脂 5 分钟。
保存 10 μl上清液（“高盐洗涤”）
用 10 × BV (5 ml) 低盐洗涤缓冲液洗涤 GSH-Sepharose 。孵育在4 ℃下用5分钟的旋转和离心在500树脂×克在4 5分钟℃下。
保存 10 μl上清液（“低盐洗涤”）。
通过切割 GST 继续从树脂中洗脱蛋白质。
或者，可以使用谷胱甘肽从树脂中洗脱 GST 融合蛋白 [注 6] 。
用 10 × BV (5 ml) PreScission Cleavage Buffer 清洗。
去除洗涤液，留下约 1 毫升的体积。
使用剩余的缓冲液重悬树脂并将其转移到 1.5 ml 管中。
使用额外的 ~0.5 ml PreScission Cleavage 缓冲液清洗用于结合的原始管，并将其添加到 1.5 ml 管中。
离心并去除上清液。
保存 10 μl上清液（“PreScission 缓冲液清洗”）。
添加 460 μl PreScission Buffer和 40 μl PreScission Protease (2 , 000 units/ml)。
如果使用的树脂床体积不是 500 μl，则相应地缩放。
孵育5 ħ在4 ℃下于一个rotato ř裂解和洗脱6 × His标签的蛋白。PreScission 蛋白酶带有 GST 标签，可与树脂结合。
在孵化过程中，准备 TALON 树脂（见下文）和用于 TALON 纯化的缓冲液
收集上清液中裂解的蛋白质。
离心树脂并将含有裂解蛋白的上清液 (500 μl )转移到冰上的新管中。
保存 10 μl等分试样（“PreScission Cleavage”）。
向 GSH-sepharose 树脂中加入 1 × BV (500 μl ) Talon 结合/洗涤缓冲液。在4 °C 下旋转 30 分钟。
离心并将上清液与之前的部分混合。
在 GSH-sepharose 树脂中再加入 1 × BV (500 μl ) Talon 结合/洗涤缓冲液。在4 °C 下旋转 15 分钟。
离心并将上清液与之前的部分混合，共 1.5 ml 。
在下一节中继续对6 × His 标记的蛋白质进行第二次纯化。
旁白 – 要检查 GSH-sepharose 树脂上是否残留蛋白质，将 1 × BV (500 μl ) 剩余的 PreScission 裂解缓冲液添加到剩余的 GSH-sepharose 树脂中。如第 4 天所述，储存在4 °C ，以便稍后取样进行 SDS-PAGE 分析。
将纯化过程中收集的等分试样储存在 -20 °C以进行 SDS-PAGE 分析。

第 3 天。第 III 部分 – 在 TALON 珠上纯化（Cobalt Sepharose 6B-CL）
在 2 ml 管中制备 Talon Resin 。
彻底重悬树脂。
对于 1 L 纯化，使用 200 μl的床体积 (BV) 。
树脂以 50% 的浆液形式提供，因此将 2 × BV (400 μl ) 转移到 2 ml 管中。
以下所有使用 Talon 树脂的离心步骤均在 4 °C 下以 700 × g离心2 分钟。
洗涤2-3 ×用冷1 × PBS或冷爪结合/洗涤缓冲液。
保留在 Talon Binding/Wash 缓冲液中，直到准备好继续。
向来自第一个纯化步骤的 1.5 ml 合并上清液中，添加 MgCl 2至最终浓度为 0.2 mM（3 μl的 100 mM）。
离心 Talon 树脂，去除缓冲液并加入 1.5 ml 第一次纯化的上清液。
在4 °C 下旋转孵育1小时。
在此孵育过程中，将 DTT 添加到冷透析缓冲液中，并在 4 °C 下将其分成 3 个带搅拌棒（每个 600 毫升）的大烧杯。
按照手册中的说明，通过在塑料支架和塑料环之间夹住一层薄膜来准备一个 Dispo-透析器室。在腔室中加入 1 ml 透析缓冲液。让腔室保持打开状态（不要添加第二层膜）。
将 Dispo 透析器放在 4 °c的透析缓冲液烧杯中,放在磁力搅拌板上, 轻轻搅拌。
标记 1.5 ml 管以收集馏分并置于 4 °C （“Talon Flowthrough ”、“Talon Wash 1”、“Talon Wash 2”、“Talon Elution 1”、“Talon Elution 2”、“Talon Elution 3”和'Talon Elution 4'）。
在 4 °C的 1.5 ml 收集管（'Talon Flowthrough'）上设置一个空的 Bio-Rad 迷你柱。如果没有用于微型色谱柱的架子或支架，请使用干净的移液器吸头作为楔子垂直支撑色谱柱，使其出口插入收集管的顶部。
在 4 °C 下将 Talon 树脂和缓冲液转移到空的Bio-Rad 迷你柱中。
允许色谱柱通过重力流入“Talon Flowthrough”管。
当几乎所有的缓冲液都通过后，更换到“Talon Wash 1”收集管。
将 10 × BV (2 ml) Talon Binding/Wash Buffer 添加到柱子中并排干。
重复上述步骤进行第二次洗涤。
洗脱4 ×以1 × BV（200微升达隆洗脱缓冲液），用于各洗脱。在'Talon Elution' 1-4 管中收集这些分数。
为 SDS-PAGE 分析保存每个洗涤和洗脱部分的10 μl等分试样。
盖上柱子并加入等体积的 Talon Elution Buffer 。
汇集（合并）4 个洗脱级分。
从 Dispo-Dialyzer 室中取出缓冲液并添加汇集的蛋白质洗脱液。用第二个膜和塑料环密封顶部。
允许在 4 °C 下轻轻搅拌透析过夜。

第 4 天。完成透析并量化蛋白质。通过 SDS 页分析纯化级分。
第二天，将DISPO-透析器转移到2个和3次透析烧杯2-3 ħ每个。
透析期间：
为 SDS-PAGE 准备使用过的剩余 GSH-sepharose 和 Talon 树脂（“后洗脱”）的样品：
重新小号uspend树脂在等体积的缓冲液中如上所示。
将 30 μl转移到 1.5 ml 管中。
加入 10 μl 4 × Laemmli 样品缓冲液并在 95 °C 下加热5 分钟。
以最大速度离心 1 分钟。
将上清液 (~20 μl ) 转移到新管中。
储存在 -20 °C进行 SDS-PAGE 。
通过将 Laemmli 样品缓冲液添加到最终浓度为 1 ×并在 95 °C 下加热5 分钟，准备在纯化过程中保存的等分试样。简单地离心并在 SDS-PAGE 凝胶上分离样品，其百分比适合您的蛋白质大小。
用考马斯染色并按照以下数据分析中的描述评估纯化。
将样品从 Dispo 透析器室移入冰上预冷的管中。
测量与布拉德福德或其他蛋白定量测定浓度，比较与标准曲线（例如，BSA）的。
注意，样品必须在缓冲液稀释无洗涤剂或还原剂为Bradford测定（例如，PBS）。检查透析缓冲液的等效稀释度，以确保对测定没有干扰。1:3 至 1:5 范围内的稀释通常应落入分析范围内[注 7] 。
将蛋白质分装到预冷、预标记的管中。
计算肽阵列检测所需的量（见下一节）以估计等分试样的大小。应避免冻融循环。
还冷冻 2-4 μg等分试样，通过 SDS-PAGE 检查最终产品的组成
在液氮中快速冷冻等分试样并储存在 -80 °C 。

组蛋白肽阵列检测
Ñ OTE ：最佳查询蛋白质浓度可以是蛋白依赖性的。然而，我们发现使用 175 nM 终浓度的几种蛋白质的结果令人满意。浓度的由制造商推荐的范围是10nM至1 μ M.为了最小化所需的蛋白量，使用菜接近滑动件的尺寸或专门的滑动杂交腔室。此处的体积用于尺寸为 34 mm × 88 mm × 28 mm (L × W × H)的塑料容器。
第 1 天。阻断蛋白质并结合组蛋白肽阵列
所有孵育均在平平台振荡器上进行，轻轻搅拌 (~80 RPM)。真空抽吸器可用于帮助去除洗涤步骤之间的缓冲液。一旦用溶液润湿，阵列应始终保持缓冲液。
制备PBS-T，封闭缓冲液，并预结合缓冲液（见配方）[注8] 。
在冰上解冻纯化的蛋白质的等分试样。
在 4 °C 下以15,000 × g离心2 分钟，以沉淀任何不溶性物质。
将上清液转移到干净的预冷管中。
使用干净的镊子并在末端处理阵列，将肽阵列载玻片放入适当的腔室（参见材料和试剂，D部分）。
简要地洗涤2 × ，用PBS-T 。
在室温下在 10 ml 封闭缓冲液中搅拌孵育 1小时20 分钟。
用 PBS-T 短暂洗涤。
在 10 ml 预结合缓冲液中 4 °C搅拌孵育 10 分钟。
在冰上孵育期间，将蛋白质稀释至最终体积为 4 ml 冷结合缓冲液的所需浓度。
例如，含有 175 nM 蛋白质的 4 ml 溶液需要 700 pmol 蛋白质。对于25 kDa蛋白，这是17.5 μ克，以及对于75 kDa蛋白，这是52.5 μ克：
(pmol 蛋白= 体积×浓度
= 4 × 10 -3 L × 175 × 10 -9 mol/L × 1 × 10 12 pmol/mol)
( μ g 蛋白质 = 分子量× mol
= kDa × 1000 Da/kDa × 700 pmol × 1 × 10 -12 mol/pmol × 1 × 10 6 μ g/g)
去除预结合缓冲液并添加蛋白质溶液。用封口膜密封容器。
在 4 °C搅拌下孵育过夜（~12小时）。
将剩余的封闭溶液储存在 4 °C以备第二天使用。

第 2 天。第 I 部分–在阵列上清洗和检测蛋白质
所有孵育均在设置为 ~80 RPM 的平板振动台上完成。
在 PBS-T 中简单地清洗阵列。
洗涤3 ×在-18毫升的PBS-T，每次5分钟，在室温下搅拌。
在洗涤之后，准备HRPase-缀合的抗His（CTERM）抗体在10毫升1:1的最终稀释的封闭缓冲液：3 ，500（V / V）[注9] 。
去除最后一次洗涤并添加抗体溶液。
在室温下搅拌孵育 1小时20 分钟。
在 PBS-T 中短暂洗涤。
洗涤3 ×在-18毫升的PBS-T，每次5分钟，在室温下搅拌。
当准备进行成像时，取出最后一次洗涤并添加 5 ml 的每种 ECL 试剂 [注 10] 。
用手轻轻搅拌 1 分钟或按照 ECL 的指示。
在吸水纸上吸干多余的液体，然后用塑料薄膜小心地包裹阵列。
与放射自显影梯一起放入胶片盒中。
暴露在胶片上 5 分钟。
暴露在另一张胶片上 1分钟。
如果需要，显影胶片并优化曝光时间。
理想的曝光将具有很强的信号背景比，但不会有饱和或过度曝光的肽点。
检查两个重复的数组，并按预期检查信号是否彼此相似。
检查阴性对照点（阵列右下角的 P20-P24 位置）。预计这些将没有信号或信号很低。
为代表胶片图像，请参阅图URE 1B和图URE S2A在索兹曼等。( 2018) 。如果通过改变曝光时间不能获得令人满意的图像，则可能需要改变蛋白质浓度或缓冲条件。有关其他故障排除，请参阅 [注释 8] 和 [注释 10]。
将显影的胶片与放射自显影阶梯对齐。
用 Sharpie 标记仔细标记幻灯片角和阵列周围对齐网格点的位置。注意不要在阵列区域上做标记。

第 2 天。第二部分–扫描阵列并分析结果
以 600 dpi 的灰度扫描胶片。关闭扫描仪软件的任何自动调整。
如果需要，使用图像编辑软件旋转图像，使肽点的行是直的，阵列标签在右侧。
将图像裁剪到阵列点之外并另存为 .tif。
在 ActiveMotif 的“阵列分析”软件中打开 .tif 文件。
按照 Array Analyze 软件手册，选择点以允许软件覆盖图像上的肽点网格。如果需要，重复此过程以确保图像对齐良好。
为您的样品输入样品“名称”。这将附加在已保存电子表格和图表的文件名的开头。
选择“分析阵列，”和软件将计算每个点的强度，并打开一个结果窗口。
在“ Spot Statistics ”选项卡中，检查左右数组重复项的一致性。重复的并且强度的左侧与右击散点图之间的误差的直方图吨重复可以被保存为“name_fig1.png”和“名称_figXY.png ，”分别。
在“背景设置”选项卡中，检查强度值的图表。默认情况下，背景阈值设置在点强度的第 67 个百分位。但是，可以手动提高或降低背景阈值（通过拖动橙色线）以改变在进一步分析中考虑斑点的严格性。排名强度的图表可以保存为“name_fig2.png”。
检查附加选项卡并保存数据表和图表，如下面的“数据分析”中所述。

数据分析

通过 SDS-PAGE 分析蛋白质纯化
为了监测纯化过程，通过 SDS-PAGE 和考马斯染色检查每一步保存的等分试样。如果在流通或洗涤部分中看到预期大小的蛋白质，或者如果有共同纯化的蛋白质，则可以调整缓冲液的组成或树脂的量。如果蛋白质不能有效地从树脂中去除，也可以优化 PreScission 裂解或咪唑洗脱。请注意，在 PreScission 裂解后，PreScission 蛋白酶和 GST 将保持与 GSH-琼脂糖凝胶结合。这些蛋白质可能分别在 ~46 kDa 和 ~26 kDa 的 GSH-琼脂糖“洗脱后”样品中可见。透析后的最终蛋白质制剂的等分试样也应通过 SDS-PAGE 检查以确认纯度和浓度。

组蛋白肽阵列数据分析
阵列分析的方法将取决于蛋白质识别的修饰以及具有这种修饰的阵列上存在的肽。对于阵列上表示的大多数修饰，存在单独包含修饰（“单一”修饰）以及与其他修饰（“多重”修饰）组合的肽。多重修饰肽中的信号强度差异可能具有生物学意义。例如，某些染色质阅读器结构域与甲基化 H3K9 或 H3K27 的结合会因相邻丝氨酸残基的磷酸化而被取消。
“特异性”选项卡和相关图 (name_fig3.png) 可以显示具有最高特异性得分的“多重”修饰肽（见下文），或具有最高背景扣除强度的“单一”修饰肽。“反应性”选项卡 (name_fig6.png) 显示所有肽段减去背景后的平均强度，只有一个修饰。一旦确定了最感兴趣的修饰，“修饰分析”（name_fig5.png）选项卡可用于绘制包含该修饰的所有肽的背景扣除强度。上面列出的图表示例包含在软件手册中：（https://www.activemotif.com/documents/1700.pdf）
对于自定义分析和绘图，可以从 Array Analyze 软件以逗号分隔值 (.csv) 格式保存三个电子表格：
原始数据保存在“name_data.csv”文件中。384点肽的斑点中的每一个被示为处于它们的阵列上位置的顺序。显示了每个重复子阵列上的强度、平均强度和重复之间的误差。在我们的分析中，我们使用这些原始数据来计算标准化的减去背景的强度，其中背景定义为阴性对照点强度的第 60 个百分位数，强度低于背景的点被指定为零强度：

'name_ranked_list.csv' 显示了按 'activity '排列的 384 个肽段，这是在原始数据文件中找到的平均强度。电子表格还指出每个肽上存在哪些单独的修饰。此外，还报告了每个肽的“标准化活性”，范围从 0 到 1：

“name_ranked_modifications.csv”列出了阵列上存在的 59 个修改，按“特异性”排序。对于每个单独的修饰，阵列上包含修饰的肽的数量（“No pos”）及其平均强度（“ Av Int pos”），以及未修饰的肽的数量（“No neg”）及其平均值强度（“ Av Int neg” ）被指示。然后报告“特异性”分数（绘制在上述“多重修改”图中）：

笔记

飞行员表情说明
[注1]成功我们已经表达的几种蛋白E.大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中。但是，如果您的蛋白质在任何测试的诱导温度下都不能很好地诱导或不溶于该菌株，则建议测试其他表达菌株。建议使用 C41(DE3)pLysS (Lucigen)，或 Rosetta、Origami 或 Rosetta-Gami 菌株 (Novagen)。
[注 2] 该协议避免了过夜培养生长，这对于某些质粒来说可能是有问题的。
[注 3] 此处的培养体积由所需的裂解缓冲液重悬比和可使用 Branson 微尖端进行超声处理的最小体积决定。如果您的系统能够对较小体积进行超声处理，则可以相应地减少培养体积。
[注4] IPTG浓度也可以优化，通常在0.1 - 1 mM范围内。
[注5] 也可加入溶菌酶帮助细胞裂解。裂解缓冲液中去垢剂的浓度和类型也可以进行优化，以帮助溶解您的蛋白质。测试浓度高达 1% 或用 Triton X-100 代替 Tween-20。

制备性蛋白表达和纯化说明
[注 6] 如果您不想切割 GST，也可以使用游离的还原型谷胱甘肽 (GSH) 从 GSH-Sepharose 树脂中洗脱 GST 融合蛋白。在这种情况下，在“用 10 × BV (5 ml) 低盐洗涤缓冲液洗涤 GSH-Sepharose”步骤之后：
用 ~2-5 × BV Tris 预洗脱缓冲液清洗 GSH-Sepharose 。
用 1-2 × BV GSH 洗脱缓冲液在4 °C旋转2小时进行洗脱。将洗脱液储存在冰上。
用额外的 1 × BV GSH 洗脱缓冲液在4 °C 下旋转过夜再次洗脱。
合并两种洗脱液并在 Talon 结合缓冲液中稀释 (≥ 2.5 ×稀释）。
根据主要协议，通过绑定到Talon 珠子进行他的纯化。或者，直接进行透析。
[注7]替代蛋白质定量试剂可能对去污剂或还原剂不太敏感（例如，RC DC Protein Assay，Bio- R ad ，目录号：5000121。如果蛋白质太稀，也可以浓缩（例如，Amicon Ultra-2 离心过滤器单元，Sigma-Aldrich ，目录号：UFC201024) 。

组蛋白肽阵列注意事项
[注8] 封闭和洗涤的严格性也可以优化。已经测试了几种条件（Petell et al. , 2019）；然而，这项研究使用了不同的肽阵列格式。
[注 9] 作为此处描述的基于化学发光的检测的替代方法，可以将与荧光染料（例如，AlexaFluor）或红外染料结合的抗体与适当的扫描仪一起使用。
[注释 10] 要排除弱信号的故障，可以测试更灵敏的 ECL 试剂（例如，Pierce SuperSignal TM West Femto Maximum Sensitivity Substrate，Fisher Scientific ，目录号：34094）。

食谱

注意：所有溶液均使用超纯水（例如，电阻率为 18.2 MΩ.cm 的Milli-Q ®水）制备。
库存溶液和介质
2 × YTG 培养基（2 × YT，含 2% 葡萄糖）（1 L）
在 ~ 700 ml ddH 2 O 中，溶解：
16 克胰蛋白胨
10 克酵母提取物
5 克氯化钠
使用 ddH 2 O将体积调节至 ~850 毫升。
如有必要，将 pH 值调整为 7.0 。
用 ddH 2 O 将体积调整到 900 毫升。
松开盖子，用带高压灭菌带的箔纸盖住。
121°C 高压灭菌 30 分钟，在液体循环中松开盖子。
冷却。
使用前，使用无菌技术添加 100 ml 过滤灭菌的 20% (w/v) 葡萄糖。
20% (w/v) 葡萄糖 (500 ml)
将 100 克葡萄糖溶解在约 400 毫升的 ddH 2 O 中。
用 ddH 2 O 将最终体积调整为 500 毫升。
用 0.22 μ m真空过滤器过滤灭菌。
在室温下储存并在无菌条件下打开。
5 M 氯化钠（1升）
将 292.2 g NaCl 溶解在 ~800 ml ddH 2 O 中。
调整最终体积至1L的DDH 2 ö 。
121°C 高压灭菌 30 分钟，在液体循环中松开盖子。
在室温下储存。
2 M 氯化钾（1升）
将 149.1 g KCl 溶解在 ~800 ml ddH 2 O 中。
调整最终体积至1L的DDH 2 ö 。
121°C 高压灭菌 30 分钟。
在室温下储存。
0.5 M IPTG (MW 238.3 g/mol)
将 4.76 g IPTG 溶解在 ~30 ml ddH 2 O 中。
用 ddH 2 O 将最终体积调整到 40 毫升。
使用 0.22 μM 真空或注射器过滤器过滤灭菌。
在-20 °C 下储存小份；避免冻融循环。
10% (v/v) 海卫 X-100
将 4 ml Triton X-100 添加到 36 ml ddH 2 O 中。
轻轻地彻底混合。
室温保存，避光。
10% (v/v) Tween-20
将 4 ml 的 Tween-20 添加到 36 ml 的 ddH 2 O 中。
轻轻地彻底混合。
室温保存，避光。
100 毫米 PMSF
称重 0.87 克 PMSF 。
溶解在异丙醇中并调整最终体积至 50 ml 。
在 -20°C 或短期在 4°C 下储存等分试样。
1 M NaH 2 PO4 (MW 119.98 g/mol)
将 59.99 g NaH 2 PO4溶解在 ~350 ml ddH 2 O 中。
用 ddH 2 O将最终体积调整为 500 毫升。
121°C 高压灭菌 30 分钟（或过滤灭菌）。
在室温下储存。
0.5 M Na 2 HPO 4 (MW 141.96 g/mol)
将 70.98 g Na 2 HPO 4溶解在 ~800 ml ddH 2 O 中。
调节最终体积至1L的DDH 2 ö 。
121°C 高压灭菌 30 分钟（或过滤灭菌）。
在室温下储存。
100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 8.0
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
9.32 ml 0.5 M Na 2 HPO4（参见上述配方）
0.34 毫升1 M NaH 2 PO 4 （见上述配方）
40.34 ml ddH 2 O (到 50 ml)
在室温下储存。
（可选——仅当从 GSH-sepharose 洗脱而不是从 GST 上洗脱时才需要）：5 × 还原型谷胱甘肽缓冲液（0.3 M Tris-Cl pH 8.8，0.15 M 还原型谷胱甘肽）
将 1.5 M Tris-Cl pH 8.8 5 ×稀释至 0.3 M（例如，10 ml 1.5 M Tris-Cl pH 8.8 + 40 ml ddH2O）。
将 0.46 g 还原型谷胱甘肽 (MW 307.32) 溶解在 10 ml 0.3 M Tris-Cl pH 8.8 中。
取一小等分试样，稀释1:10，并检查该最终pH为≥ 8 。
将小等分试样储存在-20 °C；避免冻融循环。
3 M 咪唑 pH ~7.5 (4 °C )
将 4.08 克咪唑溶解在 ~ 12 ml ddH 2 O 中。
用 ddH 2 O将体积调整到 18.5 毫升。
加入 1.5 毫升浓盐酸。
取等分试样，并将其稀释到1/10个在DDH 2 O.检查pH为〜7.5。
储存于 4°C 。
5 ×裂解缓冲液（100 mM HEPES-Na pH 7.5、1.5 M NaCl、0.5 mM EDTA，不含 DTT 或蛋白酶抑制剂）（25 ml）
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
14.98 毫升 ddH 2 O
2.5 ml 1M HEPES-Na pH 7.5
7.5 毫升 5M 氯化钠
25 μl 0.5 M EDTA pH 8
储存于 4°C 。

用于蛋白质纯化的缓冲液
注意：不含还原剂（DTT、2-ME）或蛋白酶抑制剂的缓冲液可在 4°C 下储存。以下数量足以进行 2 × 1 L 纯化。
1 ×裂解缓冲液（20 mM HEPES-Na pH 7.5、300 mM NaCl、0.1 mM EDTA、1 mM PMSF、10 mM 2-ME、± 0.5% Tween-20**）
** 注意洗涤剂是可选的。见注释。超声处理后可以添加去垢剂。
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
成分
F或 30 毫升
ddH 2 O
22.2 毫升
5 ×裂解缓冲液（见上面的配方）
6毫升
10% Tween-20（见上面的配方和注释）
1.5 毫升
（使用前加入新鲜的）100 mM PMSF（见上面的配方）
300微升
（使用前添加新鲜）2-ME
21微升
（使用前添加新鲜）：完整的迷你蛋白酶抑制剂片
每 10 毫升 1 片
保持在冰上或 4°C；不要存储。
GST高盐洗涤缓冲液（20 mM HEPES-Na pH 7.5、500 mM NaCl、0.1 mM EDTA、10 mM 2-ME）
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
成分
F或 5 毫升
ddH 2 O
4.4 毫升
1 M HEPES-Na pH 7.5
100微升
5 M 氯化钠
500微升
0.5 M EDTA pH 8
1微升
（使用前添加新鲜）2-ME
3.5微升
保持在冰上或 4°C；不要存储。
GST低盐洗涤缓冲液（20 mM HEPES-Na pH 7.5、100 mM NaCl、0.1 mM EDTA、10 mM 2-ME）
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
成分
F或 5 毫升
ddH 2 O
4.8 毫升
1 M HEPES-Na pH 7.5
100微升
5 M 氯化钠
100微升
0.5 M EDTA pH 8
1微升
（使用前添加新鲜）2-ME
3.5微升
保持在冰上或 4°C；不要存储。
PreScission 蛋白酶缓冲液（20 mM HEPES-Na、150 mM NaCl、1 mM EDTA、2.5 mM 2-ME、0.01% Tween-20）
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
成分
F或 10 毫升
ddH 2 O
9.47 毫升
1 M HEPES-Na pH 7.5
200微升
5 M 氯化钠
300微升
0.5 M EDTA pH 8
20微升
10% 吐温 20
10微升
（使用前添加新鲜）2 -ME
1.75微升
保持在冰上或 4°C；不要存储。
Talon 结合/洗涤缓冲液（50 mM 磷酸钠 pH 8、300 mM NaCl、0.25% Tween-20、5 mM 咪唑、2.5 mM 2-ME、1 mM PMSF）
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
成分
F或 10 毫升
ddH 2 O
4.03 毫升
100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 8（参见上述配方）
5毫升
5 M 氯化钠
600微升
10% 吐温 20
250微升
3 M 咪唑（见上述配方）
16.7微升
（使用前添加新鲜）2 -ME
1.75微升
（可选；使用前添加新鲜）100 mM PMSF
100微升
保持在冰上或 4°C；不要存储。
Talon Elution Buffer（洗涤缓冲液的组成，300 mM 咪唑除外）
到无菌容器（例如，50ml试管）中，添加：
成分
F或 5 毫升
ddH 2 O
1.53 毫升
100 mM 磷酸钠缓冲液，pH 8（参见上述配方）
2.5 毫升
5 M 氯化钠
300微升
10% 吐温 20
125微升
3 M 咪唑（见上述配方）
500微升
（使用前添加新鲜）2 -ME
0.88微升
（可选；使用前添加新鲜）100 mM PMSF
50微升
保持在冰上或 4°C；不要存储。
透析缓冲液（25 mM HEPES-Na、100 mM KCl、0.2 mM EDTA、1 mM DTT、20% 甘油）
向 2 L 量筒中加入 360 ml 甘油。
添加的DDH 2 O操作大约1.2升。
添加 45 ml 1 M HEPES-Na pH 7.5 。
添加 90 毫升 2 M 氯化钾。
添加 720 μl 0.5 M EDTA pH 8 。
将 ddH 2 O添加到 1.8 L 的最终体积。
用 2 层石蜡封严。
颠倒几次直到彻底混合。
至少过夜冷却至 4°C 。
（使用前新鲜）加入 1.8 毫升 1 M DTT 并重复混合。
将 600 毫升分成 3 个烧杯中的每一个进行透析。
保持在4°C；不要存储。
（可选——仅当从 GSH-sepharose 洗脱而不是从 GST 上洗脱时才需要） Tris 预洗脱缓冲液（60 mM Tris-Cl pH 8.8，10 mM 2-ME）
在无菌管中混合以下物质：
成分
F或 5 毫升
ddH 2 O
4.8 毫升
1.5 M Tris-Cl pH 8.8（或 pH 8）
0.2毫升
（使用前添加新鲜）2 -ME
3.5 微升
保持在冰上或 4°C；不要存储。
（可选——仅当从 GSH-sepharose 洗脱蛋白质而不是从 GST 上洗脱时才需要）谷胱甘肽洗脱缓冲液（60 mM Tris-Cl pH 8.8、30 mM 还原型谷胱甘肽、200 mM NaCl、20% 甘油、10 mM 2-ME )
在无菌管中混合以下物质：
成分
F或 5 毫升
ddH 2 O
2.8 毫升
5 × 还原型谷胱甘肽（见食谱）
1毫升
5 M 氯化钠
0.2毫升
甘油
1毫升
（使用前添加新鲜）2-ME
3.5 微升
保持在冰上或 4°C；不要存储。
考马斯染色液（0.2％考马斯亮蓝R-250 ，50％甲醇，10％乙酸）
在 500 毫升玻璃瓶中，混合：
200 毫升ddH 2 O
250 毫升甲醇
50毫升冰醋酸
1 克考马斯亮蓝 R250
多余的染色液可以回收并重新使用。
在室温下储存。
考马斯脱色液（40% 甲醇，10% 乙酸）
在 1 升玻璃瓶中，混合：
500ml ddH 2 O
400毫升甲醇
100毫升冰醋酸
在室温下储存。

组蛋白肽阵列缓冲液
洗涤缓冲液（PBS-T – 含 0.05% (v/v) Tween-20 的磷酸盐缓冲盐水）
用 9 份 ddH 2 O稀释 1 份 10 × PBS 。
使用大口径吸头添加 Tween-20 至最终浓度为 0.05% (v/v)（每 1000 份 0.5 份）。
封闭缓冲液（PBS-T 中的 5% (w/v) 牛奶）
将 1 g 脱脂奶粉溶解在 ~18 ml PBS-T 中。
用 PBS-T 将最终体积调整为 20 ml 。
预结合缓冲液（PBS-T 中的 3% (w/v) BSA）
将 0.6 g BSA 溶解在 ~18 ml PBS-T 中。
用 PBS-T 将最终体积调整为 20 ml 。
肽阵列结合缓冲液（1 × PBS-T，含有 0.45% (w/v) BSA、0.5 mM EDTA、0.1 mM DTT、10% 甘油）
向无菌管中添加以下成分：
成分
F或 5 毫升
PBS-T
3.75 毫升
PBS-T 中的 3% BSA（见上文）
750 微升
甘油
500 微升
0.5 M EDTA pH 8
5 微升
（使用前添加新鲜）1 M DTT
0.5 微升
使用前新鲜并保持在冰上。不要存储。

致谢

我们要感谢 Jeannie T. Lee 博士（马萨诸塞州总医院）和 Lee 实验室的成员在制定该协议时提供的支持。我们还要感谢 D. Ray 博士（多伦多大学 T. Hughes 博士实验室）对蛋白质纯化的建议。这项工作得到了加拿大国家研究委员会的 HL Holmes 奖和 NSERC 发现赠款的支持。该协议在Saltzman等人中使用。( 2018) 。

利益争夺

没有要申报的竞争利益。

伦理

该协议不使用人类或动物受试者。

参考

Bannister, AJ, Zegerman, P., Partridge, JF, Miska, EA, Thomas, JO, Allshire, RC 和 Kouzarides, T. (2001)。HP1 色域选择性识别组蛋白 H3 上的甲基化赖氨酸 9。自然410（6824）：120-124。
Bock, I.、Kudithipudi, S.、Tamas, R.、Kungulovski, G.、Dhayalan, A. 和 Jeltsch, A. (2011)。Celluspots 肽阵列在分析表观遗传阅读域与修饰组蛋白尾部的结合特异性中的应用。BMC 生物化学 12：48 。
Dhalluin, C., Carlson, JE, Zeng, L., He, C., Aggarwal, AK 和 Zhou, MM (1999)。组蛋白乙酰转移酶溴结构域的结构和配体。自然399(6735)：491-496。
Ghoneim, M.、Fuchs, HA 和 Musselman, CA (2021)。组蛋白尾部构象：与 DNA 的模糊关系。Trends Biochem Sci 46(7): 564-578。
Gibson, DG, Young, L., Chuang, RY, Venter, JC, Hutchison, CA, 3rd 和 Smith, HO (2009)。酶促组装达数百千碱基的 DNA 分子。Nat 方法6(5): 343-345。
Graslund, S., Sagemark, J., Berglund, H., Dahlgren, LG, Flores, A., Hammarstrom, M., Johansson, I., Kotenyova, T., Nilsson, M., Nordlund, P. 和 Weigelt , J. (2008)。使用系统的 N 端和 C 端缺失来促进重组蛋白的生产和结构研究。蛋白质 Expr Purif 58(2): 210-221。
Harper, S. 和 Speicher, DW (2011)。纯化与谷胱甘肽 S-转移酶融合的蛋白质。方法 Mol Biol 681：259-280。
Jacobs, SA 和 Khorasanizadeh, S. (2002)。HP1 染色质结构域与赖氨酸 9 甲基化组蛋白 H3 尾部结合的结构。科学295 (5562) ：2080 - 2083。
Jacobson, RH、Ladurner, AG、King, DS 和 Tjian, R. (2000)。人 TAFII250 双溴结构域模块的结构和功能。科学288 (5470) ：1422–1425。
Liang, X., Peng, L., Baek, C.-H. 和 Katzen, F. (2013)。单步 BP/LR 组合网关反应。生物技术55 （5）：265 - 268。
Mauser, R. 和 Jeltsch, A.（2019 年）。修饰组蛋白肽阵列在染色质研究中的应用。 Arch Biochem Biophys 661: 31 - 38。
Musselman, C. A.、Lalonde, M.-E.、Côté, J. 和 Kutateladze, T. G. (2012)。通过组蛋白阅读器感知表观遗传景观。Nat Struct Mol Biol 19 (12) ：1218 - 1227。
Nady, N.、Min, J.、Kareta, M. S.、Chédin, F. 和 Arrowsmith, C. H. (2008)。染色质景观上的一个点？组蛋白肽阵列作为表观遗传研究的工具。Trends Biochem Sci 33 (7) : 305 - 313。
Nielsen, P. R., Nietlispach, D., Mott, H. R., Callaghan, J., Bannister, A., Kouzarides, T., Murzin, A. G., Murzina, N. V. and Laue, E. D. (2002)。HP1 染色质域与赖氨酸 9 甲基化的组蛋白 H3 结合的结构。 Nature 416 (5562) : 103 - 107。
Petell, C. J.、Pham, A. T.、Skela, J. 和 Strahl, B. D.（2019 年）。用于检测组蛋白与肽微阵列相互作用的改进方法。科学代表9 (1) ：6265。
Saltzman, A. L.、Soo, M. W.、Aram, R. 和 Lee, J. T.（2018 年）。多个组蛋白甲基赖氨酸读数器确保秀丽隐杆线虫的稳健发育和种系永生。遗传学，210 （3）：907 - 923。
Winkler, D. F. H.、Hilpert, K.、Brandt, O. 和 Hancock, R. E. W. (2009)。使用 SPOT 技术和 CelluSpots 方法合成肽阵列。方法 Mol Biol 570: 157 - 174。
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