材料和试剂

1. 1.5 ml 聚丙烯 Eppendorf 管（VWR，目录号：10025-728）
2.移液器吸头
3. 3M 永久性双面胶带 ½”（苏格兰威士忌，目录号：34-8507-8235-9）
4.塑料P ETRI培养皿（VWR，目录号：25389-040）
5.玻璃毛细管，3.5”（Drummond Scientific Company，目录号：3-000-203-G/X）
6.玻璃P ETRI菜，100 × 15毫米（VWR，目录号：75845-546）
7. 64 盎司。白色双层涂层纸食品杯（WebstaurantStore，目录号：999SOUP64WB ），冲出笔大小的孔，上面覆盖着橡胶塞（用于蚊子围栏）
8.橡胶塞（VWR，目录号：217-0515）（用于蚊子围栏）
9. 30 G × ½” 皮下注射针头（BD，目录号：305106）
10. 1 ml注射器（BD，目录号：309628）
11. PCR管（VWR，目录号：20170-010）
12. Kimwipes（Fisher Scientific，目录号：06-666A）
13. 1 盎司。半透明塑料蛋奶酥杯（WebstaurantStore ，目录号：301100PC）
14. 2 盎司。半透明聚苯乙烯蛋奶酥杯（WebstaurantStore ，目录号：760P200N）
15. 3-4日小号老埃及伊蚊雌蚊（多株鸡蛋可从BEI资源），看到提示的注意事项选拔女与雄蚊
16. Vero 电池（ATCC，目录号：CCL-81）
17.糖源，如方糖小号或葡萄干
18.冰
19.冰桶
20.矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）
21. Kendall/Covidien Curity 通用海绵，非无菌，无纺布，4 层，3" × 3"（7.6 × 7.6 厘米）（型号 9023）
22.白色雪纺面料 8” × 8” (Fabricwholesale.com)
23. Dulbecco's Modified Eagle培养基（Corning，目录号：10-013-CV）补充有7％热灭活（56°C 30分钟）胎牛血清（FBS，Atlas Biologicals，目录号：F-0500-A )，1% 青霉素/链霉素（Corning，目录号：30-001-Cl），1% 谷氨酰胺（Corning，目录号：25-005-Cl）（DMEM 7% FBS，参见配方）
24.冷冻 ZIKV（PRVABC59，登录号：KU501215）库存，浓度至少为2 × 10 6 -8 × 10 6 PFU/ml [在 69 nl 中注射 ~100-500 PFU 的最低浓度，如Williams等人所述阿尔。( 2020 )和 Sanchez-Vargas等人。( 2020) ] [见Freppel等人。（2018 年）关于量化传染性病毒滴度的协议（见食谱）]
25. 2 0% 漂白剂（Clorox）（见配方）
26. 70% 乙醇（见食谱）

设备

1.移液器
2.镊子（Dumont，目录号：5SF）
3. Leica GZ4 StereoZoom 显微镜
4.双鹅颈显微镜照明器（Dolan Jenner Fiber-Lite 180、181-1 系统）
5.萨特仪器有限公司垂直微量拉马（萨特仪器，米Odel等：P-30）
6. Nanoject II Auto-Nanoliter Injector（Drummond Scientific Company，目录号：3-000-204）

程序

A.准备胸内接种针和病毒注射液
1.准备注射用微量移液针
一种。线A的塑料的直径P用Scotch双面胶带ETRI菜。这将用于存放准备好的微量移液器针头，以免损坏其精致的尖端。
湾将一根3.5" 玻璃毛细管放入Sutter Instrument Co. 垂直微量移液器拉拔器中。
C。将微量移液器拉拔器设置为加热 999，拉 003 。
d. 拉针。
e. 放置在双面胶带的顶部上的针在预先制备的P ETRI菜储存直至使用。
2.准备病毒注射液
一种。在冰上解冻冷冻的 ZIKV 股票。
湾用 DMEM 7% FBS 稀释病毒，加入 200 μ l PCR管。浓度应为 ~ 2 × 10 6 -8 × 10 6 PFU/ml，目标注射浓度为 100-500 PFU in 69 nl（使用 Nanoject II 模型仪器单次注射的最大体积）。有关相关计算，请参阅食谱。
C。将病毒注射混合物放在冰上。
3.用矿物油加载微量移液器
一种。使用镊子，轻轻折断拉针的尖端，使其宽度足以装载注射混合物（图 1），但不要太钝，以免伤害蚊子。理想情况下，尖端尺寸应为 10-30 微米。针尖应在显微镜下目视检查，以确保它不会过于钝。注射后过钝的针头可能会导致蚊子死亡。

图 1. 用于注射的微量移液器尖端准备。A.在折断尖端之前拉动微量移液器尖端，不适用于胸腔内接种。B.适当准备的微量移液器吸头适用于胸腔内接种。
湾用矿物油填充 1.5 ml Eppendorf 管。
C。使用 30 G × ½” 仪表和注射器，通过无尖的一侧向针头注入油来回填针头。如果在将针头连接到注射器之前不回填针头，Nanoject II 将无法正常运行。
d. 根据制造商的说明 (图 2B)在Nanoject II Auto-Nanoliter Injector 控制面板 (图 2A)上设置注射量和速度。音量和速度由控制箱侧面的拨码开关的位置控制。音量范围为 2.3-69 nl ，而速度为 23（慢）或 46（快）nl/s。一旦选定了体积，每次按下 INJECT 按钮时，都会分配选定的体积。

图 2. Nanoject II Auto-Nanoliter Injector 控制面板设置。A. DIP 开关指示 50.6 nl 的注射体积和快速的流速。B. Nanoject II 设置注射量和速度的说明。U = 向上，D = 向下。

e. 按照操作说明将一根拉出的针小心地穿过 Nanoject 的金属尖端，直到它停止到位。轻轻拉动针头以确认它已牢固安装。
F。固定针头后，按住 EMPTY 按钮，直到线柱塞从针头末端弹出 ~½”。回填的油将被排出。
G。将微量移液器的尖端放入装有矿物油的 1.5 ml Eppendorf 管中。小心不要让针尖接触管子的底部。按下 FILL 按钮，让针头充满油。
4.用病毒注射混合物加载针头
一种。将针尖放入病毒注射液中。
约50 μ升是用于在200病毒制备的最小体积μ升PCR管中。满载微量针将包含约2.5 μ的病毒注射溶液升。如果 PCR 管中的注射量太小，用户可能会将空气吸入微量移液器针头，从而产生气泡，从而导致注射量不准确。
湾按住 FILL 按钮，让柱塞缩回，吸入病毒溶液。不要让气泡在针头中形成。这些气泡会导致进样量不准确。病毒注射混合物和矿物油之间应该有明显的界限。矿物油层还防止了病毒污染的任何设备。
C。用足够的病毒注射混合物加载针头以舒适地填充针头（大约一半）。数量可能取决于一个人的注射速度：让病毒在针头中停留太久可能会降低传染性，因为病毒不再在冰上。当针头满载时，Nanoject II 将发出两次蜂鸣声。
d. 装入针头后，小心不要将针尖接触到任何坚硬表面而损坏针尖。这可能会使尖端变钝。如果尖端变钝，请重复步骤A 3- A 4。
e. 为确保病毒注射混合物从针头自由流动，请在 Kimwipe 上进行几次测试注射（然后用 70% 乙醇溶液喷洒 Kimwipe 以消除病毒）。
用惯用手小心地握住 Nanoject II，然后将加载的针尖轻轻地放在 Kimwipe 的表面上。
按注射。应该从针尖喷出一个小的粉红色液滴。如果没有，请单击“注入”，直到病毒注入混合物自由流动。
笔记：
1)如果在几次测试注射后病毒注射混合物不能自由流动，则尖端可能不够宽。如果是这种情况，请将病毒注射混合物喷射回含有混合物的 PCR 管中。丢弃 20% 漂白剂溶液中的针头并重复步骤A3 和 A4 。
2)如果几次测试注射后病毒注射混合物不能自由流动，并且尖端足够宽，则可能会堵塞针头。如果是这种情况，请将针丢弃在 20% 漂白剂溶液中，然后重复步骤A3 和 A4 。这可能发生在胸内接种几只蚊子后。

B.对Ae进行 ZIKV 胸内接种。埃及
1.在 4 °c下麻醉蚊子, 为胸内接种准备蚊子
一种。放置一个玻璃P在冰上的盖ETRI菜。
安排双鹅颈显微镜照明，使得光在中心P ETRI菜。
调整立体显微镜，使得目镜处于焦点上的P ETRI菜。
湾放一小盒Ae。aegypti在4 °C 的冰箱中。不要一次麻醉太多，这取决于一个人的注射速度。将蚊子放在冰上太久 (> 30 m) 可能会导致显着的死亡率。
C。一旦蚊子麻醉（〜5分钟），倾他们进入玻璃的内侧P置于冰上ETRI。
d. 使用镊子，将一只蚊子放在一侧，使其目标注射点可见。
使用显微镜，目视检查蚊子胸部的注射点。仔细检查后，有一个小的“V”形软组织区域，不受蚊子角质层的保护。这是目标注入点。作为参考，在图 3 中，一只蚊子被注射了 69 nl 紫色 NuPAGE LDS 样品缓冲液，并指示了目标注射点。

图3 。艾。埃及目标注射部位。A. 女性Ae。埃及蚊子胸腔内接种紫色 NuPage LDS 样品缓冲液用于可视化目的。在蚊子胸部的上下文中，目标注射部位用红色箭头表示。

2.进行 ZIKV 胸内接种
一种。使用您的惯用手，轻轻地将加载的针尖放入蚊子的目标注射点（图 4）。
注意：如果针头准备妥当，针尖应轻轻滑入目标注射点。针尖不需要插入很深。如果需要用力，可能会损坏蚊子，导致死亡；如果是这种情况，请重复步骤A 3和 A 4 。

图 4. 胸腔内接种程序。A.蚊子在进行胸腔内接种时在冰上麻醉。B.蚊子会被刺到足以粘在针尖上。

湾将病毒注射液注入蚊子目标注射点。
一旦所述针头尖端插入到目标喷射点，按INJECT 。随着注射混合液的流动，蚊子会慢慢上升一点。只需再次按下 INJECT，即可进行多次进样（最多 3 次进样 [= 207 nl 总体积]）。在第一次注射完成之前再次按下 INJECT 不会产生第二次注射。蜂鸣声表示注射。
C。将蚊子放回纸盒中。
将充当蚊子笼的纸箱放在一侧，用橡胶塞挡住一个小孔（图 5A）。
从纸箱上取下橡胶塞，并使用向上运动非常轻轻地将蚊子从纸箱孔边缘的针上擦掉（图 5B）。更换橡胶塞r。

图 5. 将受感染的蚊子放回适当的容器中。A.一个带有小笔大小孔的纸盒用作蚊子笼。它被放置在它的一侧。B.通过向上运动（以卡通形式描绘）将被感染的蚊子从针头上刷下来，轻轻地将其放回纸箱中。纸箱顶部衬有用橡皮筋固定的网。

3. 将装有糖和水的受感染蚊子放在适当的容器中
一种。地方糖源，如潮湿的方糖或葡萄干，上的顶部的蚊子纸箱。
湾将水源放在纸箱顶部。我们使用一个小的注水塑料杯，上面覆盖着 2 层纱布，用橡皮筋固定在顶部。
C。将受感染的蚊子纸箱放入适当的容器中。

数据分析

我们已经发现 100% 的Ae。胸腔内接种 100-500 PFU ZIKV PRVABC59 的埃及伊蚊（Higgs White Eye 和 Mapastepec 菌株）在注射后 7-8 天以高滴度被感染（Williams等，2020，图 6 左面板标记为“HWE” ；Sanchez -Vargas等人，2020 年，图 4）。所有蚊子都表现出相似的病毒滴度[ 4.3 × 10 5 ± 5.2 × 10 4 PFU/ml（株：HWE）和6.8 × 10 5 ± 6.5 × 10 4 PFU/ml（株：Mapastepec）] 。通过 Vero 细胞 (ATCC CCL-81) 噬菌斑测定评估感染流行率和传染性病毒滴度。在比较不同组之间的病毒滴度时，我们使用非参数 Mann-Whitney U 检验来分析非正态分布数据。在比较不同组之间受感染蚊子的流行率时，我们使用双尾 Fisher 精确检验。通常，n = 30 的样本量具有足够的功效来揭示任何统计显着性。

笔记

1.虽然雌性和雄性蚊子都适合接种，但大多数研究集中在雌性蚊子上，因为只有雌性蚊子才能通过传染性血粉传播虫媒病毒。为了在注射前区分雌性和雄性成年蚊子，请仔细检查它们的触角（图 6）。雄性蚊子的触角上有明显“浓密”的细毛，而且也比雌性小。
2.我们发现，鉴于不存在堵塞问题，相同的微量移液器针头可用于接种大约 100-120 只蚊子。满载微量针将包含约2.5 μ样品的升。如果用户注射 69 nl，则在重新填充针头之前可以注射大约 35 只蚊子。但是，同一针可以重新填充和重复使用。
3.我们估计每1小时可以注射30-100只蚊子，这取决于一个人的技能水平和速度。
4.我们建议在注射后 24-48 小时检查处理过的蚊子以记录死亡率。我们发现死亡率在很大程度上取决于注射技术，但如果温和地进行，大多数（如果不是全部）蚊子都会存活下来。
5.我们也想强调的是，应确保ð该病毒注射混合料自由地从注射针蚊子胸内接种前流淌。如果针尖不够宽，注射混合物将不会流动。更常见的是，注射了许多蚊子后，针尖可能会堵塞，这可能是由于蚊子碎片可能会卡在针尖上。有时可以通过执行多次“脉冲”注射以清除碎屑来疏通针头。如果针头仍然堵塞，请将其丢弃在 20% 的漂白剂中，并准备一根新针头进行胸内接种。如果针头被堵住，继续胸腔内接种，有些蚊子就不会感染病毒，结果数据可能会出现偏差（感染病毒的蚊子会被高度感染，而没有感染病毒的蚊子则不会被感染）。

图 6. 雌性与雄性成年Ae。埃及人。A.女性Ae。埃及人有平的触角。B.中号强麦阂。埃及人有羽毛状的触角，通常比雌性小。蓝色箭头表示天线。

食谱

1. Dulbecco's Modified Eagle培养基，含7%热灭活胎牛血清（DMEM 7% FBS）
70 ml 热灭活胎牛血清
注意：FBS 可以在 56 °C下加热灭活30 分钟。
10 ml 100 ×青霉素-链霉素/L-谷氨酰胺
920 毫升 DMEM
2.每只接种蚊子的 100 PFU ZIKV 注射量（以 nl 为单位）
除以 100/股票浓度，以 nl 为单位。例如，8 × 10 6 PFU/ml的病毒原液为8 PFU/nl [ ( 8 × 10 6 PFU/ml)/(1 × 10 6 nl/ml) ] 。要获得 100 PFU/注射液，除以 100 PFU/8 PFU/nl 以获得 12.5 nl。
但是请注意，Nanoject II 控制面板注射量不可调节（图 2B），在这种情况下，病毒库存需要稀释以匹配 Nanoject II 执行的注射量。例如，由 Nanoject II 执行的最接近 12.5 的注射体积是 13.8 nl。因此，需要通过添加 1.3 nl (13.8 nl - 12.5 nl) DMEM 7% FBS 培养基来稀释病毒注射溶液以获得 100 PFU/13.8 nl，每 12.5 nl 股票病毒。例如，如果开始用50 μ升8 × 10 6 PFU / ml储备（用于制备注射溶液的最小容积），转换50 μ升到NL乘以50 × 10 3 = 50 ，000 NL。分50 ，000 NL / NL 12.5 = 4 ，000再乘以4 ，000 × 1.3 NL = 5 ，200 NL或5.2 μ升附加DMEM 7％FBS的培养基至50 μ升8 × 10 6 PFU / ml的股票总体积为 55.2 μ l 。
3. 20% 漂白剂
200 毫升高乐氏漂白剂
800 毫升自来水
4. 70% 乙醇
700 毫升乙醇
300毫升自来水

致谢

作者要感谢 William (Bill) Reid 博士提供了适用于图 3 的照片。这项研究由 NIH 资助，资助号为 R01 AI130085-02。该协议最初在威廉姆斯等人中描述。( 2020) 和 Sanchez-Vargas等人。（2021）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1. Franz, AW, Kantor, AM, Passarelli, AL 和 Clem, RJ (2015)。蚊子虫媒病毒感染的组织屏障。病毒7(7)：3741-3767。
2. Freppel, W.、Mazeaud, C. 和 Chatel-Chaix, L.（2018 年）。哺乳动物细胞中寨卡病毒的产生、滴定和成像。生物协议8 (24) ：e 3115。
3. Gubler, DJ 和 Rosen, L. (1976)。一种无需使用脊椎动物宿主即可证明蚊子传播登革热病毒的简单技术。Am J Trop Med Hyg 25（1）：146-150。
4. Huang, YS, Vanlandingham, DL, Bilyeu, AN, Sharp, HM, Hettenbach, SM 和 Higgs, S. (2020)。SARS-CoV-2 未能在蚊子中感染或复制：一个极端的挑战。科学报告10(1): 11915。
5. Reynolds, ES, Hart, CE, Hermance, ME, Brining, DL 和 Thangamani, S. (2017)。节肢动物传播病毒的动物模型概述。Comp Med 67（3）：232-241。
6. Sanchez-Vargas, I., Olson, KE 和 Black, WC 4th。(2021)。唾液腺障碍对虫媒病毒传播的遗传基础。昆虫12(1) ：73。
7. Williams, AE, Sanchez-Vargas, I., Reid, WR, Lin, J., Franz, AWE 和 Olson, KE (2020)。抗病毒小干扰 RNA 通路在转基因埃及伊蚊中诱导寨卡病毒抗性。病毒12(11)：1231。
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