材料和试剂

SnakeSkin TM透析管，10K MWCO，22 mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：68100）
Amicon Ultra-15离心过滤装置（Millipore Sigma，目录号：UFC905008）
质粒
p SecAΔcys：N 末端带有His 6标签的 SecA 的表达质粒，所有半胱氨酸都替换为丝氨酸（Gupta等人，2020 年）
pSecYEG：对于N-末端他表达质粒6 -标记的SecY，SECE ，和SECG; 这个质粒是山树欧博士（加州理工学院）的礼物
POA-mDHFR-P86：对于含有N-末端178个proOmpA，一个酸的融合蛋白表达质粒GSGS接头，小鼠DHFR ，和P86肽（狄克逊等人，2016）
注意：可以在 GSGS 接头之后和 p86 肽之前插入不同的感兴趣的蛋白质，而不是小鼠 DHFR。这样的构建体将允许人们使用该测定来研究不同的感兴趣的蛋白质。
p11S：带有 N 端 His 6 -SUMO 标签的 11S NanoLuc 片段的表达质粒（Dixon等，2016）
pGST-dark：与谷胱甘肽-S-转移酶融合的无活性 p86“暗”肽的表达质粒（Pereira等，2019）
细胞
BL21 （DE3）感受态细胞（安捷伦科技Ç atalog号：230130）
MM52 感受态细胞[根据Sambrook 和 Russel ( 2001)制备，来自Oliver 和 Beckwith ( 1981 ) #1128 的菌株]
LB 培养基（Sambrook 和 Russel ，2001）
带有 Amp 的 LB 琼脂平板（Sambrook 和 Russel ，2001）
超级最佳肉汤 (SOB) （Sambrook 和 Russel ，2001 年）
氨苄青霉素（Amp）（Millipore Sigma，目录号：171254）
Prionex（Millipore Sigma，Sigma-Aldrich，目录号：G0411）
Nano-Glo ®活细胞分析系统（Promega，目录号：N2011）
完整的蛋白酶抑制剂混合物（Millipore Sigma，Roche，目录号：CO-RO）
n -十二烷基 β-D-麦芽糖苷（DDM）（Millipore Sigma，Sigma-Aldrich，目录号：D4641）
1,10-菲咯啉（Ph）（Millipore Sigma，Sigma-Aldrich，目录号：131377）
大肠杆菌极性脂质提取物（Avanti，目录号：100600）
Bio-Beads SM-2 树脂（Bio-Rad，目录号：1523920）
Ulp1 蛋白酶（根据(Mossessova and Lima 2000)内部制备）
腺苷5'-三磷酸（ATP）二钠盐水合物（Millipore Sigma，目录号：FLAAS）
蛋白质纯化缓冲液（见配方）
用封装的 11S 制备 SecYEG/SecA 囊泡（参见食谱）
氧化 pOA-mDHFR-p86 的制备（见配方）
实时易位测量（见食谱）

设备

超速离心机（贝克曼库尔特，型号：Optima MAX-XP ）
ħ IGH性能离心机（Beckman Coulter公司，型号：阿凡提JE ）
孵化器摇床（Innova 44R 型）
GloMax ®导航系统（Promega，型号：GM2000 和 2010）
超速离心机（贝克曼，型号：Optima XL-80k）
45 Ti 型固定角钛转子（Beckman Coulter，目录号：339160）
Emulsiflex C5 (Avestin)
声波器（布兰森）
AKTA 纯 FPLC 系统（Cytiva）
HisTrap HP（5 ml）（Cytiva，目录号：17524801）
HiTrap Q Sepharose Fast Flow 色谱柱（1 ml）（Cytiva，目录号：17505301）
SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析树脂（Cytiva，目录号：17072901）
HisPur TM Ni-NTA 树脂（Thermo Fisher Scientific，目录号：88221）
挤出机（Avanti，型号：610020）
Hi-Prep 16/60 Sephacryl S-200（Cytiva，目录号：17116601）
Poly-Prep ®色谱柱（Bio-Rad，目录号：7311550）

程序

蛋白质纯化
SecA的纯化
用含有 SecAΔcys的质粒在 LB琼脂 Amp 板上转化BL21 (DE3) 细胞。一夜之间培养殖民地。
接种1升LB-AMP（100 μ克/ ml）与10个从菌落的过夜板。在 37°C下以 225 rpm摇动。
诱导具有IPTG（0.5mM的终浓度）的蛋白表达时的OD 600达到0.4 - 0.6。
2小时后，通过旋降收获细胞的的内容的在6个烧瓶20分钟，000× g 。
在缓冲液 A 中使用超声处理溶解细胞，并加入一片溶解的蛋白酶抑制剂混合物。使用7 40 -小号个循环的工作循环的50％和输出8.循环之间，转移至冷烧杯为5分钟。
一旦所述细胞裂解悬浮液粘性较小和较轻的颜色，离心机以30,000 ×克在4℃下以除去细胞碎片。
加载的澄清的上清液到5 -用缓冲液A平衡的加载后毫升的HisTrap柱（Cytiva）的柱，洗涤，用4％缓冲液B，直到所述UV在280nm处的吸光度水平关闭。用 60% 缓冲液 B 洗脱。
运行的上馏分一个12％SDS-PAGE凝胶（图1）。选择了最纯的级和游泳池。

图 1. SecA 的 HisTrap 纯化。他的标记，无半胱氨酸SecA的在表达E.大肠杆菌和对细胞超声裂解。总细胞裂解物（泳道 1）显示出强烈的过度表达。泳道 1：总细胞裂解物。泳道2：上清液。泳道3：颗粒。泳道 4：流通。泳道 5：25 mM 咪唑洗涤。泳道6 - 9：300mM咪唑洗脱液。

透析的对缓冲液A.汇集洗脱产品一夜
将合并的部分注入Hi-Prep 16/60 Sephacryl S-200。收集 500 - μl 级分。
运行的上馏分一个12％SDS-PAGE凝胶（图2）。选择了最纯的级和游泳池。

图 2. SEC 对 SecA 的纯化。来自 HisTrap 色谱的洗脱液通过 SEC 进行分离。泳道 1 和 2：色谱柱死体积。泳道3 - 8：洗脱级分。

浓缩蛋白质至> 100 μ中号SecA的2使用50kDa的MWCO集中器。
等分蛋白质和使用液氮快速冷冻。储存在-80°C。
验证后共重构使用SecYEG蛋白酶保护蛋白活性-基于易位测定（古普塔。等人，2020）。
SecYEG的纯化
用 2 μ l 30 ng/ μ l SecYEG 质粒转化 50 μ l BL21 (DE3) 。允许在冰上静置 30 分钟。热休克 1 分钟，然后在冰上恢复 2 分钟。添加900 μ升SOB和抖动在37 °下进行1个小时。降速在200个细胞，重悬μ升新鲜的SOB。在 LB 琼脂 Amp 板上板整个体积。
用一个菌落接种 50 ml LB (100 μ g/ml Amp)。提出三点，100 -倍连续稀释。一夜之间长大。
在对数中期，每个隔夜培养物接种 8 L LB-Amp 。
一旦 OD 600达到~0.5，在 37°C 下以 0.5 mM IPTG的终浓度诱导蛋白质表达。
2 小时后，将烧瓶置于 4°C。4°C、6,000 × g离心15 分钟收获。
将总颗粒重悬在 35 ml 冰冷的缓冲液 C 中。加入 2 粒粉碎的蛋白酶抑制剂鸡尾酒药丸。搅拌均匀。
分配到50 -毫升Falcon管（〜每管15毫升）并在液氮中冷冻彻底。细胞在 -80°C 下最多可保存1周。
当准备与纯化进行，解冻管含有所述在细胞沉淀suspenion一个房间-温度浴。解冻后，移到冰上。
通过超声裂解细胞。使用7 40 -小号个循环的工作循环的50％和输出8之间循环转移到冷烧杯为5分钟。
一旦超声处理完成后，旋转所述裂解物在12 ，000 ×克以去除细胞碎片。
将细胞碎片上方的上清液和粘性物质倒入 Ti 45 管中。将缓冲液 D 添加到细胞裂解液中以完全填充超速离心管。如果半满，离心管会在离心过程中变形。42,000 离心 ×克在一个钛45转子55分钟。丢弃上清液。
使用15 -毫升Dounce匀浆以均化的膜沉淀直到该悬浮液为tan /粉红色和均匀。添加足够的 10% DDM，使最终 DDM 浓度为 1%。设置在 4 ° C 下翻滚1 小时。
将匀浆液在 Ti 45 转子中以42,000 × g离心 45 分钟，以沉淀完整的膜。用缓冲液 E 完全填满管子。
为离子交换色谱y准备一根SP Sepharose 柱。用五列体积的缓冲液 E平衡。
将上清液加载到柱子上。完成后，收集流通股并重新加载。
用十倍柱体积的缓冲液 E 清洗树脂。
洗脱随浓度增加小号通过增加氯化钠的收集3缓冲F的百分比-米升馏分。
在 15% SDS-PAGE 凝胶上运行所有分数（图 3）以检查SecYEG的存在。池包含馏分一个SecYEG的显著量与一污染物的最小量。

图 3. IEC 对 SecYEG 的纯化。SecYEG（在 SecY 的 N 端带有 His6 标签）在大肠杆菌中表达。由于在此异源三聚膜蛋白复合物相对低的表达水平，所述蛋白质没有在总细胞裂解物（显而易见的大号ANE 1，顶部凝胶），但所用的洗脱级分被识别（大号ANES 10 - 13，底部凝胶）。大号ANE 1：全细胞裂解物。大号ANE 2：沉淀。大号ANE 3：均质化膜。第4 行：输入。第5 道：流通。大号ANE 6：洗涤。大号ANES 7 - 18：洗脱物

代替2-毫升再生Ni-NTA琼脂糖树脂成50 -毫升Falcon管中。处理如下：1)用 2 ml 100 mM EDTA pH 8、500 mM NaCl剥离；2) 用 10 ml H 2 O洗涤；3) 用 4 ml 6M 盐酸胍洗涤；4) 用 10 ml H 2 O洗涤；和5) 再充入 2 ml 100 mM NiSO 4 。在每一步之间，以 3 , 000 × g 的速度旋转2 分钟并倾析出洗涤液。
树脂转移到一个50 -毫升Falcon管中，填充的DDH的管2 O，充分混合，并旋转，在3 ，000 ×克2分钟。倒出洗涤液。再重复洗涤两次。
平衡与洗涤树脂缓冲液G中相同的方式如与水。
制备5-毫升4M股票我在水和pH溶液咪唑的用浓HCl至pH 7.4。4°C 避光保存。
将足够的 4 M 咪唑添加到合并的 SecYEG 级分中，以获得 20 mM 的最终咪唑浓度。混合的级分SecYEG与树脂和地点一个在4℃下3小时章动器。将珠子/蛋白质混合物以 3,000 × g旋转5 分钟。保存流通 (FT)。
向树脂中加入 20 ml Buffer G，轻轻搅拌 15 分钟。如上旋转并保存洗涤液 (W 1 )。
将树脂与 7 ml Buffer G 混合并转移到 Poly-Prep 色谱柱中。使树脂沉降，并且收集的洗涤（W2）。
使用缓冲液 H 将SecYEG 分为 5 个 1 - ml 级分，如下所示：将 1ml 洗脱缓冲液加入含有缓冲液 G 的树脂中，并通过重力 (E1)收集整个 1 - ml。再重复四次 (E2-E5)。
在 15% SDS-PAGE 上运行 FT、W 和 E1-E5（图 4）。合并含有馏份一个纯SecYEG的显著量。

图 4. IMAC 对 SecYEG 的纯化。IEC 中的eulate 由 IMAC 分开。通道 1：IMAC 输入。泳道 2：FT 。泳道3 - 4：W1和W2 。车道 5 - 9：E1-E5。

使用 10,000 MW 截止透析管对 1 L 缓冲液 I 进行透析过夜。在 4°C 温和搅拌下进行透析。
使用 50,000 MW 截止 Amicon 过滤器浓缩至约 60 μ M SecY 2 E 2 G 2 。拌匀确定的使用摩尔吸收浓度。不专心的蛋白大于80 μ米决赛浓度二聚体。
pOA-mDHFR-p86的纯化
转化菌株MM52（含有温度-敏感SecA的等位基因的是有条件地致死）与POA-mDHFR -p86质粒。
用一个菌落接种 1 L LB-Amp，并在 30°C 下培养过夜。达到0.5的 OD 600后，将温度提高到 37°C。
通过在 37°C 下添加 1 mM IPTG 来诱导蛋白质表达。
生长 4 小时后，收获细胞并用冷缓冲液 J洗涤。
（10分钟，10裂解细胞在缓冲液说明使用超声-脉冲S，50％的占空比）。
收集的包涵体在3 ，000 ×克。
将包涵体溶解在 9 ml Buffer L 中。
通过离心澄清的在225000样品×克在25℃下。
通过用 10 ml 洗涤平衡两个 HiTrap Q Sepharose Fast Flow 色谱柱：1) 水；2) 缓冲液 L ; 3) 缓冲器 M ; 4) 缓冲液 L 。
将上清液通过柱子并以1- ml 级分收集流出液。
运行在SDS-PAGE凝胶的所有样品，以评估所述浓度和纯度（图5）。

图 5. 从包涵体中纯化 pOA-mDHFR-p86。融合蛋白 pOA-mDHFR-p86 在 SecA 缺陷细胞中表达并在包涵体中积累。泳道 1：总细胞裂解物。泳道2：上清液。泳道3：溶解的包涵体。泳道4 - 9：POA-mDHFR的量增加阴离子后得到-交换色谱法（100毫微克，300毫微克，500毫微克，700纳克，1微克，6微克）。

在液体 N 2 中沉淀、分装和冷冻蛋白质。
11S的纯化
用含有 11 S的质粒转化BL21 (DE3)并将细胞铺在 LB-agar Amp 板上。一夜之间培养殖民地。
Innoculate 1升LB -安培（100 μ克/ ml）与10个从菌落的过夜板。在 37°C、225 rpm 下摇动。
诱导蛋白质表达与一个在37℃下0.2％阿拉伯糖的终浓度时的OD 600中游小号0.4 - 0.6。
在 37°C 诱导后 4 小时收获细胞。
在缓冲液 J 中使用超声处理溶解细胞，其中含有一种溶解的片剂蛋白酶抑制剂混合物。使用7 40 -小号个循环的工作循环的50％和输出8之间循环转移到冷烧杯为5分钟。
以 20,000 × g ，4°C离心裂解细胞以去除细胞碎片。
加载的澄清的上清液到一个5 -用缓冲液N.在缓冲液J.洗脱蛋白毫升的HisTrap柱
运行的上馏分一个12％SDS-PAGE凝胶（图6）。汇集了干净的分数。

图 6. 11S 的Ni-NTA 纯化。泳道 1：全细胞裂解液。泳道 2：澄清的细胞裂解物。泳道 3：流通。泳道小号4 - 8：50mM的咪唑洗涤。车道小号9 - 11：300mM的咪唑洗涤。

添加 1:1000 Ulp1 并在冰上孵育 1.5 小时以实现 His-SUMO 裂解。
使用反向 Ni-NTA 亲和色谱分离 His-SUMO。收集流通部分和咪唑洗涤液。
运行的上馏分一个12％SDS-PAGE，以验证除去所述的His-SUMO标记（图7）。池的干净的级分并浓缩至100 μ中号。分装蛋白质并在液氮2 中快速冷冻。

图 7. 11S 的反向 Ni-NTA 纯化。弄小号1-7：流通液（后ULP1消化）。弄小号8-10：先后用300毫米咪唑。

净化 GST-dark
在 LB-琼脂 Amp 板上用含有 11 S 和板细胞的质粒转化BL21 (DE3) 。一夜之间培养殖民地。
Innoculate 1升LB -安培（100微克/ ml）与10个从菌落的过夜板。在 37°C，225 × g下摇动。
诱导蛋白质表达与一个在37℃下0.2％阿拉伯糖的终浓度时的OD 600中游小号0.4 - 0.6。
在 37°C 诱导后 4 小时收获细胞。
在缓冲液 J 中使用超声处理溶解细胞，其中含有一种溶解的片剂蛋白酶抑制剂混合物。使用7 40 -小号个循环的工作循环的50％和输出8之间循环转移到冷烧杯为5分钟。
以 20,000 × g 、4 °C离心裂解细胞以去除细胞碎片。
加载的澄清的上清液到一个5 -用缓冲液N.在缓冲液J.洗脱蛋白毫升的HisTrap柱
运行的上馏分一个12％SDS-PAGE凝胶（图8）。汇集了干净的分数。

图 8. GST-dark 的纯化。泳道 1：全细胞裂解液。泳道 2、3：裂解上清液和沉淀。泳道4 - 6：100mM咪唑洗涤。泳道7 - 9：洗脱用300mM咪唑。

加入1：1 ，000 ULP1和在冰上孵育1.5小时以实现的His-SUMO裂解。
使用反向 Ni-NTA 亲和色谱分离 His-SUMO。
运行的上馏分一个12％SDS-PAGE凝胶。池的干净的级分（图9）。

图 9. GST-dark 的纯化。泳道 1：His-SUMO-GST-dark（在第一个 NiNTA 柱后洗脱）。泳道 2: His-SUMO-GST-dark, Ulp1-digested 。泳道5 - 7：NiNTA柱的流过液。

运行的上馏分一个12％SDS-PAGE凝胶来验证除去所述的His-SUMO标记。池的干净馏分，确定所述浓度在约100 μ中号。分装蛋白质并在液氮2 中快速冷冻。

用封装的 11 S 制备 SecYEG/SecA 囊泡
200 - nm单层脂质体的制备
在温和的 N 2流下干燥10 毫克大肠杆菌极性脂质 (Avanti)，以在 13 × 100 毫米玻璃试管底部形成脂质膜。离开升ipids下过夜一个真空，以确保完全的干燥。
暂停在500脂质μ升缓冲液p来产率20毫克/毫升的最终浓度。涡旋直到脂质从玻璃管表面抬起并处于均匀悬浮状态。
制备的与挤出机一个200 -纳米过滤器根据所述制造商的协议。开始脂质挤出前，预先润湿的过滤器与挤压缓冲P11-倍。
拉伸20毫克/毫升脂质体悬浮液31倍，或直至该悬浮液从匝多云到不透明和玻璃状。光应该被反映编创造出彩虹效果。
将 SecYEG/SecA 重组为具有封装 11 S 的囊泡
根据表 1制备脂质体。不建议放大反应。相反，如果需要，可以并行进行多次重构。
表 1. SecYEG/SecA 蛋白脂质体重组的成分

制备上述的反应中，在温育后一个在室温下章动器3小时。
在5μM的单体，在SecA的5μM的二聚体，并在50 11号第SecYEG：以下列浓度添加蛋白质μ M.最终重构反应体积我š800微升。
温育1个小时，在4℃下对反应一章动器。
要去除洗涤剂，请使用 Bio-Beads SM-2 进行 4 次孵育。对于第一次温育，添加80 μ上升（干珠体积）生物珠和休假一个在4℃章动器2小时。
除去的通过抽吸从生物反应珠的样品放入一个含有另一种80个新的管μ升生物珠。离开所述上反应一个在4℃章动器4小时。
4小时后，吸出的样品放入一个含有160新管μ升生物珠。在 4°C的nutator上放置过夜。
对于最终的生物珠孵育后，吸出的样品，并添加至160 μ升生物珠。离开上一章动器2小时，在4℃。
完全吸出的从样品中生物珠和自旋向下在6 ，000 ×克5分钟，以除去任何大颗粒小号。
运行该过的Hi-制备16/60的Sephacryl S-200上清从脂蛋白体除去任何未结合的11 S上。
隔离的离心脂蛋白体以250,000 ×克为30分钟，在4℃下。
所有管都包含一个小的玻璃状颗粒。将沉淀重悬在缓冲液 P 中，使 SecYEG 最终浓度为 1 μM SecYEG。
运行在对最终脂蛋白体悬浮液一个12％SDS-PAGE凝胶，以确保该重构的脂蛋白体包含所有的感兴趣的蛋白（图10）。

图 10. SecYEG/SecA 重组为含有 11S 的蛋白脂质体。泳道小号1 - 3：纯化SecYEG蛋白（以评估所述蛋白浓度的最终产品）。泳道小号4 - 6：纯化SecA的蛋白质（以评估所述蛋白浓度的最终产品）。泳道 7：最终的脂蛋白体产物。

在液态 N 2 中快速冷冻 20 - μ l 等分试样并储存在-80°C。

氧化 pOA-mDHFR-p86 的制备
准备工作ř ë1mM的铜（II）/菲咯啉，并添加到10 μ M蛋白。轻弹的管中，在4℃下18小时以混合并孵育。
在15% SDS- PAGE凝胶上评估二硫键的形成。比较样品的run使用缓冲液包含样本荷兰国际集团还原剂VS该无。二硫键-结合蛋白将运行越往下凝胶（图11，泳道3比。泳道4）。

图 11. pOA-mDHFR-p86 的氧化通过 15% SDS-PAGE 评估。POA-mDHFR-P86与铜/菲咯啉（铜孵育2+ / pH）的催化š分子内二硫键的形成。具有更高的电泳迁移率比降低的形式，氧化pOAmDHFR-P86迁移如预期用于包含二硫环的蛋白质（泳道3比。泳道4）。泳道1：-β-ME、-Cu 2+ /菲咯啉。泳道2：+β-ME，-Cu 2+ /菲咯啉。泳道3：-β-ME，+Cu 2+ /菲咯啉。泳道4：-β-ME，+Cu 2+ /菲咯啉。

二硫化物-在液体N键接的蛋白质快速冷冻2直到需要用于易位实验并储存在-80℃。

实时易位测量
表 2显示了实时易位反应中每个组分的浓度和体积。
表2.组件的实时易位试验

要并行设置多个反应，请使用如上所示的基本组分制备 mastermix。例如，如果同时运行n –ATP 和 +ATP 样品，则准备 2.2 ×所示反应。通过加入100分裂反应μ之前升主混合物到每个孔中加入ATP。
通过将 10 nM SecYEG 蛋白脂质体与封装的 11S 与 GST-dark 在室温下孵育 10 分钟，开始建立反应。
制备的纳米-GLO ®根据活细胞测定系统基板的制造商的通过稀释在纳米-GLO设置缓冲1:20协议®活细胞测定系统试剂盒。
甲DD缓冲器Q，1nM的氧化POA-mDHFR-P86，纳米-GLO ®活细胞测定系统缓冲器，具有纳米-GLO ®基板，和水的脂蛋白体/ GST-暗反应。弗里克的轻轻管混合。转移100 μ升反应混合物到一个井的96孔板的。
添加 5 mM ATP 以开始插入和停止。对于所述-ATP控制，添加一个等体积的ħ 2 O.
P花边在板的GloMax Navigator和开始发光测定（0.25 - 2秒的积分时间）。
15 - 20 分钟后，加入 0.5 μ M GST-dark。
所述luminsence信号高原（〜30分钟）后，加入1 μ升的1M DTT，以减少二硫键，并开始易位。
继续收集 30 分钟的发光数据（图12 ）。

图1 2 。同步实时易位测量。上部的曲线示出了用于混合ATP，GST-暗后易位实验与氧化的POA-mDHFR-P86的发光记录，容纳和SecYEG / SecA的蛋白脂质体包封的11S。封闭式橙色圆圈是用来计算基于我们详细的模型拟合（黑线）的数据（见数据一nalysis）。空心橙色圆圈是由于异常高的方差而从分析中排除的数据点。发光的初始增加是由于停滞的易位底物积累时发生的副反应造成的。箭头指示增加额外的GST-暗和DTT的反应，如在所描述的过程（第d）。额外的 GST-dark 淬灭任何可在脂蛋白体外部接触的 11S 蛋白。DTT降低了底物蛋白，重新启动易位和结果荷兰国际集团的增加发光。底部的图表显示了拟合的残差。

数据分析

在下文中，我们总结了我们为分析易位动力学而开发的动力学模型。有关详细解释，我们将读者推荐给Gupta等人。( 2020 0 .

介绍
在此处描述的易位测量中，当底物蛋白的 p86 标记的 C 端易位到 SecYEG/SecA 蛋白脂质体内部并通过与 11S 结合恢复荧光素酶活性时，会产生发光。我们开发了一个动力学模型，在之前的出版物（Gupta等人，2020 年）中有详细描述，该模型考虑了易位反应过程中的以下过程：
氧化的底物蛋白与易位子结合并部分易位。底物蛋白中的二硫键环阻止了完全易位。
DTT 添加诱导二硫环打开，并恢复易位。全易位通过防止该三级结构的易位底物蛋白的mDHFR部分。
mDHFR 的展开允许易位继续。完成易位后，封装的 NanoLuc 荧光素酶会产生光。
此外，该模型还考虑了影响发光信号时间演变的不良过程：
底物蛋白š与旁路二硫化物环还原半胱氨酸失速并到达脂蛋白体的内部，产生一个DTT被加入到反应之前信号。
的副反应，其中我们术语“失能，”导致不可逆的失活和防止基板导入。
NanoLuc底物耗尽导致时间依赖性降低在光强度。
我们的模型将发光强度 I 的时间演变描述为函数
11 个参数，如 E3 部分（下文）所述。在这里，我们描述了一种全局拟合多个实验的方法。在这里讨论的案例中，展开率因实验而异，而所有实验的其他参数都相同，如前所述（Gupta等人，2020 年）。通过适当地选择全局参数，可以很容易地将分析调整到其他研究。

背景扣除和误差统计
发光读板机准同时计数样品发射的光子数A m,n和空白发射的光子数B m,n 。此处，指数m表示实验次数（实验条件不同导致展开率不同，但其他模型参数所有实验均相同，需要全局分析）。索引n以增加时间t n的顺序枚举读数。背景乙M，N是使用几乎相同的样品中获得的是含有除ATP的所有成分。由于没有 ATP 就不可能易位，因此在没有 ATP 的情况下计数的光子代表了背景。区别

表示必须由模型函数拟合的数据。由于甲M，N和乙M，N表示在统计上独立的光子计数服从泊松统计，方差估计为甲M，N等于阿M，N ，对于方差估计乙M，N等于乙M，N ，和D m,n 的方差估计可以确定为：

全局 χ 2定义
当在多个实验中获得的数据同时拟合并且一些模型参数在所有实验之间共享时，该过程代表全局拟合。在全局拟合期间，必须最小化一个表示全局拟合优度的函数。在Hamilton ( 1964) 中，已经表明，为了实现模型参数估计的最高可能精度，拟合优度函数必须等于 χ 2定义为所有数据的平方差之和模型，除以相应的方差：

其中，N S表示实验总数，N D表示每个实验的数据点数，M m,n ( α ) 表示模型函数，α表示模型参数向量。请注意，上面定义的 χ 2没有减少。减少的 χ 2有时用于表征拟合优度；它的计算公式为 χ 2 / N F ，其中N F是自由度数，N F = N S × N D ‑ N P ，N P是在拟合过程中不固定的独立模型参数的数量程序。

χ 2最小化算法
该Levenberg-Marquardt算法（马夸特，1963）是用来寻找模型参数其导致最小χ 2 。的列文伯格-马夸尔特算法在本质上是高斯-牛顿算法具有改进的能力，以收敛当用于模型参数的初始猜测α远离最小。如果模型参数α是接近于最小，第Ë Ñ的高斯-也可以使用牛顿算法; 它比 Levenberg-Marquardt 算法收敛得更快。不需要Hessian矩阵的计算算法（例如，梯度下降法）没有机会的发现荷兰国际集团与全局最小值中的问题Ñ P ≈30模型参数。的GNU科学图书馆（GSL）包含拟合基于用于加权的最小二乘多维非线性函数的列文伯格-马夸尔特算法; 这个函数对于这里描述的全局拟合是足够的。或者，可以用 C 或 FORTRAN 子程序（我们使用后者）编写自定义函数。

模型方程
该模型，中号M，N （α ），描述的发光强度的时间演变，我，作为时间，函数吨，并且模型参数，α ，

参数向量α包含一组全局参数，这些参数在所有实验之间共享，以及仅适用于一个实验的N S组局部参数。选择的这些参数是全局性这是当地依赖于实验条件。对于使用相同储备溶液并准同时进行的实验，可以合理假设描述初始试剂浓度和仪器灵敏度的参数在所有实验中应具有相同的值；这些参数被视为全局参数。如果在所有实验中应该具有相同值的参数不被视为全局参数，那么问题可能没有唯一解决方案；在这种情况下，可以通过模型参数的不同组合实现完全相同的χ 2值。
一个实验对应的参数列表：
α 1 ：ü nfolding mDHFR的速率
α 2 ：我ncapacitation率
α 3 ：中号在与被氧化的二硫化物前蛋白的OLAR分数吨= Ť 0
α 4 ：中号EAN易位时间氧化mDHFR
α 5 : 氧化 mDHFR 易位时间的 RMS 偏差
α 6 ：中号EAN易位时间减少mDHFR减去的之间的时间延迟的混合组分和启动发光测量
α 7 : mDHFR 降低的易位时间的 RMS 偏差
α 8 :氟拉嗪底物消耗率
α 9 :仪器灵敏度的S标定系数
α 10 ：- [R稀释后在发光读数elative变化（在Ť ģ ）
α 11 ：- [R稀释后在发光读数elative变化（在Ť - [R ）
在t = T 0 时，通过将蛋白脂质体与底物和 ATP 混合来建立实验。在t = T G 时，将 GST-dark 添加到反应中。在t = T R 时，将 DTT 添加到反应中。
为了计算发光强度，我们定义了函数X 1 ( t )、Y 1 ( t )、Z 1 ( t )、X 2 ( t )、Y 2 ( t ) 和Z 2 ( t )，其中下标 1和 2 分别表示在t = T 0 时被氧化和还原的底物蛋白。函数X 1 （吨）和X 2 （吨）描述的摩尔正在等待mDHFR展开并且仍然易位POA-DHFR分子的分数-主管在时间吨。功能ÿ 1 （吨）和ÿ 2 （吨）描述了公顷POA-DHFR的摩尔分数小号mDHFR展开后恢复易位。对于每个实验m ，函数X 1 ( t )、Y 1 ( t )、Z 1 ( t )、X 2 ( t )、Y 2 ( t ) 和Z 2 ( t ) 是不同的；因此，这些函数还应带有附加下标m 。为了符号简单，省略了附加下标：

功能ž 1 （吨）和Ž 2 （吨）描述POA-DHFR的那公顷的摩尔分数小号完成易位。它们计算为Y 1 ( t ) 和Y 2 ( t ) 与相应易位时间分布P n (τ) 的卷积，其中 τ 是易位时间：

必须使用离散卷积的方法对卷积进行数值计算。人们可以在 C 和 FORTRAN 中找到离散卷积的函数和子程序的各种示例。
使用P n (τ) 的高斯分布参数化给出：

发光强度与 [ Z 1 ( t )+ Z 2 ( t )] S ( t )成正比，其中S ( t ) 是时间t 时呋喃嗪底物的浓度除以T 0 时的浓度。由于酶活性导致的底物消耗可以通过以下方式描述：

这个微分方程被数值积分：

α 10和α 11考虑了测量之间检测灵敏度的稀释和变化（这可能是由于板在读板器中精确定位的微小变化造成的）。这些参数报告了第一次和第二次稀释步骤之后和之前的发光读数比率（分别在t = T G和t = T R 处）。因此，在这些时间间隔中的每一个时间间隔内的呋马嗪浓度为：

模型函数，即发光强度I ( t , α )，与已完成易位的 pOA-DHFR 总浓度乘以呋喃嗪底物浓度的乘积成正比：

从 E1 到 E9 段的方程组合代表了与实验数据全局拟合的模型函数。拟合的一个例子是图 12 中的sh own。

食谱

蛋白质纯化
SecA的纯化
缓冲液 A：50 mM HEPES-KOH pH 7.6、150 mM KOAc、10% G甘油
缓冲液 B：50 mM HEPES-KOH pH 7.6、150 mM KOAC、10% G甘油、500 mM I咪唑
SecYEG的纯化
缓冲液 C：50 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、300 mM NaCl、10% 甘油
缓冲液 D：50 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油
缓冲液 E：50 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、50 mM NaCl、10% 甘油、0.02% DDM
缓冲液 F：50 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、1 M NaCl、10% 甘油、0.02% DDM
缓冲液 G：50 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、300 mM NaCl、10% 甘油、0.02% DDM、20 mM 咪唑
缓冲液 H：50 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、300 mM NaCl、10% 甘油、0.02% DDM、300 mM 咪唑
缓冲液 I：50 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、150 mM KOAC、10 mM Mg(OAc) 2 、20% 甘油、0.02% DDM
pOA-mDHFR-p86的纯化
缓冲液 J：1 × PBS pH 7.5
缓冲液 K：10 mM Tris-HCl pH 7.0
缓冲液 L：8 M 尿素，50 mM Tris-HCl pH 7.0
缓冲液 M：8 M 尿素、50 mM Tris-HCl pH 7.0、500 mM NaCl
11S的净化
缓冲液 J：1 × PBS pH 7.5
缓冲液 N：1 × PBS pH 7.5，300 mM 咪唑
净化 GST-dark
缓冲液 J：1 × PBS，pH 7.5
缓冲液 N：1 × PBS，pH 7.5，300 mM 咪唑

用封装的 11S 制备 SecYEG/SecA 囊泡
缓冲液 P：10 mM H EPES pH 7.5，100 mM NaCl

氧化 pOA-mDHFR-p86 的制备
10 mM Cu 2+ /菲咯啉
在 20% EtOH 中制备 20 mM 1,10 菲咯啉溶液。
准备 300 mM CuSO 4溶液。
使用这些库存溶液，制备含有10 mM 1,10 phenathroline 和 30 mM Cu 2+的 20% EtOH的最终溶液

实时易位测量
缓冲液 Q：50 mM HEPES pH 8、500 mM KOAc、25 mM Mg(OAc) 2 、0.5% Prionex

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（CMK 的5R21AI133514和5R01GM121567 ，以及培训补助金 5T32GM007231）和皮尤慈善信托基金（皮尤生物医学学者计划补助金给 CMK）的支持。该协议源自 Nature Communications (Gupta et al. , 2020) 上的出版物。

参考

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