材料和试剂

消耗品
1.5 ml无菌微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-130）
0.2 µm注射器过滤器（Thermo Scientific ，Nalgene，目录号：194-2520）
显微镜载玻片（Thermo Fisher Superfrost Plus，目录号：4951PLUS4）
Kimwipes （Fisher Scientific，目录号：06-666）
矩形盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：22X60-1）
培养皿（Fisher Scientific，目录号：08-757-099）

试剂种类
焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）; DEPC是可疑的致癌物。使用DEPC时，请使用通风橱并戴上手套
Milli Q水
无核酸酶的水（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9920 ）；c在实验室中代替制备DEPC处理过的水使用（以下说明）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
注意：多聚甲醛烟雾有毒。使用多聚甲醛时，请戴上手套并使用通风橱。

10％中性缓冲福尔马林（Thermo Fisher Scientific，目录号：5705）
注意：与福尔马林一起工作时，请戴上手套并使用通风橱。

氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP3581）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
三氯乙酸钠（Fisher Scientific，目录号：AC184155000）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
注意：甲酰胺对皮肤，眼睛，鼻子和喉咙有刺激性，可能是致畸剂。与甲酰胺一起工作时，请戴手套并使用通风橱。

柠檬酸钠脱水（Fisher Scientific，目录号：S279）
肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：5516）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
注意：DAPI是潜在的致癌物。使用DAPI时请戴手套。

的Triton X-100（Fisher Scientific公司，ACROS有机物，目录号：215680010）
二甲苯（Fisher Scientific，目录号：XS-1）
注意：二甲苯会影响中枢神经系统。二甲苯蒸气是易燃的。使用该试剂时，请使用通风橱并戴上手套。

乙二胺四乙酸二钠盐脱水（Fisher Scientific，目录号：S312-500）
氢氧化钠（Fisher Scientific，目录号：S318-500）
盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144S-500）
注意：在处理浓盐酸时，请在通风橱中工作，戴上手套并格外小心。

OCT或最佳切割温度（Fisher Scientific，目录号：23-730-571）
dNTP混合物，每个10 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0192）
ELIMINase （执事实验室，目录号：1101）
聚-L-赖氨酸溶液（Sigma Aldrich，目录号：P4707）
用于细胞培养的无菌过滤水（Sigma Aldrich，目录号：W3500）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：ICN821713）

酵素
T4聚核苷酸激酶（T4 PNK）（New England Biolabs目录编号：M0201L），储存在-20 °C
胃蛋白酶（Sigma-Aldrich-Roche，目录号：10108057001），在4 °C下储存
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202T），储存在-20 °C
RNaseIN ，重组（Promega，目录号：N2511），储存在-20 °C
DNA聚合酶，Nxgen （Lucigen ，目录号：30221-2），储存在-20 ℃下
USER酶（New England Biolabs，目录号：M5508），储存在-20 °C
尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）（New England Biolabs，目录号：M0281），储存在-20 °C

试剂设置-小号EE ç orresponding [R ecipe为é阿赫[R eagent在食谱小号挠度b elow
股票小号olution ř ecipes

无核酸酶的水
3 M氯化钠（NaCl）
1 M磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）
1 M磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）
10 x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4
30％蔗糖溶液
5％吐温20
0.5％吐温20
4％多聚甲醛
1 x含0.05％Tween-20（PBST）的磷酸盐缓冲盐水
0.01 M柠檬酸
0.01 M柠檬酸钠
10％十二烷基硫酸锂（LDS）
的0.1M Hydrocholoric氯酸（HCl）
粉末状蛋白酶的胃蛋白酶原液
2 M三氯乙酸钠
0.5 M乙二胺四乙酸二钠盐脱水（EDTA）
1 M Tris pH 7.4
1 M Tris pH 8.0
20毫克/米升肝素
50％和80％甘油
20 mg / ml牛血清白蛋白（BSA）
20 x盐柠檬酸钠（SSC）pH 7.0
DAPI
阻断血清

缓冲配方

具有0.05％LDS的10 mM柠檬酸盐缓冲液
pH 8.0的TE缓冲液包含100 mM的Tris pH 8.0和10 mM的EDTA pH 8.0
杂交缓冲液
高盐缓冲液
圆杂交缓冲液
1x连接酶缓冲液
1x phi29 DNA聚合酶缓冲液
标签探针缓冲液

设备

加热块设定在37 °C
水浴温度设定为100 °C
密封室（Grace Biolabs ，Sigma，目录号：GBL621505）
激光共聚焦显微镜（我们使用Leica Sp8共聚焦显微镜获取图像）
P-2，P-10，P-20，P-200和P-1000移液器
旋转平台（跷板）
4 °C冰箱
-20 °C和-80 °C冷冻机
水浴温度设定为100 °C
杂交烤箱或加湿室设置为37 °C

软件

斐济（https://fiji.sc/）
Cell Profiler（https://cellprofiler.org/）
MATLAB（https://www.mathworks.com/products/matlab.html）

程序

探针设计，序列和模板
标记探针（与荧光团偶联的寡核苷酸）（表1）
标记探针（LP）与单链RCA扩增子内的VB条形码结合。每个LP由15-20个碱基组成，这些碱基与相应VB的条形码区域相同（因此与RCA扩增子互补）。

表1 。4通道PLISH的标记探针序列

标签探针

寡核苷酸序列

LP1m

/ 5Cy5 / ACTATACTACTCGACCTATA

LP2m

/ 5Cy3 / ACAGAACCATCAATAGCTAAGT

LP3分钟

/ 5Alex488N / ATATTGTCATCATACTAACC

LP4分钟

/ 5TEX615 / ACTTACACCACAAGAACC

一种。向供应商（例如IDT）订购100纳摩尔规模的LP ，并进行荧光团5'偶联和HPLC纯化。重悬TE脂多糖缓冲到一个储备浓度的100 μ M和储存在-20 ℃下。制备10 μ M达4个工作在无核酸酶水和存储方案℃下。

b。计划实验，以便将Cy5用于最重要的目标RNA。考虑到Cy3和Texas红色读数的重叠发射光谱，同时使用Cy3和Texas红色读数可能需要线性解混以最大程度地准确区分这两个荧光团。有关线性分解的说明，请查阅显微镜软件手册（如果有）。

C。如果您打算对一个样本中的4个以上的转录本进行PLISH，请订购带有'T'核苷酸被脱氧尿嘧啶取代的LP （表2）。这使得能够通过用户的照片的文档LPS后的酶活擦除（尿嘧啶特异性地切除试剂）（参见详细方案在步骤的C5b ，我Ñ原位杂交）。

d。一些LP在5 '或3 '末端具有额外的核苷酸，以促进荧光团的缀合和/或与USER消化方案的相容性。

表2 。迭代PLISH的标记探针序列

带脱氧尿嘧啶的标签探针

寡核苷酸序列

（与任何所需的荧光团缀合）

LP1-u

5 ' ACUAUACUACUCGACCUAUA 3 '

LP2-u

5 ' ACAGAACCAUCAAUAGCUAAGU 3 '

LP3-u

5 ' AUAUUGUCAUCAUACUAACC 3 '

LP4-u

5 ' ACUUACACCACAAGAACC 3 '

LP5-u

5 ' ACGGGUCACUCCACGUA 3 '

LP6-u

5 ' AUCUAUAUUGUGUGAA 3 '

LP7-U

5 ' ACCGUACCAAUAUGAAUA 3 '

LP8-U

5 ' AUGUGAUUAGCGCUGA 3 '

LP9-U

5 ' ACCUCCGUGCCCAGUGUA 3 '

LP10-u

5 ' AAUUCCGGCUCUCGCA 3 '

LP11-u

5 ' AGAUAAGCAGCCUCAA 3 '

LP12-u

5 ' ACUGGAAGUAAAUCCA 3 '

LP13-U

5 ' AUUUAAUAGUAUACAA 3 '

LP14-U

5 ' ACCCAUAACAAGCCACUA 3 '

LP15-u

5 ' AUACCAAAACGAACACCGUA 3 '

LP16-U

5 ' ACUGAAGGUGUAAUCAA 3 '

LP17-U

5 ' ACCCCAUCAAUUGACAUA 3 '

LP18-u

5 ' AAUAGAAGAUAUGCUA 3 '

LP19-U

5 ' AUACCCGCGGAAAAGUCAUA 3 '

LP20-u

5 ' AGUCCUCGUUACUAAA 3 '

LP21-U

5 ' AAAUCGUGCGGAUGCA 3 '

LP22-U

5 ' AUCGUCGUCGCUCCAA 3 '

LP23-U

5 ' ACCGCCUCGCCUGACAUA 3 '

LP24-u

5 ' AUAGGCGCACGGUUAGGA 3 '

圆组件
CCC2.1是通用连接器圈

CCC2.1

5 ' ATTCCTGACCT AACAAACATGCGTCTATAGTGGAGCCACATAATTA

AACCTGGCTAT 3'

（CCC2.1与所有可变桥兼容）。

与相应标签探针相同的VB条形码以粗体显示（表3）。

表3 。PLISH的可变桥序列

可变桥

寡核苷酸序列

VB01

5 ' ACTACTCGACCTATA ACC ATAACGACGTAAGT 3 '

VB02

5 ' AGTCGTCTAC ACAGAACCATCAATAGCTAAGT 3 '

VB03

5 ' ATTGTCATCATACTAACC ATTACAACCTGGT 3 '

VB04

5 ' ACTTACACCACAAGAACC TACTCGTAGTCGT 3 '

VB05

5 ' ATCTCACAAGGGGTAAC CGGGTCACTCCACGT 3 '

VB06

5 ' ATCTATATTGTGTGAA CCTGTCAGCATGTCTT 3 '

VB07

5 ' AATCTTCCATGCTGG ACCGTACCAATATGAAT 3 '

VB08

5 ' ATGTGATTAGCGCTGA CCGACCTTGTTGTCCT 3 '

VB09

5 ' ATTCTTTTCTTCATG ACCTCCGTGCCCAGTGT 3 '

VB10

5 ' AATTCCGGCTCTCGCA CCATGGGTTGTTTACT 3 '

VB11

5 ' AGATAAGCAGCCTCAA CCACTGCCTTCCGATT 3 '

VB12

5 ' ACTGGAAGTAAATCCA CCTCGGAGCTGAGACT 3 '

VB13

5 ' ATTTAATAGTATACAA CCTTTTTTCGGCCTAT 3 '

VB14

5 ' AGTGCTAGTCCATTC ACCCATAACAAGCCACT 3 '

VB15

5 ' AGTGTAGAACAGCGG ACCAAAACGAACACCGT 3 '

VB16

5 ' ACTGAAGGTGTAATCA CCAGTTTGAGTAGTCT 3 '

VB17

5 ' AAGAAAGTTCTCTTA ACCCCATCAATTGACAT 3 '

VB18

5 ' AATAGAAGATATGCTA CCATTGGCTAAAATTT 3 '

VB19

5 ' AATTGTTACAAAAAG ACCCGCGGAAAAGTCAT 3 '

VB20

5 ' AGTCCTCGTTACTA TACCTGGTTTCGCGAAGT 3 '

VB21

5 ' AAATCGTGCGGATGCA CCGGCAGGGGCCCTTT 3 '

VB22

5 ' ATCGTCGTCGCTCC TACCCAAACTTGTCGCTT 3 '

VB23

5 ' AAGTCTCGTGTATAA ACCGCCTCGCCTGACAT 3 '

VB24

5 ' AGGCGCACGGTTAGGA CCCCCGTATGTACAGT 3 '

订购100毫摩尔规模的CCC2.1和VB，作为5 '磷酸化寡核苷酸，通过HPLC纯化。制备10 μ在-20 1M母液的等分试样在无核酸酶水和存储℃下。

杂交探针设计概述
严格的探针设计对于优化转录本检测效率和最大程度降低假阳性信号的风险至关重要。一个PLISH探针组由一个右探针（HR）和一个左探针（HL）组成。每个H探针的长度约为46个碱基，具有〜20个碱基区域，该区域是靶RNA的反向互补序列。其他约26个碱基对包含一个“突出端”序列，该序列是可变桥（VB）和公共连接器圆（CCC，请参见图1 ）序列的反向互补。设计过程从国家生物技术信息中心（NCBI）核苷酸数据库中选择感兴趣的RNA转录物开始。我们通常使用https://www.genenames.org上的HUGO（人类基因组组织）基因命名委员会（HGNC）批准的基因符号来命名探针集。

首先鉴定目标转录本中可以用作霍利迪连接中心的二核苷酸，并指定周围的约40个碱基RNA序列作为候选探针位点。然后将候选探针位点序列送入NCBI基本局部比对搜索工具（BLAST），以量化与靶RNA及其转录物变体的同源性，并确定与脱靶RNA的同源性程度是否低于最小阈值（请参见下面的“脱靶同源性标准” ）。当满足特异性标准时，RNA序列在连接中心5'侧的反向互补（HL同源区域）和RNA序列在连接中心3'侧的反向互补（HR同源性）连接到适当的突出序列以产生完整的H探针。使用在线寡核苷酸计算器（请参阅步骤A 3b .xvi）分析H探针组，以确定预期连接的每个臂的熔化温度是否可接受，并排除形成发夹或二聚体的可能性。每个转录本设计了五到十个H探针对。关联的VB，CCC2.1和LP寡核苷酸与H探针一起订购。

连接中心的RNA二核苷酸序列旨在迫使霍利迪连接变成对PLISH有利的构象异构体（Miick等，1997; Eichman等，2000; Liu等，2005 ; Hays等。。，2006; Khuu等人，2006）。一般情况下，我们推荐使用RNA二核苷酸5 ' -AG-3 '或5 ' -UA-3 '在基部对20和候选探针位点21。但是，要求最佳的中央二核苷酸序列可能会过度限制短转录子的候选探针位点的数量，对此标准可以放宽。

在我们的经验中，PLISH探针设计的主要挑战涉及脱靶同源性和RNA访问，因为内源性靶RNA的三级和四级结构可能会限制某些候选探针位点的可及性。探针二聚化和发夹形成不太重要，这可能是由于在杂交缓冲液中使用了强变性剂。

w ^ ê包括已写入自动化上述步骤（MATLAB脚本小号EE附录的MATLAB文件- PLISH_Probe_Design_BLAST210.m及随附的说明“How_to_use_the_MATLAB_Probe_Design_Script.pdf” ），允许用户快速识别那些候选H-探针结合区域没有高水平的脱靶同源性。它还生成具有与特定VB条形码相对应的突出序列的H探针列表。

请注意，执行PLISH不需要MATLAB脚本。它被包括作为某些用户的潜在便利。我们建议先手动设计探针并优化整个PLISH协议，然后再进行自动化设计脚本。

使用MATLAB脚本之前，还需要其他注意事项。首先，如果将PLISH用于较少数量的基因（例如，少于10个），则手动设计探针可能比投资MATLAB脚本所需的辅助软件更有效。其次，MATLAB脚本要求用户具有NCBI BLAST搜索工具和Refseq数据库的独立或“本地”安装，这可能需要额外的计算资源。它还要求用户设置本地BLAST搜索工具和相关的Refseq数据库，以便可以在用户的操作系统（通常是Windows）中由MATLAB（和其他程序）“调用”它们。尽管我们提供了有关如何安装这些NCBI工具的基本准则，但是指导用户完成此过程超出了本协议的范围，尤其是当NCBI定期发布BLAST的更新和较新版本时。而是将用户定向到NCBI当前的在线说明和帮助资源，以同时安装搜索工具和数据库。最后，随着时间的推移，MATLAB或NCBI工具中的更新可能会使当前脚本过时。

我们的MATLAB脚本确定的候选探针与其的特异性probesite基于显著BLAST比对的比从其中所述一个其它基因的数量probesite导出。在基因组规模上对感兴趣的转录物特异的寡核苷酸探针的设计是研究的活跃领域，并且出现了新的工具。一种解决方案是OligoMiner （Beliveau等人，2018），它提供了一个基于python的管道，该管道利用了下一代测序（NGS）对齐工具（例如Bowtie2）和线性判别分析机器学习来确定靶标特异性。

如果选择使用MATLAB脚本，仍然建议用户手动验证（通过将H探针靶向的RNA序列的区域输入NCBI BLAST）以确保脱靶同源性低至可接受水平。该脚本将提供这些序列的FASTA文件，为此可以直接将其输入在线NCBI BLAST搜索查询中。

脱靶同源性的标准
执行BLAST查询时，应应用表4中概述的设置。根据我们在新协议中详细说明的杂交条件的经验，BlastN位得分大于30的比对应被认为具有显着的同源性，而与碱基对中匹配的数目或空位无关。请注意，在解析搜索结果时，仅考虑与RNA的比对（而不考虑基因组DNA）。另外，由于将目标RNA转录物序列用作BLAST查询的输入，因此仅“加/加”（而不是“加/减”）链比对是有意义的，例如，候选序列与off的比对具有“加/加”位得分为35的非目标转录本被认为具有不可接受的脱靶同源性。

注意：加号/加号与加号/减号约定：

对于每个Blast搜索，结果报告将包括2条链：查询（〜40 bp候选RNA序列）和主题（RNA转录物库数据库）。指标描述了两条链之间的对齐程度。
查询始终以5'-3'方向的“加号”链表示。
虽然主题是写在5 ' -3 '方向，BLAST会考虑比对以有义信使RNA链（“加”）和反义信使RNA链（“减”）。BLAST算法以逐个碱基的方式比较链的相似性。
对40 bp的查询序列执行BLAST查询后，单击结果页面中的“比对”选项卡将显示序列的成对比对。通常，前几个BLAST命中与目标RNA及其同工型的序列比对，同一性为– 40/40（100％），而Strand – Plus / Plus则表明与该碱基的碱基对碱基，从查询到受试者的比对感觉链。在某些后续命中（可能的脱靶RNA序列）中，链比对可以是Plus / Plus（即查询序列与有义mRNA受试者链全部或部分对齐）或Plus / Minus（即查询序列比对）（有义mRNA主题链的反向互补））。您可能会忽略具有正号/负号的匹配，因为它们与您的候选RNA序列反向互补（即，比对的主题序列与H探针序列相同，因此不会产生脱靶结合）。

表4 。用于执行NCBI Blast搜索的设置

NCBI爆炸设置

程序：

Blastn （“有点相似的序列”）

数据库：

人类基因组+成绩单

小鼠基因组+转录本

Refseq_rna

最大目标序列：

100

预期阈值：

100

字长：

7

查询范围内的最大匹配项：

0

比赛分数：

2

不匹配分数：

-3

缺口成本，存在：

5

差距成本，扩展：

2

过滤：

取消选择“低复杂度区域”

最大容许位分数：

30

mRNA的详细H探针设计方案
导航至NCBI核苷酸数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide?cmd=search）。
搜索感兴趣的成绩单。在结果页面上，首先使用右上角的菜单（例如，智人或小家鼠）按感兴趣的分类单元过滤结果，然后使用左侧边栏中的菜单按分子类型（RNA ）过滤结果。
记录预测或其他方式的转录本变体数量。为主要成绩单条目或编号最低的成绩单变量选择搜索结果。
导航至网页底部，然后检查序列（由ORIGIN表示）。将完整序列粘贴到文字处理程序文档（例如Microsoft Word）中。
使用Control-F “查找”功能来确定合适的中央二核苷酸以用于预期的霍利迪连接。如上所述，这些位点是5 ' -AG-3 '或5 ' -UA-3 ' 。
一旦找到霍利迪（Holliday）连接位点，请使用Control-C功能“复制” 40个碱基对的序列。
打开NCBI基本本地路线搜索工具网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。点击“核苷酸爆炸”按钮。
将候选序列粘贴到BlastN套件网页顶部的“输入查询序列”框中。
接下来，选择适当的数据库。对于智人或小家鼠，可以从“数据库”右侧的适当下拉菜单中选择特定物种的特定基因组+转录本数据库。对于其他物种，或用于执行局部blast查询，我们建议使用参考RNA序列（Refseq_rna ）数据库。此选项将要求用户输入机体名称或Taxid （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy在框中）旁边的生物（如，“斑马鱼” Taxid “7955”）。
在“优化”左侧的“程序选择”下，选择“有点相似的序列”或“爆炸”选项。
单击“算法参数”旁边的“ +”。
将“预期阈值”更改为100，将“字长”更改为7。“匹配”和“不匹配”得分应分别设置为2和-3，存在和扩展的差距成本应分别为+5和+2。取消选中“低复杂度”区域的复选框。最后，单击底部的BLAST按钮以运行搜索。
解析“爆炸”搜索结果页面。首先，确保感兴趣的笔录及其所有变体出现在搜索结果中。接下来，检查脱靶比对。如果比对的位得分超过30，且链结果为“ Plus / Plus ”，则候选序列具有不可接受的脱靶同源性。
1）如果存在不可接受的脱靶同源性，则应放弃候选序列，而采用替代序列。返回到步骤A3 b v。，然后尝试新的候选序列。

2）如果很有把握地知道计划染色的组织或细胞中未表达脱靶转录本，则仍可考虑将探针用于此情况。

继续按步骤A3B诉通过A3B十三。直到鉴定出5-10个候选RNA序列。
将每个候选RNA序列分成两半。碱基对1-19形成HL的靶位点，碱基对20-40形成HR的靶位点。确定两个20个碱基靶位点序列的反向互补序列，它们将分别构成HL和HR的靶同源区域。可以使用“序列按摩器”等在线工具。
分析HL和HR同源区域序列的Tm，发夹形成，自退火和3 '互补性。建议温度范围为45-65 °C 。发夹形成的可接受的deltaG值应大于-3 kcal / mol，自二聚的可接受的deltaG值应大于-10 kcal / mol。可以使用在线“ Oligo计算器”，专有软件包（例如“ Oligocalc ”（MATLAB）或在线IDT“ OligoAnalyzer ”工具）进行计算。由于H探针杂交是在变性高盐缓冲液中进行的，因此弱的自二聚化或发夹形成不一定会排除候选H探针。
在HL同源区域序列的3 '端连接有合适的左悬序列，在HR同源区域序列的5 '端连接有相应的右悬序列。
笔记：

1）在设计要一起成像的转录本探针时，必须选择在不同颜色通道中读出的VR条码。

2）对于丰富表达的转录本，至少选择5对探针，对于低表达或中等表达的转录本，至少选择10对探针。

3）在某些情况下，当使用与脱靶RNA部分同源的探针时，我们已经观察到特异性问题。目标外信号通常比目标上信号弱。某些具有部分脱靶同源性的探针可能没有问题，例如当脱靶RNA在染色组织中的表达非常低或不存在时。

4）H探针与靶RNA的同源性恰好是20个碱基，这并不是必须的。取决于序列，同源性的19-25个碱基可以提供可接受的解链温度。融化温度应至少比探针与组织样品孵育的温度高9 °C ，在此协议中，温度应为37 °C 。

5）对于初始测试实验，选择一个要染色的组织中的一个丰富的转录本（5对H探针）和一个或两个在较低水平表达的RNA（10对H探针）。选择已经知道正确表达模式的RNA（例如细胞类型标记）以帮助确定哪种条件在靶组织中提供了最佳的敏感性和特异性是最有用的。

准备H探针的单个和合并库存
将25纳摩尔量级的H探针订购为标准的脱盐寡核苷酸。将每个H探针溶于TE缓冲液（pH 8.0）中，制成100 µM储备液，并储存在-20°C下。根据为您感兴趣的转录本设计的探针对的数量，如下所述（表5-7）准备合并的储备液，并储存在-20°C下。

表5 。在可变电桥VB01的模板中，准备5 µH靶向转录本A的H对探针的10 µM合并储备液

H探针单个库存（100 µM）

制作10 µM合并库存所需的体积

合并库中每种探针的浓度

HLC2-VB01-笔录A-位置1

10微升

10微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置1

10微升

10微米

HLC2-VB01-笔录A-位置2

10微升

10微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置2

10微升

10微米

HLC2-VB01-笔录A-位置3

10微升

10微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置3

10微升

10 nM

HLC2-VB01-笔录A-位置4

10微升

10微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置4

10微升

10微米

HLC2-VB01-笔录A-位置5

10微升

10微米

HRC2-VB0I-成绩单A-位置5

10微升

10微米

总容积

100微升

表6 。准备5 µM合并储备液，以用于可变桥VB01中针对转录本A的5对以上H探针

H探针单个库存（100 µM）

制成5 µM合并的库存所需的体积

合并库中每种探针的浓度

HLC2-VB01-笔录A-位置1

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置1

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置2

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置2

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置3

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置3

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置4

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置4

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置5

5微升

5微米

HRC2-VB0I-成绩单A-位置5

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置6

5微升

5微米

HRC2-VB0I-脚本A-位置6

5微升

5微米

总容积

+ 40 µl无核酸酶的水（补足至100 µl）

表7 。准备5 µM合并的储备液，用于10对针对可变桥VB01中转录本A的H探针

H探针单个库存（100 µM）

制作5 µM合并的库存所需的体积

合并库中每种探针的浓度

HLC2-VB01-笔录A-位置1

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置1

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置2

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置2

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置3

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置3

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置4

5微升

5微米

HRC2-VB0I-笔录A-位置4

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置5

5微升

5微米

HRC2-VB0I-成绩单A-位置5

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置6

5微升

5微米

HRC2-VB0I-脚本A-位置6

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置7

5微升

5微米

HRC2-VB0I-脚本A-位置7

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置8

5微升

5微米

HRC2-VB01-笔录A-位置8

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置9

5微升

5微米

HRC2-VB01-笔录A-位置9

5微升

5微米

HLC2-VB01-笔录A-位置10

5微升

5微米

HRC2-VB0I-脚本A-位置10

5微升

5微米

总容积

100微升

设计H探头的模板
每个H探针均包含〜20个碱基同源区域，与靶RNA互补。H探针的突出端由一个与VB寡核苷酸结合的16个碱基的区域（红色突出显示）和一个与公共连接环寡核苷酸结合的11个碱基的区域（蓝色突出显示）组成（表8-10）。表9显示了用于设计H对探针的小鼠Nkx 2.1转录本上的40个核苷酸区域（表10）。

当设计ħ探针进行一轮PLISH（1-4基因）的，请参考于表8的模板。对于迭代PLISH（> 4个基因），参考到表11。

表8 。用于同时四重PLISH的H探针设计模板

荧光团

兼容的VB

H探针的设计模板

H探针的设计模板

对于Cy5

CCC2.1 + VB01

HLC2-VB01

AGGTCAGGAAT ACTTACGTCGTTATGG ：LLLLL

HRC2-VB0I

$$$$ ：TTATAGGTCGAGTAGT ATAGCCAGGTT

对于Cy3

CCC2.1 + VB02

HLC2-VB02

AGGTCAGGAAT ACTTAGCTATTGATGG ：LLLLL

HRC2-VB02

RRRR ：TTCTGTGTAGACGACT ATAGCCAGGTT

对于A488

CCC2.1 + VB03

HLC2-VB03

AGGTCAGGAA T ACCAGGTTGTAATGG ：LLLLL

HRC2-VB03

$$$$ ：TTAGTATGATGACAAT ATAGCCAGGTT

对于德州红

CCC2.1 + VB04

HLC2-VB04

AGGTCAGGAAT ACGACTACGAGTAGG ：LLLLL

HRC2-VB04

RRRR ：TTCTTGTGGTGTAAGT ATAGCCAGGTT

HLC2-VB01表示适用于CCC2.1圆和VB01的HL探头。

LLLLL和RRRRR指定〜20个基本目标同源序列的放置区域。

表9 。确定小鼠Nkx2.1转录本的候选探针位点和预期的霍利迪连接点（NCBI参考编号NM- 009385.3 ）

转发顺序

Nkx2.1-开始位置：1713

UUUAUGGUCGGACCUGGUG AG ACGUGAGAUGCGCUUGAGC

对应的反向补语

GCTCAAGCGCATCTCACGT CT CACCAGGTCCGACCATAAA

连接中心的二核苷酸（RNA序列中的AG或UA）以绿色突出显示。

表10 。设计一对靶向小鼠Nkx2.1转录本的H探针（NCBI参考编号NM- 009385.3 ）

荧光团

探针同源性区域（mRNA结合）

完整的H探针序列

对于Cy5

毫米HLC2-VB01-Nkx2.1-1713

T CACCAGGTCCGACCATAAA

AGGTCAGGAAT ACTTACGTCGTTATGG ：T CACCAGGTCCGACCATAAA

毫米HRC2-VB01-Nkx2.1-1713

GCTCAAGCGCATCTCACGT C

GCTCAAGCGCATCTCACGT C ：TTATAGGTCGAGTAGT ATAGCCAGGTT

对于Cy3

毫米HLC2-VB02-Nkx2.1-1713

T CACCAGGTCCGACCATAAA

AGGTCAGGAAT ACTTAGCTATTGATGG ：T CACCAGGTCCGACCATAAA

毫米HRC2-VB02-Nkx2.1-1713

GCTCAAGCGCATCTCACGT C

GCTCAAGCGCATCTCACGT C ：TTCTGTGTAGACGACT ATAGCCAGGTT

与连接中心互补的两个核苷酸（RNA序列中的AG或UA）以绿色突出显示。毫米，小家鼠。

表11 。迭代PLISH的H探针模板序列

VB05

ATCTCACAAGGGGTAACCGGGTCACTCCACGT

AGGTCAGGAATACGTGGAGTGACCCGG：LLLLL

RRRR：TTACCCCTTGTGAGATATAGCCAGGTT

VB06

ATCTATATTGTGTGAACCTGTCAGCATGTCTT

AGGTCAGGAATAAGACATGCTGACAGG：LLLLL

RRRR：TTCACACAATATAGATATAGCCAGGTT

VB07

AATCTTCCATGCTGGACCGTACCAATATGAAT

AGGTCAGGAATATTCATATTGGTACGG：LLLLL

RRRR：TCCAGCATGGAAGATTATAGCCAGGTT

VB08

ATGTGATTAGCGCTGACCGACCTTGTTGTCCT

AGGTCAGGAATAGGACAACAAGGTCGG：LLLLL

RRRR：TCAGCGCTAATCACATATAGCCAGGTT

VB09

ATTCTTTTCTTCATGACCTCCGTGCCCAGTGT

AGGTCAGGAATACACTGGGCACGGAGG：LLLLL

RRRR：TCATGAAGAAAAGAATATAGCCAGGTT

VB10

AATTCCGGCTCTCGCACCATGGGTTGTTTACT

AGGTCAGGAATAGTAAACAACCCATGG：LLLLL

$$$$：TGCGAGAGCCGGAATTATAGCCAGGTT

VB11

AGATAAGCAGCCTCAACCACTGCCTTCCGATT

AGGTCAGGAATAATCGGAAGGCAGTGG：LLLLL

RRRR：TTGAGGCTGCTTATCTATAGCCAGGTT

VB12

ACTGGAAGTAAATCCACCTCGGAGCTGAGACT

AGGTCAGGAATAGTCTCAGCTCCGAGG：LLLLL

RRRR：TGGATTTACTTCCAGTATAGCCAGGTT

VB13

ATTTAATAGTATACAACCTTTTTTCGGCCTAT

AGGTCAGGAATATAGGCCGAAAAAAGG：LLLLL

RRRR：TTGTATACTATTAAATATAGCCAGGTT

VB14

AGTGCTAGTCCATTCACCCATAACAAGCCACT

AGGTCAGGAATAGTGGCTTGTTATGGG：LLLLL

RRRR：TGAATGGACTAGCACTATAGCCAGGTT

VB15

AGTGTAGAACAGCGGACCAAAACGAACACCGT

AGGTCAGGAATACGGTGTTCGTTTTGG：LLLLL

$$$$：TCCGCTGTTCTACACTATAGCCAGGTT

VB16

ACTGAAGGTGTAATCACCAGTTTGAGTAGTCT

AGGTCAGGAATAGACTACTCAAACTGG：LLLLL

RRRR：TGATTACACCTTCAGTATAGCCAGGTT

VB17

AAGAAAGTTCTCTTAACCCCATCAATTGACAT

AGGTCAGGAATATGTCAATTGATGGGG：LLLLL

RRRR：TTAAGAGAACTTTCTTATAGCCAGGTT

VB18

AATAGAAGATATGCTACCATTGGCTAAAATTT

AGGTCAGGAATAAATTTTAGCCAATGG：LLLLL

RRRR：TAGCATATCTTCTATTATAGCCAGGTT

VB19

AATTGTTACAAAAAGACCCGCGGAAAAGTCAT

AGGTCAGGAATATGACTTTTCCGCGGG：LLLLL

RRRR：TCTTTTTGTAACAATTATAGCCAGGTT

VB20

AGTCCTCGTTACTATACCTGGTTTCGCGAAGT

AGGTCAGGAATACTTCGCGAAACCAGG：LLLLL

RRRR：TATAGTAACGAGGACTATAGCCAGGTT

VB21

AAATCGTGCGGATGCACCGGCAGGGGCCCTTT

AGGTCAGGAATAAAGGGCCCCTGCCGG：LLLLL

RRRR：TGCATCCGCACGATTTATAGCCAGGTT

VB22

ATCGTCGTCGCTCCTACCCAAACTTGTCGCTT

AGGTCAGGAATAAGCGACAAGTTTGGG：LLLLL

RRRR：TAGGAGCGACGACGATATAGCCAGGTT

VB23

AAGTCTCGTGTATAAACCGCCTCGCCTGACAT

AGGTCAGGAATATGTCAGGCGAGGCGG：LLLLL

RRRR：TTTATACACGAGACTTATAGCCAGGTT

VB24

AGGCGCACGGTTAGGACCCCCGTATGTACAGT

AGGTCAGGAATACTGTACATACGGGGG：LLLLL

RRRR：TCCTAACCGTGCGCCTATAGCCAGGTT

LLLLL和RRRRR指示插入〜20 bp探针序列的区域。

样品制备
在盖玻片上生长的细胞
在组织培养罩中制备聚L-赖氨酸包被的盖玻片：
短暂地用70％乙醇洗涤盖玻片，然后将其转移到无菌板中（也已用70％乙醇预洗）。
用组织培养级无菌水（无热源）冲洗一次。
将盖玻片在聚L-赖氨酸溶液中孵育20分钟。
用组织培养级无菌水冲洗两次。
吸出所有剩余的水，并使盖玻片在组织培养罩中风干10分钟。
分裂在烧瓶中生长的细胞（在组织培养罩中执行步骤）：
吸出介质并丢弃。对于中型烧瓶，请在5 ml含有1 x PBS和1 mM EDTA的溶液中洗涤一次。或者，您可以使用胰蛋白酶。
用1 ml含有1x PBS和1 mM EDTA的溶液覆盖细胞，然后在37 °C下孵育细胞2-3分钟（不超过5分钟）。轻轻敲击烧瓶，以确保细胞已分离成溶液（细胞应明显漂浮）。
将细胞至少稀释十倍至新鲜的，预热的培养基中。用新鲜培养基进行最终稀释（例如1:20），然后将细胞轻轻吸移到含有盖玻片的培养皿中，直至浸没。将培养皿移至37 °C培养箱中，细胞将沉淀在盖玻片上并粘附。生长细胞，直到达到所需的融合水平。
当细胞准备好进行分析时，用1x PBS冲洗盖玻片。在室温下，将细胞固定在3.7％甲醛（使用37％分子生物学级甲醛的1x PBS中制备）中固定20分钟。
在70 °C下用10 mM柠檬酸pH 6.0 + 0.05％LDS对盖玻片进行预处理，持续30分钟，然后风干（〜5分钟）。
涂上密封腔。继续进行H探针杂交步骤。
在Superfrost玻璃载玻片上收集的组织切片
从OCT嵌入式冷冻块或多聚甲醛（PFA）固定组织的石蜡块中准备切片。要冷冻成年小鼠的肺，将其浸入4％PFA中，并在1 °C PBS，5 mM EDTA和10 mM柠檬酸盐中于4 °C浸泡过夜。固定后，将肺部转移到30％蔗糖溶液中，该溶液在含5 mM EDTA和10 mM柠檬酸盐的1x PBS中制备，然后在4 °C下孵育过夜。将肺部嵌入OCT中，将其冷冻，然后将冷冻块保存在-80 °C下。

对于OCT块：剪切14 μ M个区间，并收集在清洁的Superfrost载玻片上。风干5-10分钟，然后进行样品处理步骤。
对于FFPE样品：剪切10 μ中号石蜡切片，并收集它们放在干净的Superfrost载玻片上。风干切片30分钟，然后在60 °C下烘烤1小时。要进行脱蜡，将其两次浸入二甲苯中两次，每次5分钟。浸入100％乙醇两次，每次5分钟；风干幻灯片5分钟。在分级的乙醇系列（80％乙醇，50％乙醇，然后1x PBS，每次5分钟）中重新水化切片。继续进行样品处理步骤。
在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上收集组织切片
收集盖玻片上的组织切片有助于重复进行标签-图像擦除循环，因为不必在每次循环成像时都需要取下密封腔（使用载玻片时就是这种情况）。
成像后，可通过USER酶擦除LP（请参见步骤C5bf或操作规程），然后将标本与一组新的LP一起孵育以成像另一个转录本子集。
用70％的乙醇洗涤盖玻片2分钟，然后用无核酸酶的水冲洗。轻轻摇动，用聚-L-赖氨酸溶液将干净的盖玻片孵育20分钟（溶液应均匀涂在盖玻片上），除去多余的溶液并风干盖玻片10分钟或直到所有水分蒸发为止。存放盖玻片，防止灰尘进入。
收集在聚-L-赖氨酸涂层的盖玻片上的组织切片。在室温下风干5分钟。在37 °C下烘烤盖玻片15-30分钟，以使组织牢固粘附。继续进行样品处理步骤（图2）。
注意：准备用于PLISH的组织样本时，请考虑以下事项。

固定之前，修剪每个薄纸片，使其尺寸不超过10毫米。
在收集过程中，立即将组织转移到固定液中以最大程度地减少RNA降解。
对于细胞，仅执行样品预处理小号TEP 1.跳过样品预处理小号TEP 2 。
所有试剂均应使用无核酸酶的水制备。保持一个清洁的工作区域，并使用ELIMINase减少细胞或组织的暴露风险RN一个SES。

成年小鼠肺的样品处理
样品处理步骤1：在无核酸酶的水中制备10 mM柠檬酸盐pH 6.0 + 0.05％LDS，倒入玻片瓶中。将该缓冲液在100°C的水浴中预热5分钟。将风干的玻片放入广口瓶中，并在100°C下孵育5分钟。使用镊子将载玻片转移到装有无核酸酶水的广口瓶中。提起冲洗，然后将载玻片重新浸入水中4次。风干载玻片10分钟。使用Kimwipe去除多余的水分。在组织上盖上密封腔。在进行下一步之前，先用无核酸酶的水复水切片1分钟。每个密封腔可容纳约50 µl的体积（图2）。
样品处理步骤2：准备0.025 mg / ml胃蛋白酶（在0.1 M HCl中）。将此溶液添加到密封室孔中，并在37°C的加湿室中孵育5分钟。快速除去胃蛋白酶溶液，并加入1x PBS灭活残留的胃蛋白酶（图2）。进行H探针杂交。

图2 。PLISH样品制备方案的概述。将新鲜的组织样本切成小块（用于固定液的完全渗透），然后快速固定。然后将这些组织用于制备OCT嵌入的冷冻块或福尔马林固定的石蜡嵌入（FFPE）块。将这些块的切片收集在Superfrost载玻片上，进行脱石蜡处理（如果需要），通过在10 mM柠檬酸盐缓冲液中于100°C煮沸进行去交联，然后使用胃蛋白酶进行蛋白水解和H探针杂交。固定在盖玻片或载玻片上生长的细胞，通过在100°C的10mM柠檬酸盐缓冲液中煮沸进行去交联，然后杂交H探针。

注意：所提供的样品处理针对14 µm成年小鼠肺冷冻切片进行了优化，但是根据我们的经验，每个组织都需要定制的治疗方案，具体取决于研究的组织，固定和包埋条件以及来源物种。使用以下准则确定最适合您的组织的最佳样品处理条件（表12；图3）。请注意，组织的厚度也会影响PLISH的性能，因此，如果最初的试验不够理想，您可能希望凭经验测试改变切片厚度的效果。

表12 。确定感兴趣组织的固定冷冻或FFPE样品最佳预处理的建议条件范围

预处理条件

预热的10 mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0 + 0.05％LDS

0.1 M，0.1、0.05或0.025 mg / ml胃蛋白酶

1个

100 °C 5分钟

没有

2

100 °C 5分钟

37 °C 5分钟

3

100 °C 5分钟

37 °C 10分钟

4

100 °C 5分钟

37 °C 20分钟

5

100 °C 5分钟

37 °C 30分钟

6

没有

37 °C 5分钟

7

没有

37 °C 10分钟

8

没有

37 °C 20分钟

9

没有

37 °C 30分钟

图3.利用指南确定正常人肺FFPE切片的最佳预处理条件。AF，10个μ米正常人肺的FFPE切片进行处理用于PLISH。遵循表12中提到的样品预处理指南，并使用Cy5共轭标记探针进行PLISH检测人表面活性剂蛋白C（SFTPC，红色）。将样品（AF）在含有0.05％LDS的10mM柠檬酸盐缓冲液中于100°C煮沸5分钟。随后不进行胃蛋白酶处理（A）或在37°C（BF）下消化5、10、20、30和40分钟的胃蛋白酶（0.1 mg / ml，在0.1 M HCl中）。AC显示对SFTPC的弱检测。D显示最大SFTPC检测量，指示最佳预处理条件。E和F由于过度的蛋白水解消化导致RNA丢失，显示SFTPC信号减弱。DAPI，蓝色。规模，50 μ米。图像是在Leica Sp8共焦显微镜上使用633 nm激光（激光功率为10％； PMT检测器增益为750 V，偏移为–0.5％）和25倍的水浸物镜采集的。

原位杂交
下面的示例显示如何对2个成绩单执行PLISH。笔录A具有5对H探针，旨在与VB01桥和LP1标签探针一起使用。转录本B具有10对H探针，旨在与VB02桥和LP2标签探针一起使用。

H探针杂交（表13）
如果使用5对H探针靶向目标转录物（如表5中所述），则杂交反应中每种探针的最终浓度应为100 nM。如果使用5对以上，则杂交反应中每个H探针的终浓度应为50 nM。因此，对于转录物A（使用5对H探针或总共10个探针作为靶标），合并的储备液为10 µM（表5），杂交反应中每个H探针的终浓度为100 nM ，总终浓度靶向转录本A的所有H探针的总数为1,000 nM （100 nM x 10探针= 1,000 nM ）。对于转录本B（使用10对H探针或总共20个探针作为靶标），合并的储备液为5 µM（表7），杂交反应中每个H探针的终浓度为50 nM ，所有终浓度为靶向转录本B的H探针为1,000 nM （50 nM x 20探针= 1,000 nM ）。

表13 。带有针对转录本A和转录本B的探针的杂交缓冲液

1反应

反应成分

49 μ升

杂交缓冲液

0.5 μ升

10 μ M在VB01模板汇集ħ探针的股票（转录物A具有5探针对）

0.5 μ升

在VB02模板中合并了5 µ M的H探针储备（转录本B有10个探针对）

将带有探针的杂交缓冲液添加到样品中，并在37 °C的潮湿箱中孵育2小时。洗涤四次，在37每次5分钟在预温的杂交缓冲液℃下，随后是一个洗涤10分钟，用预热的高盐缓冲液中在37 ℃下。

装配圆形零件（表14）
使用每个磷酸化的寡核苷酸（CCC2.1和每个VB）的终浓度为100 nM。

表14.带有磷酸化环和桥寡核苷酸的环杂交缓冲液

1反应

反应成分

1.0 μ升

5 ′磷酸化的CCC2.1

0.5 μ升

5 '磷酸化VB01（从10只μ中号股票）

0.5 μ升

5 '磷酸化VB02（从10只μ中号股票）

47 μ升

圆杂交缓冲液

向样品中加入含磷酸化VB和CCC2.1的圆形杂交缓冲液，并在37 °C的潮湿箱中孵育60分钟。在预热的圆形杂交缓冲液中于37 °C洗涤两次，每次5分钟。在预热的1 x连接酶缓冲液中于37 °C洗涤2分钟。

连接反应（表15）

表15. T4 DNA连接酶反应混合物

1反应

反应成分

0.25 μ升

T4 DNA连接酶

1.0 μ升

BSA（20毫克/米升）

0.5 μ升

核糖核酸酶

5.0 μ升

具有10 mM ATP的10 x连接酶缓冲液

4.17 μ升

3 M氯化钠

0.5 μ升

0.5％吐温20

38.58 μ升

无核酸酶的水

将连接反应混合物添加到样品中，并在37 °C的潮湿箱中孵育2小时。在预热的圆形杂交缓冲液中于37 °C洗涤两次，每次5分钟。在37 °C下用预热的1x phi29 DNA聚合酶缓冲液洗涤2分钟。

滚环扩增（RCA）反应（表16）

表16.滚环扩增反应混合物

1反应

反应成分

5.0 μ升

phi29 DNA聚合酶

5.0 μ升

10 x phi29 DNA聚合酶缓冲液

5.0 μ升

50％甘油

1.25 μ升

dTTP，dATP ，dGTP和dCTP各含10 mM的混合物

1.0 μ升

BSA（20毫克/米升）

0.5 μ升

核糖核酸酶

32.25 μ升

无核酸酶的水

将RCA反应混合物添加到样品中，并在37 °C的潮湿箱中孵育过夜。在预热的标记探针杂交缓冲液中于37 °C洗涤两次，每次5分钟。

标签探针杂交（表17）
使用最终浓度为100 nM的标记探针。

表17.标记探针杂交混合物

1个

反应成分

49.5 μ升

标签探针杂交缓冲液

0.5 μ升

10 µ M LP1-Cy5

0.5 μ升

10 µ M LP2-Cy3

将标记探针添加到样品中，并在37 °C的潮湿箱中孵育30分钟。从这一点出发，该协议分为三个可能的步骤，具体取决于实验设计。

如果没有额外的染色计划
将样品在PBST中洗涤两次，每次5分钟，然后与PBS中的DAPI一起孵育5分钟（DAPI储备液为1 mg / ml；将储备液以1x PBS稀释为1：1,000，以制备工作溶液）。剥去密封腔，如果使用水物镜，则将样品安装在1x PBS中，如果使用甘油物镜，则将样品安装在80％甘油中。

如果进行额外的轮次标记探针杂交以进行迭代PLISH
将样品在PBST中洗涤两次，每次5分钟，然后与DAPI的PBS溶液一起孵育5分钟（DAPI的储备液为1 mg / ml； 1x PBS中的稀释的储备液为1：1,000，以制备工作溶液）。使样品在PBS中成像。在对标记的转录物进行照片记录后，如下文所述进行酶促清除标记探针。

用户摘要（表18）

表18.用户消化组合

1倍

反应成分

44 μ升

无核酸酶的水

5 μ升

10x Cutsmart缓冲区

1 μ升

用户酶

在37°C的潮湿箱中孵育20分钟。在PBST中两次洗涤样品两次，每次5分钟。

UDG（尿嘧啶DNA糖基化酶）抑制作用（表19）

表19.尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂反应混合物

1倍

反应成分

42 μ升

无核酸酶的水

5 μ升

10 x UDG缓冲区

3 μ升

尿嘧啶糖基化酶抑制剂

将样品在37 °C的潮湿箱中孵育20分钟，然后除去消化液，并在标记探针缓冲液中添加下一轮LP。在湿箱中于37 °C孵育30分钟。

注意：如果执行一个以上的标记图像擦除循环，我们建议在RCA反应步骤之后使用4％多聚甲醛在室温下固定样品10分钟，然后在1x PBS中清洗两次，每次5分钟。

如果同时进行PLISH和免疫组化：
将5 mM EDTA添加到用于免疫组织化学步骤的所有溶液中。标记探针杂交后，在室温下两次洗涤样品两次，每次5分钟。添加封闭溶液（50 μ升/毫升血清，1 μ升/毫升的Triton X-100和0.03微克/毫升BSA于PBS中）孵育在室温下轻轻摇动1个小时。除去封闭溶液并添加一抗（在封闭溶液中稀释）。将样品在室温下孵育2小时，或在4 °C下温和摇动过夜。

室温下在PBST中将样品洗涤四次，每次5分钟。加入二抗（在封闭液中稀释），并在室温下轻轻摇动孵育1小时。室温下在PBST中将样品洗涤四次，每次5分钟，然后在室温下与DAPI在PBS中一起孵育5分钟。剥离密封室，如果使用水镜，将样品安装在1 x PBS中，如果使用甘油镜，则将样品安装在80％甘油中。

如果您打算存储样本以供以后成像，请在边缘上用一层薄薄的透明密封胶密封盖玻片，并在室温下的暗室中完全干燥。将载玻片在4 °C下存放在避光的载玻片盒中。

数据分析

有关数据分析的详细信息，请参阅原始文章（Nagendran et al。，2018）。

原始PLISH协议的修改

1）缓冲液：杂交缓冲液包含去污剂十二烷基硫酸锂（LDS）。H探针杂交后，所有洗涤均在37 °C下进行，并在高盐缓冲液洗涤步骤中进行以提高严格性。将环和桥寡核苷酸添加到20％甲酰胺和2x具有LDS的SSC缓冲液中。

2）由于已发布版本中使用的圆的性能变化（CC06的性能很好，而CC03和CC01的性能相对较差），我们实现了CC06的修改版本，以用作公共连接器圈子（在此称为CCC2）。 1），并将条形码并入桥寡核苷酸（在此称为VB）。结果，新协议中的所有寡核苷酸序列都与原始出版物中的不同。新协议利用24个独特的可变桥进行迭代（标记图像擦除）多路复用实验。这种修改消除了对每个连接器圈进行前期测试的需要，与桥相比，该测试更容易改变性能。

3）我们增加了用于选择探针位点的标准的严格性，以最大程度地降低与具有部分序列同源性的脱靶转录本交叉杂交的风险。

菜谱

股票小号olution ř ecipes

1.无核酸酶的水

将1毫升的焦碳酸二乙酯（DEPC）添加到玻璃瓶中的1升Milli-Q水中
盖紧盖子，并颠倒或摇动瓶子几次，使其充分混合
将瓶子放在黑暗的房间里过夜
在液体循环中高压灭菌30分钟以使DEPC失活
室温保存
2. 3 M氯化钠（NaCl）

将17.53 g氯化钠溶于100 ml无核酸酶的水中
拌匀
在液体循环中高压灭菌30分钟
室温保存
3. 1 M磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）

将141.96 g Na 2 HPO 4溶解在1,000 ml无核酸酶的水中
拌匀
室温保存
4. 1 M磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）

将119.98 g Na 2 HPO 4溶解在1,000 ml无核酸酶的水中
拌匀
室温保存
5. 10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）

10x PBS包含1.5 M NaCl和100 mM NaPO 4 （pH 6.8）

要制作10倍PBS中的1,000：

混合500毫升3 M氯化钠
46.3毫升1 M Na 2 HPO 4
53.7毫升1 M NaH 2 PO 4
用无核酸酶的水补足至1000 ml
在液体循环中高压灭菌30分钟
稀释至1倍时，溶液的pH值为7.4

室温保存

6. 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4

在90毫升无核酸酶的水中稀释10毫升10x PBS
室温保存
7. 30％蔗糖溶液

将30 g蔗糖溶于100 ml 1 x PBS中。
拌匀
制成10毫升等分试样，并在-20°C下储存
8. 5％吐温20

在10 ml无核酸酶的水中加入500 µl Tween-20
彻底混合直至完全溶解
室温保存
9. 0. 5％Tween-20

加入1 ，00 0的微升5％Tween-20的10毫升无核酸酶水
彻底混合直至完全溶解
室温保存
10. 4％多聚甲醛

将40克低聚甲醛添加到500毫升无核酸酶的水中
加入NaOH沉淀，并在约60°C的加热块上轻轻搅拌直至多聚甲醛溶解
加入100毫升的10x PBS，让混合物冷却至室温
用HCl将pH调节至7.4，然后用无核酸酶的水将最终体积调节至1,000 ml
等分试样在-20°C下存放几个月。避免反复冻结/解冻
注意：制备多聚甲醛时，请戴上手套，在通风橱中工作，并格外小心。

11. 1x磷酸盐缓冲盐水，含0.05％Tween-20（PBST）

将100 µl的5％Tween-20溶于10 ml 1x PBS中
室温保存
12. 0.01 M柠檬酸

将1.92克柠檬酸溶于1,000毫升无核酸酶的水中
在液体循环中高压灭菌30分钟
室温保存
13. 0.01 M柠檬酸钠

将2.58 g柠檬酸钠溶解在1,000 ml无核酸酶的水中
在液体循环中高压灭菌30分钟
室温保存
14. 10％十二烷基硫酸锂（LDS）

将1克十二烷基硫酸锂溶解在10毫升无核酸酶的水中
使用0.2 µm注射器过滤器对过滤器进行灭菌
室温保存
15. 0.1M的Hydrocholoric氯酸（HCl）

将817 µl浓盐酸（10 N）加入100 ml无核酸酶的水中
室温保存
注意：戴上手套，在处理集中在通风橱和锻炼非常谨慎的工作Hydrocholoric酸。

16.粉末状酶的胃蛋白酶原液

在1.5 ml微量离心管中称取1 mg胃蛋白酶
加入1 ml的0.1 M HCl，充分混合
这是1 mg / ml胃蛋白酶储液
在0.1 M HCl中稀释至所需浓度，例如1:10（在900 µl 0.1M HCl中为100 µl储备液），以制成0.1 mg / ml胃蛋白酶工作液。立即使用，然后丢弃剩余的工作和储备溶液
或者，您可以准备10 mg / ml的胃蛋白酶甘油溶液，并储存在-20°C下。如果需要，可在0.1 M HCl中将该储备液稀释至所需浓度。

注意：胃蛋白酶活性在制造的批次之间可能有所不同，因此建议您在收到新批次时测试酶的性能。一些PLISH用户还成功使用了蛋白酶K。

17. 2 M三氯乙酸钠

将185.37 g三氯乙酸钠溶于500 ml无核酸酶的水中
在液体循环中高压灭菌30分钟
室温保存
18. 0.5 M乙二胺四乙酸二钠盐脱水（EDTA）

试剂

所需金额

EDTA，二钠盐

9.3克

氢氧化钠颗粒

约1g

无核酸酶的水

约50ml

在搅拌下将EDTA加入约45毫升无核酸酶的水中。监测pH值，并在搅拌下缓慢加入1或2个氢氧化钠小丸，直到pH达到8.0。补足到50毫升。使用0.2 µm注射器过滤器对过滤器进行灭菌。存放在室温下。

19. 1 M Tris pH 7.4

试剂

所需金额

特里斯基地

12.114克

浓盐酸

7-8毫升

无核酸酶的水

约100ml

在搅拌下，将Tris Base加入约85 ml无核酸酶的水中。监控pH值，并在搅拌下缓慢加入浓盐酸，直到pH值达到7.4。补足到100毫升。拌匀在液体循环中高压灭菌30分钟。存放在室温下。

20. 1 M Tris pH 8.0

试剂

所需金额

特里斯基地

12.114克

浓盐酸

7-8毫升

无核酸酶的水

约100ml

在搅拌下，将Tris Base加入约85 ml无核酸酶的水中。监测pH值，并在搅拌下缓慢加入浓盐酸直至pH值达到8.0。补足到100毫升。拌匀在液体循环中高压灭菌30分钟。室温保存。

21. 20毫克/毫升肝素

将0.2克肝素钠盐溶解在10毫升无核酸酶的水中
拌匀
使用0.2 µm注射器过滤器对过滤器进行灭菌
分装并储存在-20°C
22. 50％和80％甘油

将25 ml甘油添加到25 ml无核酸酶的水中（对于50％）或8 ml甘油添加到2 ml 1x PBS（对于80％）
充分混合直至溶解
室温保存
23. 20毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）

将0.2 g牛血清白蛋白溶解在10 ml无核酸酶的水中
拌匀
使用0.2 µm注射器过滤器对过滤器进行灭菌
分装并储存在-20°C
24. 20x盐水柠檬酸钠（SSC）pH 7.0

20x SSC在0.3 M柠檬酸钠中包含3 M氯化钠

试剂

所需金额

氯化钠

17.53克

柠檬酸钠

8.82克

无核酸酶的水

约100ml

将氯化钠和柠檬酸钠添加到80毫升无核酸酶的水中。监测pH值，并在搅拌下缓慢加入浓盐酸直至pH值达到7.0。补足到100毫升。拌匀在液体循环中高压灭菌30分钟。室温保存

25. DAPI

储备溶液：

将1 mg DAPI溶于1 ml二甲基亚砜（DMSO）。-20°C避光保存

工作方案：

将10 µl的原液溶于10 ml的1x PBS中。拌匀取等分试样并在4°C的光照下储存

预防

戴着手套在通风橱中小心处理DMSO

26.阻断血清

封闭血清在1x PBS中包含5％血清，0.1％Triton X-100、5 mM EDTA和3％BSA

要制成10毫升封闭血清，请将0.3克BSA放入15毫升试管中。加入10毫升无核酸酶的水。彻底混合。加入10 µl Triton X-100、100 µl 0.5 M EDTA和500 µl血清。拌匀总是准备新鲜

缓冲配方

1.具有0.05％LDS的10 mM柠檬酸盐缓冲液

将0.01 M柠檬酸钠与0.01 M柠檬酸按体积比1：4混合。充分混合并使用HCl将pH调节至6.0。室温保存。

2. pH 8.0的TE缓冲液包含100 mM的Tris pH 8.0和10 mM的EDTA pH 8.0

储备溶液

所需数量

1 M Tris pH 8.0

10毫升

0.5 M EDTA pH 8.0

2毫升

无核酸酶的水

补液至100毫升

充分混合并在室温下储存。

3.杂交缓冲液

Ç ontains 1M的钠三氯乙酸，5mM的EDTA，50毫摩尔Tris pH值7.4 ，0.2mg / ml的肝素和0.1％LDS

储备溶液

所需数量

2 M三氯乙酸钠

500毫升

50万EDTA

10毫升

1 M Tris pH 7.4

50毫升

无核酸酶的水

补水至1,000毫升

充分混合并在室温下储存。开始PLISH染色时，取所需体积的缓冲液，添加肝素（终浓度– 0.2 mg / ml）和LDS（终浓度0.1％）。拌匀

注意：LDS在室温下不能完全溶解在该缓冲液中。在37°C的水浴或烤箱中加热缓冲液，以确保LDS完全溶解。将该缓冲液保持在37°C以避免沉淀。

4.高盐缓冲液

C在不含核酸酶的水中含0.25 M NaCl，50 mM Tris pH 7.4、2 mM EDTA，0.1％LDS

储备溶液

所需数量

3 M氯化钠

83.33毫升

1 M Tris pH 7.4

50毫升

50万EDTA

10毫升

10％LDS

10毫升

无核酸酶的水

补水至1,000毫升

充分混合并在室温下储存

5.圆杂交缓冲液

C在不含核酸酶的水中含2x SSC，20％甲酰胺，0.1％LDS和0.2 mg / ml肝素

储备溶液

所需数量

20x SSC

1毫升

甲酰胺

2毫升

10％LDS

100微升

20毫克/毫升肝素

100微升

无核酸酶的水

补充至10毫升

在使用PLISH的当天准备新鲜食物，混合均匀并在使用前于37°C预热

6. 1x连接酶缓冲液

10x T4连接酶缓冲液与T4 DNA连接酶一起提供。在无核酸酶的水中将10x缓冲液稀释至1x。在使用PLISH的当天准备新鲜食物，混合均匀并在使用前于37°C预热

7. 1x phi29 DNA聚合酶缓冲液

10x phi29 DNA聚合酶缓冲液与phi29 DNA聚合酶一起提供。在无核酸酶的水中将10x储备缓冲液稀释至1x。在使用PLISH的当天准备新鲜食物，混合均匀并在使用前于37°C预热

8.标签探针缓冲液

C在不含核酸酶的水中含2x SSC，20％甲酰胺和0.2 mg / ml肝素

储备溶液

所需数量

20x SSC

1毫升

甲酰胺

2毫升

20毫克/毫升肝素

100微升

无核酸酶的水

补充至10毫升

在使用PLISH的当天准备新鲜食物，混合均匀并在使用前于37°C预热

致谢

我们感谢Andres Andalon和Yana Kazadaeva的技术援助。这项工作得到了NIH HubMap联盟1UG3HL14562301（PH，TD），NHLBI 1R01HL14254901（TD），Chan Zuckerberg Initiative（TD）和斯坦福发现创新基金奖（PH）的支持。TD是斯坦福儿童健康研究所小儿转化医学的伍兹家庭特聘教授。

利益争夺

Tushar J Desai，Pehr B Harbury和Monica Nagendran已申请专利“使用邻近连接原位杂交的分子谱分析” （申请号62 / 475,090）。

伦理

人体受试者：成人肺是从斯坦福医疗保健公司获得的，患者须知情同意，并同意严格按照18891协议进行出版，该协议已获斯坦福大学医学研究机构人体研究行政管理委员会批准，符合保护要求人类受试者。

参考文献

Beliveau ，BB，Kishi ，JY，Nir ，G. ，Sasaki，HM，Saka ，SK ，Nguyen ，SC，Wu ，C. ，and Yin ，P.（2018）。OligoMiner为设计基因组规模的寡核苷酸原位杂交探针提供了快速灵活的环境。PROC国家科科学院科学USA 115（10）：E2183-E2192
Eichman ，BF，Vargason ，JM，Mooers ，BH和Ho，PS（2000）。反向重复DNA序列中的霍利迪连接：序列对四向连接结构的影响。PROC国家科科学院科学USA 97（8）：3971-3976。
Hays，FA，Schirf ，V.，Ho，PS和Demeler ，B。（2006）。反向重复DNA序列中Holliday连接的溶液形成。生物化学45（8）：2467-2471。
Khuu，PA，Voth ，AR，Hays，FA和Ho，PS（2006年）。堆叠式X DNA Holliday连接和蛋白质识别。J分子识别19（3）：234-242。
Liu，J.，Declais ，AC，McKinney，SA，Ha，T.，Norman，DG和Lilley，DM（2005）。立体特异性效应决定了四向DNA连接的结构。Chem Biol 12（2）：217-228。
Miick ，SM，Fee，RS，Millar，DP和Chazin ，WJ（1997）。交叉异构体偏倚是固定的霍利迪连接的主要序列依赖性。PROC国家科科学院科学USA 94（17）：9080-9084。
Nabhan ，AN，Brownfield，DG，Harbury ，PB，Krasnow ，MA和Desai，TJ（2018）。单细胞Wnt信号传导壁maintain维持2型肺泡细胞的干性。科学359（6380）：1118-1123。
Nagendran，M.，Riordan，DP，Harbury ，PB和Desai，TJ（2018）。通过单细胞分子谱分析在完整组织中进行自动细胞类型分类。Elife 7 ：e30510。
Wilbrey -Clark，A.，Roberts K.和Teichmann ，S.A .（2020）。细胞图谱技术和对组织架构的见解。Biochem J 477 （8）：1427-1442。