材料和试剂

1. 5、10和25毫升血清移液管

2.直径为30毫米的玻璃盖玻片，圆形，Menzel Glaser＃1（VWR，目录号：631-1347）

3.直径为150毫米的圆形培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875714）

4. 15 ml锥形管（Corning，目录号：352095）

5. 50 ml锥形管（Corning，目录号：352070）

6. 6孔板（Corning，目录号：3516）

7.移液器吸头（适用于P1，P10，P20，P100和P1000微量移液器）

8.封口膜（西格玛，目录号：P7793）

9.大玻璃板（约200毫米x 200毫米正方形或更大）

10.玻璃Drigalski刮刀（可通过熔化玻璃巴斯德吸管制成）

11.剃须刀片

12.铝箔

13. 100％乙醇（Sigma，目录号：51976）

14. Milli-Q水

15. pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：1 0010001）

16.氯仿（Sigma，目录号：C2432）

17.甲醇（EMD密理博，目录号：1060092500）

18. （3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（Sigma，目录号：A3648）

19.戊二醛（Sigma，目录号：G6257）

20. 40％丙烯酰胺溶液（Sigma，目录号：A4058）

21. 2％Ñ ，Ñ ' -亚甲基双丙烯溶液（Sigma，目录号：M1533）

22. N，N ，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）（Bio-Rad，目录号：1610800）

23.过硫酸铵（APS）（西格玛，目录号：A3678）

24. 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）脂质（阿凡提，目录号：850375）

25. 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（赖氨酸罗丹明B磺酰基）（Rhod -PE）脂质（Avanti，目录号：810158）

设备

镊子（Fisher Scientific，目录号：12-000-122）
微量移液器套装（P1，P10，P20，P100和P1000）
移液器
轨道振动器
烤箱/培养箱（能够保持45 °C的温度）
干燥剂/真空
涡流
具有相衬和/或落射荧光功能的显微镜（Nikon，型号：TS100）
等离子氧化剂（FEMTO Diener Elektronic ）
4°C冰箱
-20°C冷冻室

程序

玻璃盖玻片功能化
通过Engler（Tse and Engler，2010）和Discher （Chaudhuri et al。，2010）实验室描述的方法对方案的这一部分进行了修改。

将30毫米圆形玻璃盖玻片放在150毫米直径的圆形培养皿中。用70％的乙醇（足以覆盖玻璃盖玻片）填充培养皿，然后在定轨振荡器上放置几分钟。除去乙醇，然后重新填充。重复此步骤3次。
注意：在我们的手中，对于30毫米直径的玻璃盖玻片，观察到最佳的GUV形成。相同的协议可以适用于较小的盖玻片，并且可以根据盖玻片面积相应地调整体积。

用Milli-Q水重复步骤A1。
除去容器中的水。如图1所示，将盖玻片转移到固定器（例如，旧的移液器吸头架）上，然后将它们放入设定为45 °C的烤箱或培养箱中。将它们孵育20-30分钟，或直至完全干燥。

图1.在步骤A3，A13和B11中，将玻璃盖玻片放在支架（例如，旧的移液器吸头架）上

等离子处理玻璃盖玻片5-7分钟。上表面将被“激活” 。
当盖玻片在等离子清洁器中时，准备在无水乙醇中的50 ml 10％（v / v）（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）。每次在锥形管中准备新鲜的溶液。将溶液转移至大培养皿中。
等离子处理后，立即用镊子将盖玻片在室温下浸入APTES溶液中15-30分钟。确保盖玻片不重叠。
删除APTES解决方案。在培养皿中加入乙醇，并轻轻摇动培养皿进行清洗。除去乙醇，并重复此步骤两次。
分别用乙醇在两侧冲洗每个盖玻片。然后用水冲洗，最后用PBS冲洗。将盖玻片放在新鲜的培养皿中。
注意：删除所有APTES非常重要。如果APTES与戊二醛混合，会产生红色/棕色沉淀物，并且GUV不会正确形成。

准备在PBS中的50 ml 2.5％（v / v）戊二醛溶液。每次准备新鲜的解决方案。
将戊二醛溶液倒入装有盖玻片的培养皿中。“激活”面应朝上。在室温下孵育盖玻片15-30分钟，并确保盖玻片不重叠。
去除戊二醛。向培养皿中加入PBS，轻轻摇动培养皿以冲洗盖玻片。除去PBS，并重复此洗涤步骤两次。
用Milli-Q水冲洗培养皿中的盖玻片3次。
如图1所示，将盖玻片转移到固定器（例如，旧的移液器吸头架）上，然后将它们放入设置为45 °C的培养箱中20-30分钟，或直至完全干燥。
如果不立即使用盖玻片，请将盖玻片转移到培养皿中，并用封口膜密封。为了获得最佳存储条件，将盖玻片的功能面朝上放置，并避免将盖玻片堆叠在培养皿中。将盖玻片存放在4°C的冰箱中；它们应保持功能约1个月。

聚丙烯酰胺凝胶制剂
在15 ml锥形管中混合适量的丙烯酰胺（AA），双丙烯酰胺（BAA）和Milli-Q水。总体积应加到1毫升。
笔记：

表1显示了我们已经证实可以成功生产出大量定量GUV的9种混合物。聚丙烯酰胺配方改编自Wen等人，2014年使用的配方。首先，我们建议使用配方1或5。
我们发现，PAA刚度和孔径的变化不会显着影响所产生的自由漂浮式GUV的浓度和尺寸分布（Parigoris等，2020）。

表1.用于成功产生大量GUV的聚丙烯酰胺组合物

样品

丙烯酰胺（µl）

双丙烯酰胺（µl）

水（微升）

AA：BAA

毛孔大小

刚度（kPa）

1个

75

50

875

3：0.1

小

1-2

2

100

30

870

4：0.06

中

1-2

3

125

15

860

5：0.03

大

1-2

4

100

200

700

4：0.4

小

4

5

150

30

820

6：0.06

中

4

6

250

10

740

10：0.02

大

4

7

150

225

625

6：0.45

小

13

8

250

50

700

10：0.1

中

13

9

500

15

485

20：0.03

大

13

松开锥形管上的盖子，将其放入干燥器/真空中。脱气约30分钟。
在对聚丙烯酰胺进行脱气的同时，先用乙醇（约200 mm x 200 mm正方形）清洁一块大玻璃板，然后用水冲洗，然后完全干燥。
脱气丙烯酰胺和双-丙烯酰胺的混合物之后，加入1微升的四甲基乙二胺（TEMED），以聚丙烯酰胺的混合物。
10添加微升的10％（W / V）过硫酸铵（APS）到混合物中。
要制备储备溶液，请将Milli-Q水添加到1 g APS中，直到最终体积达到10 ml。然后，充分涡旋并在-20 °C下储存等分试样。

用移液器快速混合溶液，并短暂涡旋溶液。
将45μl聚丙烯酰胺添加到玻璃板上，每个所需样品加一滴。在每个液滴之间留出足够的间距。
注意：液滴的大小取决于盖玻片的直径。如果使用较小的盖玻片，则液滴的体积可以随盖玻片的面积缩小。

移取所有聚丙烯酰胺后，将一个玻璃盖玻片滴到聚丙烯酰胺的每一滴上。向下触摸一侧，并小心使其掉落。确保盖玻片的功能化表面面向液滴。
ñ OTES：

尽快执行步骤B4-B8，以使聚丙烯酰胺不会过早聚合。
如果在PAA和玻璃之间有气隙，请前后轻轻移动玻璃盖滑片以除去气泡。
等待10-15分钟进行凝胶聚合。
在锥形管中使用剩余的聚丙烯酰胺粗略地确定何时聚合。盖玻片边缘周围形成的气泡表明凝胶已充分聚合。

用Milli-Q水润湿盖玻片表面。用剃须刀从玻璃板上取下盖玻片。小心在移开盖玻片时不要使其破裂。
如图1所示，将盖玻片转移到固定器（例如，旧的移液器吸头架）上，然后将其放入45°C的培养箱中约20-30分钟，或直至完全干燥。PAA表面应朝上。

GUV形成
将玻璃盖玻片（直径30毫米）转移到6孔板上，每个孔中有一个盖玻片。PAA表面应朝上。
注意：如果使用其他尺寸的玻璃盖玻片，请相应调整孔板。

从-20°C冰箱中取出DOPC脂质溶液，并将其放在冰上以防止溶剂蒸发。
ñ OTES：

应在氯仿/甲醇（10：1）溶液中将脂质功率重构为1.5 mM。将所有脂质溶液储存在-20°C下。
我们建议从DOPC脂质开始，但是我们已经确认该方案可用于多种中性和带电脂质。
要使GUV荧光可见，请在DOP C脂质溶液中添加0.5％Rhod -PE脂质。
混合脂质溶液和加入20微升的每个聚丙烯酰胺凝胶。
注意：脂质悬浮液的体积取决于盖玻片的直径。如果使用较小的盖玻片，则可以按盖玻片的面积按比例缩小液滴的体积。

用Drigalski刮刀将脂质溶液均匀地分布在每个PAA凝胶上。
注意：避免接触板上的塑料，因为氯仿/甲醇混合物会损坏塑料。

将板转移到干燥器/真空中并脱气约15分钟。保持盖子稍微打开。如果掺入了荧光标记的脂质，则用铝箔覆盖板。
添加750微升的选择向每个孔的缓冲器的，以便再水化脂质膜。
ñ OTES：

我们已经证实，缓冲液的范围从0 mOsm到1,000 mOsm将成功形成GUV。首先，使用PBS或100 mOsm蔗糖作为补液。
将缓冲液添加到孔的一侧，而不要直接在玻璃/ PAA上。
补液的体积取决于盖玻片的直径。如果使用较小的盖玻片，则可以按盖玻片的面积按比例缩小液滴的体积。
将板的边缘包裹在封口膜中，并在4°C下孵育过夜。如果使用荧光标记的脂质，则用铝箔覆盖板。囊泡将在早晨形成。GUV将自由漂浮，并且可以使用微量移液器从井中简单地转移。图2显示了在掺入Rhod -PE脂质的情况下，用相差显微镜（图2A ）和荧光显微镜（图2B ）显示的GUV的代表性图像。
ñ OTES：

我们还没有探索在不同温度下的GUV形成。因此，我们建议在4°C下过夜孵育，尽管仅几个小时后即可看到GUV形成。
此技术会生成大量的自由浮动GUV（> 10 5 GUV / ml）。GUV直径的分布范围从〜1μm到〜40μm。在我们的测量中，各种PAA刚度和孔隙率条件的平均直径约为10μm （Parigoris等，2020）。

图2. GUV生成的代表性图像。A. DOPC GUV的相衬图像。将PAA脂质凝胶在100 mOsm的蔗糖中重新水化，并将生成的GUV重新悬浮在等渗的PBS（稀释至10 0 mOsm ）中，以帮助其可视化。比例尺代表20μm 。黑色箭头指向各个GUV。B.在PBS中形成的DOPC GUV的荧光共聚焦堆叠的最大Z投影。将0.5％Rhod -PE添加到脂质混合物中以帮助其可视化。比例尺代表小号100微米。

致谢

这项工作得到了惠特克国际奖学金的支持。作者要感谢Jess G. Snedeker教授支持该项目。图1是使用Biorender生成的。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Chaudhuri，T.，Rehfeldt，F.，Sweeney，HL和Discher ，DE（2010）。胶原蛋白涂覆的凝胶的制备，最大限度地提高在体外通过匹配的横向弹性的干细胞的肌生成体内肌肉。方法分子生物学621：185-202。
Horger ，KS，Estes，DJ，Capone，R。和Mayer，M。（2009）。琼脂糖薄膜能够在生理离子强度溶液中快速形成巨大的脂质体。J Am Chem Soc 131（5）：1810-1918。
Lefran ç OIS ，P.，古多，B。和Arbault ，S。（2018）。生理磷酸盐缓冲液中磷脂巨大单层囊泡的电形成。Integr Biol （Camb ）10（7）：429-434。
Lira，RB，Dimova ，R.和Riske，KA（2014）。由琼脂糖和脂质的混合膜形成的巨大单层囊泡显示出改变的机械性能。Biophys J 107（7）：1609-1619。
大号ó佩斯莫拉，N.，汉森，JS，高，Y.，罗纳德，AA，Kieltyka ，R.，Malmstadt，N和KROS ，A.（2014）。从交联的葡聚糖（乙二醇）水凝胶制备大小可调的大囊泡。Chem Commun （Camb ）50（16）：1953-1955。
Parigoris ，E.，Dunkelmann ，DL，Murphy，A.，Wili ，N.，Kaech ，A.，Dumrese ，C。，Jimenez- Rojo ，N。和Silvan，U。（2020）。使用聚丙烯酰胺凝胶轻松生成巨大的单层囊泡。科学代表10（1）：4824。
Stein，H.，Spindler，S.，Bonakdar ，N.，Wang C.和Sandoghdar ，V.（2017）。高盐浓度下分离出的巨大单层囊泡的生产。前沿8：63 。
Tse ，JR和Engler，AJ（2010）。具有可调机械性能的水凝胶基质的制备。Curr Protoc Cell Biol第10章：单元10.16。
Weinberger，A.，Tsai，FC，Koenderink ，GH，Schmidt，TF，Itri ，R.，Meier，W.，Schmatko ，T.，Schroder，A. and Marques，C.（2013）。凝胶辅助的巨大单层囊泡的形成。Biophys J 105（1）：154-164。
Wen JH，Vincent，LG，Fuhrmann，A.，Choi，YS，Hribar ，KC，Taylor-Weiner，H.，Chen.S . and Engler，AJ（2014）。干细胞分化中基质刚度和蛋白质束缚的相互作用。Nature Mater 13（10）：979-987。
版权所有©20 20作者；保留所有权利。独家被许可人生物协议有限责任公司。1个