材料和试剂

1 ml注射器柱塞（例如VWR，目录号：NSCAS7510-1）
24孔板（例如BD Biosciences，目录号：353047）
50毫升猎鹰管
15毫升猎鹰管
1.5 ml Eppendorf管
40 µm细胞过滤器
培养皿
盖玻片（Carl Zeiss TM ，目录号：10474379），在室温下保存
PEP笔（ImmEdge ，Vector Laboratories：H-4000 ），在室温下存放
显微镜载玻片（VWR，SuperFrost Plus，目录号：631-0108，在室温下存储）
5C.C7 TCR转基因小鼠（Davis Lab，Stanford [ Seder et al。，1992 ] ，RRID：MGI ：3799371 ）
CH27细胞系（RRID：CVCL _7178 ）
Anti-LAT pY191（细胞信号传导，目录号：3584），存储在4 °C
抗LAT（Cell Signaling，目录号：9166），储存在4 °C
抗兔IgG，Alexa Fluor 488（分子探针，目录号：R37118），在4 °C下储存
抗CD19抗体（BD Biosciences，Biotin Rat抗小鼠CD19，克隆1D3 ，目录号：553784 ），储存在4 °C
多聚甲醛（Sigma - Aldrich，目录号：P6148 ），储存在4 °C
氯化铵（Sigma - Aldrich，目录号：213330 ），在室温下储存
Triton X-100（Sigma - Aldrich，目录号：T8787 ），在室温下存放
PBS（Thermo Fisher，目录号：14200075），室温保存
Fc受体，大鼠抗小鼠CD16 / CD32（BD Bioscience，目录号：53141），储存在4 °C
ProLong Gold（Thermo Fisher，目录号：P36930），在室温下存储
蛾细胞色素C（MCC）肽，重组肽（ANERADLIAYLKQATK），在-20 °C下储存
SDS（Sigma，目录号：71729 ），在室温下保存
生物素化BSA（Thermo Fisher，目录号：29130 ），储存在-20 °C
T50溶液（10 mM Tris-C l pH = 8.0，50 mM NaCl），储存在4 °C
Neutravidin（0.2 mg / ml在ddH 2 O中稀释，Thermo Scientific ，目录号：31000 ），在4 °C下储存
原钒酸钠（Na 3 VO 4 ）（20 mM工作量，ddH 2 O，Sigma - Aldrich，目录号：S6508），存储在-20 °C
过氧化氢（H 2 O 2 ）（30％溶液，Sigma，目录号：H1009 ），储存在4 °C
100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459835），在室温下存储
带有L-谷氨酰胺的RPMI（Lonza，目录号：BE12-702F）
FBS（SLS LAB PRO，目录号：S-001A-BR）
100 U / ml青霉素加100 µg / ml链霉素（Gibco，目录号：15140122）
2-巯基乙醇（Gibco，目录号：31350010）
T细胞培养成分（请参阅食谱）
完全中等

白介素2培养基

蛾细胞色素C（MCC）激动剂肽，用于刺激5C.C7 TCR转基因T细胞

2个过氧化钒成分（请参阅食谱）
成像缓冲液（请参见配方）

设备

P2，P20，P200移液器
ç entrifuge
孵化器
共焦激光扫描显微镜（Leica，SP8 AOBS ）配备470-670 nm的脉冲白光激光，2.5 mW / nm，592 nm连续波STED耗尽激光，Leica STED White 100x 1.4 NA物镜和时间选通的Leica SMD HyD检测器
软件

惠更斯专业人士（SVI，www.svi.nl）
ImageJ插件（模块化图像分析，版本0.5.22），可在GitHub上通过https://github.com/SJCross/MIA获得。mia设置文件作为补充材料提供。

程序

T细胞和APC培养（Ambler et al。，2017）
T细胞培养：使用批准的程序（例如，《 1986年英国动物（科学程序）法》附表1列出的程序）淘汰6周龄以上的5C.C7 T细胞受体转基因小鼠。所有动物的繁殖，维持和处理都需要由有关当局批准。
解剖淋巴结并将其收集在装有5 ml完全培养基的15 ml Falcon管中。
将40 µm细胞过滤器放在50 ml Falc试管上。将所有淋巴结倒入细胞过滤器，并使用1 ml注射器柱塞轻轻地迫使其穿过过滤器，从而机械分离淋巴结。用5 ml完全培养基洗涤柱塞和细胞过滤器。
将细胞以200 xg离心3分钟。除去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml完全培养基中并计数细胞。
将细胞稀释至4 x 10 6细胞/ ml的密度。
在24孔板的一个孔中培养1 ml细胞悬液，并添加0.65 µl 5 mM MCC肽，以使最终MCC浓度达到3 µM。在37 °C ，6％CO 2下孵育过夜。
必要时用白介素2培养基分裂5C.C7 T细胞，通常每天1：1。MCC肽仅用于引发培养。使用白细胞介素2可以维持T细胞。
需要使用至少两种独立的原代T细胞培养物重复实验。
APC培养：CH27 B细胞淋巴瘤细胞被用作抗原呈递细胞，并通过每两天以1:10的比例分裂在完全培养基中。

用过氧钒酸盐刺激T细胞
作为阳性对照，可以用磷酸酶抑制剂Pervanadate刺激T细胞，以诱导广泛而广泛的酪氨酸磷酸化。
对T细胞培养的第5天，收集T细胞作为24的许多井-根据需要孔板（4 X 10 6细胞/孔）到15毫升Falcon管中，离心分离机，在200 ×g下3分钟。每孔将T细胞沉淀重悬于150 µl成像缓冲液中。
计数T细胞并在1.5 ml Eppendorf管中收集所需的细胞数（每个实验重复40,000个）。
将新鲜制备的2x过氧钒酸盐以1：1的比例添加到含有1.5 ml Eppendorf管中的完全培养基的细胞中。在37 °C下孵育5分钟并染色（步骤D）。
STED兼容盖玻片的涂层
用10％SDS洗涤STED兼容盖玻片（高性能，厚度1.5，0.170±0.005 mm，Zeiss）10分钟，然后用ddH 2 O洗涤一次。
将洗过的盖玻片浸入在陪替氏培养皿中的100％乙醇中30分钟。
用ddH 2 O洗涤盖玻片一次，并在60°C的加热块上烘烤30分钟，直到干燥。
干燥后，使用PEP笔绘制圆形边界（直径约10毫米），然后使其干燥。
将生物素化的BSA重悬于T50溶液中，浓度为1 mg / ml。
在盖玻片中间添加50 µl生物素化的BSA，并在37°C下孵育7分钟。
用50 µl T50溶液清洗盖玻片一次。
在37°C下，在盖玻片上加入50 µl Neutravidin溶液（在ddH 2 O中终浓度为0.2 mg / ml ）1分钟。
用T50溶液洗涤一次，然后用PBS洗涤两次。
在成像缓冲液中将抗CD19抗体稀释至最终浓度为10 µg / ml。
在盖玻片上加入50 µl稀释的抗CD19，并在37°C下孵育10分钟。
用50 µl成像缓冲液清洗盖玻片两次，然后再添加50 µl成像缓冲液以保持盖玻片湿润。
使用前将涂层的盖玻片储存在4°C的封口膜密封皿中。
关键步骤涂覆后3天内使用涂覆的盖玻片。

策LL染色
原发性5C.C7 T细胞通过与CH27 APC相互作用而激活，而CH27 APC则呈现出5C.C7 T细胞受体识别的MCC激动剂肽。作为对照，T细胞还被磷酸酶抑制剂Pervanadate激活。
用P200移液器取下用于保持盖玻片湿润的成像缓冲液。
通过在完全培养基中孵育至少4 h （Ambler等人，2017）将具有10 µM MCC肽的Prime APC，CH27细胞（来自S tep A9）（Ambler等，2017）重悬于40,000细胞/ 50 µl成像缓冲液。将5C.C7 TCR转基因T细胞（来自S tep A7）（Ambler等人，2017）重悬于每5 µl成像缓冲液40,000个细胞。
将50 µl APC（40,000个细胞）接种到包被的盖玻片上，并在室温下静置10分钟。
在室温下加入5 µl T细胞（40,000个细胞）或10 µl经过钒酸盐处理的T细胞（40,000个细胞），持续4.5分钟。
ΔCRITICALSTEP用P200移液器轻轻取出体积，并在4 °C下添加50 µl 4％PFA，持续20分钟。
使用P200移液器用50 µl PBS轻轻冲洗盖玻片一次。
在4 °C下加入50 µl 50 mM NH 4 Cl淬灭10分钟，然后用50 µl PBS洗涤盖玻片3次。
使用PBS中的50 µl 0.02％Triton X-100使细胞在4 °C下通透20分钟。
用50 µl PBS清洗盖玻片3次，然后在室温下与50 µl封闭溶液（PBS中的1％BSA）孵育30分钟。
移出溶液，并在含Fc阻断剂的PBS的1％BSA中，添加50 µl一抗（以1:50稀释的抗磷酸LAT（Tyr 191）或1：100稀释的抗LAT）。相同稀释度的抗小鼠CD16 / CD32），在4°C下孵育过夜。
去除一抗并用50 µl PBS洗涤盖玻片3次。
在室温下，将盖玻片与在1％BSA的PBS中以1：500稀释的50％二级抗体（驴抗兔IgG，Alexa Fluor 488）以1：1,000的比例稀释在PBS中的1％BSA中孵育1 h。
用50 µl PBS清洗盖玻片3次，然后从盖玻片上除去PBS。
加入一滴ProLong Gold后，在玻片（VWR，SuperFrost Plus）上盖上盖玻片，并固化24小时。

E. STED显微镜

首先，使用以下设置在共焦模式下用Leica SP8X STED显微镜对载玻片成像：
一种。100x 1.4 NA HC PL APO CS2 STED白色油镜。

b。512 x 512像素。

C。400 Hz扫描速度。

d。在白光激光器上选择了488 nm激发，并带有相应的NF488滤光片。

e。默认的70％白色激光功率将通过声光可调滤镜调整至10％。

F。HyD1混合检测器的收集范围为498-520 nm 。

G。混合探测器增益为100％。

H。混合检测选通0.3 - 8纳秒。

一世。线平均2 。

j。ø安输出图像比特大小的8位。

在共聚焦模式下，放置样品并选择感兴趣的区域。
为了您的形象与STED感兴趣的区域，重复序列1，即，用来选择感兴趣的区域，并修改重复序列如下成像步骤的顺序：
一种。开启592 nm STED激光器。592 nm耗尽型激光器产生一个环形的耗尽区，用于在488 nm处激发荧光团。将它设置为30％-50％，也就是说，50％-70％消耗，它可以根据你的Alexa Fluor488的染色亮度的声光可调谐滤波器。过度消耗可能会损坏样品。

b。根据需要增加488 nm激光功率，以保持良好的信号。

C。通过软件使用“优化的像素大小”功能自动计算出的优化像素大小，为STED选择优化的帧大小。

d。混合探测器收集范围498-510 nm 。

e。混合探测器增益200％。

F。混合检测选通1.5 - 8纳秒。采集前较长的启动门时间可确保有效耗尽大多数分子以提高分离度。

关键步骤如果要在采集后对数据进行反卷积，请确保所采集图像中没有饱和度/最小饱和度，并根据需要调整激光功率和增益。
关键步骤一旦设置了STED序列，请转到“配置”以对齐STED光束。
第一个小时，STED光束需要每15分钟校准一次，以最大程度地减少温度漂移。
开始扫描并获取STED图像。

数据分析

对于反卷积，请打开STED。使用惠更斯专业版软件生成lif图像。
选择要反卷积的图像系列。
右键单击图像，然后选择显微镜参数。检查自动读取的元数据是否正确，例如，嵌入的媒体为ProLong Gold（1.47 RI）。
将所有参数设置为已验证并接受。
右键单击图像，选择反卷积向导。
在每个图像的背景上绘制三条线，以获取背景强度。
输入平均背景强度值。
单击执行，然后将最大迭代次数设置为默认值40。验证去卷积例程的收敛性并调整迭代次数是必要的。
解卷积完成后，将图像保存为.TIFF文件，然后在斐济（NIH）中分析解卷积的图像（Schindelin等人，2012; Rueden等人，2017）。
斐济（NIH）自动进行点状分析。使用Wolfson Bioimaging ImageJ-Fiji插件（模块化图像分析，版本0.5.22）检测并测量LAT点。可以通过以下步骤安装和使用它：
一种。从https://github.com/sjcross/MIA/releases/tag/v0.5.22下载插件的v0.5.22，并将“ Modular_Image_Analysis-0.5.22.jar”文件放在斐济的“ plugins”文件夹中。

b。要安装所需的第三方库，请启动Fiji并转到“帮助>更新...”，然后选择“管理更新站点”并添加“ Biomedgroup ”和“ IJPB插件”更新站点。出现提示时重新启动斐济。

C。通过转到“插件> Wolfson Bioimaging>模块化图像分析”在斐济内启动MIA。

d。单击“加载”，然后选择“ MIA对象检测工作流.mia ”工作流文件作为该协议的补充提供。这包含MIA执行分析的所有说明。用户可以通过一些设置来选择要处理的文件并控制分析：

“输入控制>输入模式”：在“批处理”中，将处理选定文件夹中的所有文件，而在“单个文件”中，将仅处理一个图像文件。
“输入控件>单个文件路径”：选择要分析的批处理文件夹或单个文件。
“输入控制>系列模式”：用于多系列的文件（例如，徕卡LIFS），所有系列进行处理，或者可以选择序列的子集。
“输入控件>序列号”：如果处理可用序列的子集，则可以将要处理的序列指定为序列索引的逗号分隔列表。
“阈值图像>阈值乘数”：在应用之前调整自动检测到的阈值。值<1将降低阈值，值> 1将增加阈值。
“删除小于……的对象”：对检测到的对象应用可选的大小过滤器。尺寸以µm 3为单位指定。使用电源图标禁用。
“删除比...暗的对象”：应用可选的对象强度滤镜。从原始图像堆栈测量强度。使用电源图标禁用。
“删除不在群集中的Blob”：应用一个可选的过滤器，该过滤器使用DBSCAN删除所有未标识为群集一部分的对象。使用电源图标禁用。
“将群集轮廓添加到覆盖”：在输出覆盖图像上渲染群集轮廓（显示检测到的内容）。
“显示轮廓图像”：生成轮廓图像后立即显示。
“保存轮廓图像”：将轮廓图像保存到与输入文件相同的文件夹中，但后缀为“ _ outlinesNew ”。
e。点击“运行”开始处理。完成后，插件底部的消息窗口将显示“ Complete！”。结果将与输入文件保存在同一文件夹中。

使用Otsu算法将阈值乘数设为3.5，然后使用分水岭3D方法分离近距离物体，从而识别点。确定每个泪点的体积。
在不表达LAT的APC中检测到的小点用于得出LAT复合物的检测大小阈值，因此所有小于APC点大小分布的95％的点都从分析中排除（图1）。因此，从分析中排除了LAT / pLAT数据中小于0.04 / 0.06 µm 3的复合物。以99％的临界值重复分析并没有改变得出的结论。
相邻点之间可分辨的最接近距离为100 nm。

图1.给出了一个代表性的STED中板图像的两个版本，分别显示了被CH27 APC（10 µM MCC激动剂肽）激活并用α-LATpY191染色的5C.C7 T细胞。染色荧光强度以类似彩虹的假色标度显示（从蓝色增加到红色）。A.阈值为3 .5 AU的Otsu算法可识别细胞界面处的大磷酸LAT簇和APC和CD4 + T细胞中的小的非特异性点。B.明亮的LAT簇形成了“中央”模式，如B所示，其中相同数据以不同强度等级显示。比例尺s = 1 µm。

LAT点可以聚集在T细胞APC接口的中心（图1-2），也可以分布在整个接口上（图2-3）。这样的“中心”或“分散”分布分别对应于cSMAC复合物的形成或不形成。使用已建立的模式分类方法确定模式（Singleton等，2009）。在Clark等人的图3B中，根据该模式分类对点数和大小进行了量化。（2019）。

图2.给出了两个版本的代表性STED中平面图像，显示了5C.C7 T细胞中两种不同的LAT模式，其中一种是由一个CH27 APC（10 µM MCC，中间细胞）激活并用α-LATpY191染色。染色荧光强度以类似彩虹的假色标度显示（从蓝色增加到红色）。A.左侧的5C.C7 T细胞显示出磷酸-LAT的“扩散”模式。右侧的5C.C7 T细胞显示出“中央”模式。如图1所示，在APC和CD4 + T细胞中都可以看到非特异性点。B.在B中更容易看到图案，其中B以相同的强度等级显示相同的数据。比例尺s = 1 µm。

图3.两个版本的代表性STED中平面图像，显示了由一枚CH27 APC（10 µM MCC，顶部的细胞）激活的5C.C7 T细胞中的弥散LAT蛋白模式。染色荧光强度以彩虹色的假彩色标度（从蓝色增加到红色）给出。答：5C.C7 T显示了磷酸-LAT的“扩散”图案。如图1所示，在APC和CD4 + T细胞中都可以看到非特异性点。B.在B中更容易看到图案，其中相同的数据以不同的强度等级显示。比例尺s = 1 µm。

菜谱

T细胞培养成分
完全中等

含L-谷氨酰胺，10％FBS，100 U / ml青霉素加100 µg / ml链霉素，50 µM 2-巯基乙醇的RPMI

白介素2培养基

具有50 U / ml rhIL-2的完全培养基

蛾细胞色素C（MCC）激动剂肽，用于刺激5C.C7 TCR转基因T细胞

ddH 2 O中的5 mM溶液

2个过氧化钒成分
在ddH 2 O中以1:10的比例稀释30％H 2 O 2储备溶液，制成3％H 2 O 2溶液
在1.5 ml Eppendorf管中加入4 µl 3％H 2 O 2溶液和20 µl 20 mM Na 3 VO 4于976 µl ddH 2 O中，制成2x过钒酸盐储备液。
在室温下于黑暗中孵育2x过氧钒酸盐10分钟，即可使用
成像缓冲液
不含钙和镁的PBS，10％FBS，1 mM氯化钙，0.5 mM氯化镁

致谢

我们承认布里斯托尔FACS和欧胜大学生物成像设施提供设备和技术支持，以及BrisSynBio ，一个BBSRC / EPSRC资助的合成生物学研究中心（批准号：L01386X）。这项工作得到了BBSRC（CW的BB / P011578 / 1）以及EPSRC和BBSRC合成生物学博士培训中心（HT的EP / L016494 / 1）的资助。该协议文件中详细描述的程序源自Clark等。（2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

根据大学小鼠育种内政部许可证P10DC2972，所有动物均在布里斯托大学的无病原体动物设施中饲养。

参考文献

Ambler，R.，Ruan，X.，Murphy，RF和Wulfing，C.（2017）。免疫突触的系统成像。方法分子生物学1584：409-421。
Balagopalan，L.，Kortum，RL，Coussens，NP，Barr，VA和Samelson，LE（2015）。T细胞活化连接子（LAT）信号枢纽：从信号复合物到微簇。生物化学杂志290（44）：26422-26429。
Banani，SF，Rice，AM，Peeples，WB，Lin，Y.，Jain，S.，Parker，R. and Rosen，MK（2016）。相分离细胞体的组成控制。细胞166（3）：651-663。
克拉克（DJ），麦克米伦（McMillan），LE，谭（Tan），SL，贝洛莫（Bellomo），G。，马苏（Massue），C。，汤普森（Thompson），H。，Hedges，A.，Schwartzberg，PL，Verkade，P.，Murphy，RF and Wulfing，C.（2019年）。T细胞抗原呈递细胞界面中心的瞬态蛋白积累驱动有效的IL-2分泌。Elife 8：45789。
Freiberg，BA，Kupfer，H.，Maslanik，W.，Delli，J.，Kappler，J.，Zaller，DM和Kupfer，A。（2002）。在SMAC中暂存和重置T细胞激活。纳特免疫 3（10）：911-917。
Grakoui，A.，Bromley，SK，Sumen，C.，Davis，MM，Shaw，AS，Allen，PM和Dustin，ML（1999）。免疫突触：控制T细胞活化的分子机制。科学285：221-226。
Li，P.，Banjade，S.，Cheng，HC，Kim，S.，Chen，B.，Guo，L.，Llaguno，M.，Hollingsworth，JV，King，DS，Banani，SF，Russo，PS， Jiang QQ，Nixon，BT和MK Rosen（2012）。多价信号蛋白组装中的相变。自然483（7389）：336-340。
Monks，CR，Freiberg，BA，Kupfer，H.，Sciaky，N。和Kupfer，A。（1998）。T细胞中超分子激活簇的三维分离。自然395（6697）：82-86。
Monks，CR，Kupfer，H.，Tamir，I.，Barlow，A。和Kupfer，A。（1997）。T细胞活化过程中蛋白激酶C-theta的选择性调节。自然385（6611）：83-86。
Roybal，KT，Mace，EM，Mantell，JM，Verkade，P.，Orange，JS和Wulfing，C.（2015年）。由抗原呈递细胞激活的原代T细胞中的早期信号传导与深层和短暂的层状肌动蛋白网络有关。PLoS一10（8）：e0133299。
康涅狄格州鲁登（Rueden），辛德林（J. ImageJ2：用于下一代科学图像数据的ImageJ。BMC生物信息学18（1）：529。
Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frise，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B ，Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P。和Cardona，A。（2012）。斐济：一个用于生物图像分析的开源平台。Nat Methods 9（7）：676-682。
Seder，RA，Paul，WE，Davis，MM和Fazekas de St. Groth，B.（1992）。在体外引发过程中白介素4的存在决定了来自T细胞受体转基因小鼠的CD4 + T细胞产生淋巴因子的潜力。实验医学杂志176（4）：1091-1098。
Shin，Y.和Brangwynne，CP（2017）。液相凝结在细胞生理和疾病中。科学357（6357）。
辛格尔顿（Singleton），吉隆坡（Kingle），罗伊巴尔（Roybal），KT，孙（Y.），傅（G.）T细胞活化过程中的时空模式是高度多样的。科学信号2（65）：ra15。
Su，X.，Ditlev，JA，Hui，E.，Xing，W.，Banjade，S.，Okrut，J.，King，DS，Taunton，J.，Rosen，MK and Vale，RD（2016）。信号分子的相分离促进T细胞受体信号转导。科学352（6285）：595-599。
Varma，R.，Campi，G.，横须贺，T.，Saito，T.和Dustin，ML（2006）。T细胞受体近端信号在周围的微团簇中持续存在，并在中央的超分子活化簇中终止。免疫25（1）：117-127。
T.横须贺，K.Sakata-Sogawa，W。小林，广岛，M.Hashimoto-Tane，M.Tokunaga，M.Dustin和T.Saito（2005）。通过募集Zap70和SLP-76，新生成的T细胞受体微簇启动并维持T细胞活化。Nat Immunol 6（12）：1253-1262。
../../../../../Downloads/Creative%20commons%20grey1个