材料和试剂

1. 1.5 ml微型管（Axygen，Maxyclear，目录号：MCT-150-C-S）
2. 离心管（目录号：S791）
3. 25 cm2培养瓶（康宁，斜颈，盖塞密封，目录号：CLS430168）
4. 注射器过滤器0.22µm（Sartori，Miniart注射器过滤器，目录号：16534）
5. 微量移液管尖端（Axygen、10µl、200µl和1000µl）
6. 血清学移液管（Costar无菌，10 ml）
7. 显微镜载玻片（刀形玻璃，非彩色）
8. 盖玻片（针状玻璃，22 x 22毫米）
9. Combicoverslips（基因组视觉，目录号：COV-002-RUO）
10. 可重复使用的插头模式（来自分子梳理系统-基因组视觉）
11. 6井平底板（Costar，目录号：38015）
12. 塑料盖玻片（使用切割的塑料袋作为粘合剂）
13. 指甲油（任何牌子，最好是无色）
14. Click iT EdU细胞增殖试剂盒，Alexa Fluor 488染料（ThermoFisher Scientific，目录号：C10337）
15. 5'-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）（Sigma-Aldrich，目录号：I7125）
16. 5′-氯-2′-脱氧尿苷（CldU）（Abcam，目录号：ab213715）
17. 小鼠α-BrdU/α-IdU单克隆抗体（BD，目录号：347580）
18. 大鼠α-BrdU/α-CldU单克隆抗体（准确，目录号：YSRTMCA2060GA）
19. 第二代小鼠IgA-218号，Alexa-218-科学抗体
20. 山羊α-大鼠IgG（H+L）二级抗体，Alexa Fluor 488（ThermoFisher Scientific，目录号：A-11006）
21. 多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
22. 聚赖氨酸盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P2658）
23. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：05470）
24. Triton-T87 Sigma目录
25. 氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
26. 编号：HP572O93
27. 无水乙醇（默克密理博，目录号：100983）
28. 带DAPI的Vectashield安装介质（Vector Labs，目录号：H-1200）
29. 延长金防腐蚀贴片（赛默飞世尔科学公司，目录号：P36930）
30. 盐酸烟化37%（默克公司，目录号：100317）
31. 氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
32. SDM-79培养基（LGC生物技术，目录号：BR30079-05）
33. 海明（默克，产品目录号：H9039）
34. KCl（用于分子生物学，任何品牌）
35. KH2PO4（用于分子生物学，任何品牌）
36. 胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
37. 硫酸链霉素盐（Sigma-Aldrich，目录号：S6501）
38. 青霉素G钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：P3032）
39. EDTA·2H2O（乙二胺四乙酸二钠二水合物）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
40. NaOH（ACS试剂，任何品牌）
41. 乙醇（无水，默克，目录号：100983）
42. N-月桂酰肌氨酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：L5125）
43. 蛋白酶K（ThermoFischer Scientific，目录号：AM2544）
44. 抗DNA抗体，单链（小鼠抗ssDNA）（Millipore，目录号：MAB3868）
45. 山羊抗鼠IgG2b交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 350（抗鼠Alexa Fluor 350）（Thermofisher Scientific，目录号：A-21140）
46. MES，游离酸（ULTROL级，Calbiochem，目录号：475893）
47. 磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）（见配方）
48. 氯化血红素溶液（HS）（见配方）
49. SDM-79培养基（用于培养布氏原环细胞）（见配方）
50. 5′-氯-2′-脱氧尿苷溶液（CldU-S）（见配方）
51. 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷溶液（EdU-S）（见配方）
52. 5′-碘-2′-脱氧尿苷溶液（IdU-S）（见配方）
53. 50万EDTA（见配方）
54. 0.65 M EDTA（见配方）
55. 1.5 M Tris HCl（见配方）
56. 1 M NaCl（见配方）
57. 70%乙醇（见配方）
58. 90%乙醇（见配方）
59. DNA梳理洗涤缓冲液（DC-WB）（见配方）
60. DNA结合裂解缓冲液（DC-LB）（见配方）
61. DNA梳理阻断液（DC-BS）（见配方）
62. DNA结合变性缓冲液（DC-DB）（见配方）
63. DNA结合初级抗体溶液（DC-PAS）（见配方）
64. DNA结合二级抗体溶液（DC-SAS）（见配方）
65. DNA结合抗ssDNA溶液（DC抗ssDNA）（见配方）
66. DNA梳理Alexafluor350（DC-alexa350）（见配方）
67. T10E1缓冲液（见配方）
68. 0.5 M MES缓冲器（见配方）
69. 固定缓冲液（FB）（见配方）
70. 聚赖氨酸溶液（PLS）（见配方）
71. 渗透溶液（PS）（见配方）

使用的设备

1. 微型离心机（Eppendorf，型号：5424R）
2. 电动移液管分配器（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：03-692-172）
3. 水浴（Cientec，型号：CT-226）
4. 磁力搅拌器（Fisatom，型号：753A）
5. 培养箱BOD（玻璃体，型号：NI1705）
6. 荧光显微镜【Olympus，型号：BX51，与XM10数码相机相连。滤光片规格：U-MWU2（激发=330-385 nm；发射=420 nm）；U-MWIBA3（激发=460-495 nm；发射=510-550 nm）；U-MWG2（激发=510-550 nm；发射=590 nm）]
7. 微量移液管（Gilson，型号：移液管P10、P20、P200和P1000）
8. 离心机（Eppendorf，型号：5810 R），配有4 x 250 ml摆斗转子
9. 带盖玻璃的Neubauer室（Sigma-Aldrich，型号：Bright LineTM血细胞仪）
10. 生物安全二级A2柜（Pachane，型号：PA 700）
11. pH计（Gehaka，型号：PG1800）
12. 高压灭菌器（Tomy Seiko，型号：SS-245）
13. FiberComb–分子梳理系统（Genomic Vision，型号：MCS-001）

软件

1. CeCyD（丁烷研究所，发表于da Silva等人，2020年，http://cecyd.vital.butatan.gov.br/)
2. 倍增时间计算器（2006）（3.1.0版，https://doubling-time.com/compute_more.php)
3. Olympus Cell F软件（Olympus，版本5.1.2640）
4. NIH 47J版
5. Microsoft Excel（Microsoft Office任意版本）或GraphPad Prism（GraphPad软件公司）

程序

笔记：
1. 如果你已经有了有关生物体的染色体大小、S期持续时间和复制率的值，那么下面的步骤（A-C）就没有必要了。
2. 步骤B（S期的估计）和C（复制率的估计）的描述以布鲁氏杆菌为例。然而，对于其他细胞类型，这些参数可在特定研究中找到（如酿酒酵母）(Brewer等人，1984年；Sekedat等人，2010年；Ivanova等人，2020年）；哺乳动物细胞——MEFs细胞（Ishida等人，2001年；Stanojcic等人，2016年；Pereira等人，2017年）]。

A、获得染色体大小值
第一种选择（对于任何生物体）：
1. 访问网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
2. 在“流行资源”选项（右侧），点击基因组。
3. 键入感兴趣的有机体的名称。
4. 从表中获得染色体大小值。

第二种选择（仅适用于锥虫类生物）：
1. 访问网站https://tritrypdb.org/tritrypdb/。
2. 在“搜索其他数据类型”选项（中间一栏），单击“基因组序列”，然后单击“有机体”。
3. 选择感兴趣的生物体（如布氏锥虫）。
5. 单击“获取答案”。
6. 从表中获得染色体大小（长度）值。

B、用CeCyD软件估计S相持续时间
CeCyD是一个用户友好的网站，可以计算细胞周期的胞质分裂（C）、有丝分裂（M）、G2、S和G1期的数值。为此，用户必须在网站上输入以下参数：倍增时间、胞质分裂细胞百分率、有丝分裂细胞百分率、同一细胞中检测两个EdU标记细胞核的最短时间、EdU脉冲后EdU标记细胞的百分比以及该EdU脉冲的持续时间。本节的以下步骤描述了如何在T.brucei中获得这些参数（用作示例）。然而，对于其他细胞类型，S期持续时间可直接从特定研究中获得（如酿酒酵母（Brewer等人，1984年；Ivanova等人，2020年）；哺乳动物细胞——MEFs细胞（Ishida等人，2001年；Pereira等人，2017年）]。

1. 准备一套布氏木霉培养物（这里，它被用于前环形式）来估计去加倍时间。在10毫升培养液中，28°C条件下，以1 x 106个细胞/毫升开始生长曲线。
注：曲线开头的单元格密度随单元格类型而变化。
2. 采集细胞样本并每天计数，直到达到固定期。
3. 插入计数的值https://doubling-time.com和注意倍增时间值。
4. 准备一套新的布鲁氏杆菌培养物（前环型），以估计有丝分裂和胞质分裂中的细胞百分比。培养细胞（28°C），直到达到指数期（~1 x 107个细胞/ml）。
注：指数相的电池密度因所用电池类型而异。
5. 在4°C下，以800 x g离心5分钟，收获1 ml培养物，并使用1 ml 1x PBS洗涤两次。
6. 小心地从细胞中取出1x PBS以保存颗粒。
7. 将颗粒悬浮在1 ml固定缓冲液（FB）中，并转移至1.5 ml微型离心管中。
8. 在4°C下培养7分钟，并使用1毫升冷1x PBS清洗三次（每次清洗以800 x g离心5分钟）。最后一次清洗时，小心地将颗粒悬浮在500μl 1x PBS中。如果颗粒太小（即肉眼几乎看不见），则将体积减小至100μl 1x PBS。
9. 将2.5μl聚赖氨酸溶液（PLS）涂在载玻片表面，直到PLS干燥，制备载玻片以接收细胞。为步骤B8中的每个样品准备三张幻灯片。
注：使用盖玻片将PLS铺在载玻片上（更多详情见da Silva等人，2018年）。
10. 从每一步的玻片（B8）中小心地将小球（B8）分散。使用25-30μl并保存剩余悬浮颗粒体积，以备需要重新制作一些载玻片。
笔记：
a。使用与PLS之前相同的表面。
b。每张幻灯片都是一个技术复制品。
11. 在室温下等待细胞沉淀并在载玻片上沉淀10-15分钟。确保电池不会干燥。
12. 通过在室温下添加50μl渗透溶液（PS）10分钟使电池渗透。
13. 用1x PBS清洗含有细胞的载玻片三次。
注：用P1000微量吸管（通过打喷嚏）将1x PBS（1毫升）涂在载玻片上三次。
14. 确保从含有细胞的载玻片表面清除所有液体，并添加4μl含有DAPI的Vectashield安装介质。
注：本试剂用作防褪色贴装液，用于染色含有DNA的细胞器。
15. 添加玻璃盖玻片和密封使用无色指甲油。等待清漆干燥5分钟。可以立即在荧光显微镜下分析载玻片，也可以在4°C下保存一个月。
16. 计数至少100个细胞，识别有丝分裂（核分裂）和胞质分裂（同一细胞内有两个分离的细胞核）的细胞。图1显示有丝分裂（A）和胞质分裂（B）中布鲁氏杆菌细胞的代表性图像。
注：使用差分干涉对比度（DIC）（如果可用）或相位对比度拍摄图像。与DAPI合并以帮助识别有丝分裂/胞质分裂中的细胞。

图1。代表性图片显示布鲁氏杆菌细胞有丝分裂（左）和胞质分裂（右）。值得一提的是，有丝分裂时，细胞核正在分裂，而在胞质分裂中，细胞核已经分裂。DIC显示细胞形态，DAPI染色含DNA的细胞器[细胞核（N）和动细胞（K）]。比例尺=10μm。

17. 注意有丝分裂和城市化中细胞的百分比。
18. 准备一套新的布氏木霉培养物，估计在同一细胞中检测两个EdU标记的细胞核的最短时间。培养细胞（28°C），直到达到指数期（~1 x 107个细胞/ml）。
注：指数相的电池密度因所用电池类型而异。
19. 将100µM 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷溶液（EdU-S）加入含有布氏锥虫细胞的培养物中，并等待30分钟。
20. 通过离心法收获500µl培养物（800 x g，4°C下3分钟），并使用1 ml 1x PBS洗涤两次。
21. 完全按照前面描述的步骤B6-B7进行操作。
22. 在4°C下培养。
23. 继续每15分钟采集一次样品，直到EdU加入3小时（11个样品）。对于每个样品，遵循步骤B20-B22。
笔记：
a。每个样品应在FB中冰上培养至少7分钟。
b。在该步骤结束时，每15分钟应采集12个样本。
24. 取12个样品，用1ml冷1x PBS清洗三次（每次清洗以800 x g离心5分钟）。最后一次清洗时，小心地将每个样品的颗粒悬浮在500μl 1x PBS中。如果颗粒太小（即肉眼几乎看不见），则将体积减小至100μl 1x PBS。
25. 在载玻片表面涂抹2.5μl PLS，直至其干燥，制备12个载玻片。
注意：请使用盖玻片将其铺在载玻片上。更多详细信息，请参见dasilva等人。（2018年）。
26. 将悬浮颗粒（从步骤B23开始）小心地摊铺在每个载玻片中。使用25-30μl并保存剩余体积，以备需要重新制作一些幻灯片。
注：请使用与PLS之前相同的表面。
27. 在室温下等待电池倒流并在载玻片上静置10-15分钟。确保电池不会干燥。
28. 在室温下每50μl的温度下加入渗透性PS。
29. 用1x PBS清洗每个含有细胞的载玻片三次。
注：用P1000微量吸管（通过打喷嚏）将1x PBS（1毫升）涂在载玻片上三次。
30. 遵循制造商制定的Click-iT EdU成像套件协议。
注意：协议可以在这里访问，主题是文件/手册和协议：
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C10337#/C10337.
31. 在制造商制定的方案结束时，确保从含有电池的载玻片表面清除所有液体，并添加4μl含有DAPI的Vectashield安装介质。
注：此溶液用作防褪色贴装液，用于染色含有DNA的细胞器。
32. 添加玻璃盖玻片和密封使用无色指甲油。等待清漆干燥5分钟。可以立即在荧光显微镜下分析载玻片，也可以在4°C下保存一个月。
33. （在每个样本中）搜索同一细胞（即citokynesis细胞）中含有两个EdU标记细胞核的寄生虫。从最短时间的样本开始，即加入EdU 30分钟后15分钟，然后继续进行其他样本（即加入EdU 30分钟后30分钟，加入EdU 30分钟后45分钟，等等）。
注：有关更多详细信息，请参见da Silva等人在图1D中的描述和图像。（2019年）。
34. 一旦观察到，请记下所需的时间。这是检测同一细胞中两个EdU标记的细胞核的最短时间。
注：获得的时间必须是EdU掺入的初始时间（30min）加上观察到两个EdU标记核的最短时间之和。在我们的例子中，这个时间是2小时。有关详细信息，请参阅dasilva等人。（2019年）。
35. 准备一套新的布鲁氏杆菌培养物，以估计EdU脉冲期间EdU标记细胞的百分比。培养细胞（28°C），直到达到指数期（~1 x 107个细胞/ml）。
注：指数相的电池密度因所用电池类型而异。
36. 在含有布氏锥虫细胞的培养液中加入100µM的EdU-S并等待1小时。
注：这将是EdU脉冲的持续时间，即1小时。
37. 通过离心法收获500µl培养物（800 x g，4°C下3分钟），并使用1 ml 1x PBS洗涤两次。
38. 完全按照前面描述的步骤B6-B13进行操作。
39. 遵循制造商制定的Click-iT EdU成像套件协议。
注意：协议可以在这里访问，主题是文件/手册和协议：
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C10337#/C10337.
40. 在制造商制定的方案结束时，确保从含有电池的载玻片表面清除所有液体，并添加4μl含有DAPI的Vectashield安装介质。
41. 添加玻璃盖玻片和密封使用无色指甲油。等待清漆干燥5分钟。可以立即在荧光显微镜下分析载玻片，也可以在4°C下保存一个月。
42. 计数至少100个细胞（总共），并确定细胞EdU标记。图2显示了布鲁氏杆菌EdU阳性细胞的代表性图像。
43. 检测EdU阳性细胞百分率。
44. 一旦您获得了所有必需的参数，请访问CeCyD网站：http://cecyd.vital.butatan.gov.br/，并输入值以获得所有细胞周期阶段的持续时间。注意S相持续时间。

图2。显示EdU阳性brucei细胞的代表性图像。染色显示细胞间有组织的DNA（DAPI-DAPI），显示细胞间有组织的DNA（DAPI-DAPI）。白色箭头表示EdU阳性细胞。比例尺=10μm。

C、用DNA梳合法估计复制率
本节的以下步骤描述了如何在T.brucei中获得复制率（用作示例）。然而，对于其他细胞类型，可直接从特定研究中获得复制率（如酿酒酵母（Sekedat等人，2010年）；哺乳动物细胞——MEFs细胞（Stanojcic等人，2016年）】。

1. 准备一套布氏锥虫培养物（这里，它是使用前环形式）来进行DNA组合分析。在10 ml培养液中用2 x 106细胞/ml开始培养。28℃孵育24小时，计数细胞密度。培养物的浓度必须为~1-2×107个细胞/ml，总共约为1-2×108个细胞。
注：DNA结合试验开始时的细胞密度因细胞类型而异。
2. 加入300µM的5′-碘-2′-脱氧尿苷溶液（IdU-S）并等待30分钟。
3. 添加500µM 5′-氯-2′-脱氧尿苷溶液（CldU-S），并等待30分钟。
注：不要在卤化胸苷类似物（IdU和CldU）合并之间洗涤。
4. 通过离心法收获整个培养物（1600 x g，4°C下3分钟），并使用1 ml 1x PBS洗涤两次。在第二次清洗中，将悬浮颗粒转移到1.5 ml微型离心管中。
5. 使用500µl DNA结合洗涤缓冲液（DC-WB）洗涤，并将颗粒悬浮在50µl DC-WB中。保持室温。
6. 制备2%低熔点琼脂糖：称取10mg低熔点琼脂糖于1.5ml离心管中。使用另一根1.5 ml离心管，加热500µl DC-WB（90°C，5分钟）。使用加热后的500µl DC-WB重新悬浮10 mg低熔点琼脂糖。混合均匀，使琼脂糖溶解。将溶液加热至65°C。
7. 准备可重复使用的塞子模式，以接收100µl琼脂糖+细胞混合物。
8. 将50µl琼脂糖溶液（来自步骤C6）轻轻混合在50µl再悬浮颗粒（步骤C5）中，总计100µl。立即添加到先前准备好的可重复使用的塞子模型中（从步骤C7开始）。待冷却，在4°C下孵育1h。
9. 在含有1.5μl的DNA的缓冲液中仔细地进行分离。
10. 在50°C下培养24小时。
11. 将DC-LB（轻轻地）替换为新的DC-LB（500µl），并在50°C下再培养24小时。
12. 在室温下用1ml T10E1缓冲液清洗两次（每次清洗）1h。
13. 加入1ml T10E1缓冲液（轻轻地）并在4°C下培养过夜。
14. 丢弃T10E1缓冲液，并在800µl 0.5 M MES（68°C下pH 5.5）中培养20分钟。然后，从68°C取出含有塞子的试管，并立即在42°C下培养10分钟。
15. 加入2μlβ-琼脂酶I（1000单位/ml），并在42°C下培养过夜。
注意：在此步骤中，添加β-200µl 0.5 M MES中的琼脂酶I。混合均匀，小心地将其添加到用800µl 0.5 M MES溶解的塞子中。
16. 将1ml 0.5mmes加入纤维束装置的储液罐中，制备分子梳理系统。接下来，小心地将含有溶解塞子的试管（从步骤C15）倒入含有1 ml 0.5 M MES的储液罐中。
注意：在这个阶段，从管子出来的液体中形成粘度是正常的。
17. 立即，将Combicoverslip放在FiberComb仪器上，并根据设备的指示拉伸DNA。
注：含有塞子的溶液在储液罐内溶解（即，并入DNA）可在4°C避光保存1周。
18. 将DNA拉伸到Combicoverslip上后，让其干燥几秒钟，并在65°C下培养2-4小时。
19. 将含有DNA拉伸后的混合物放在适当的容器中（例如，使用6孔平底板）。小心加入3ml DNA结合变性缓冲液（DC-DB），孵育20分钟。
20. 用1毫升1x PBS清洗三次。用2ml:70%乙醇、90%乙醇和100%乙醇（各1分钟）使含有DNA的盖玻片脱水。除去酒精，让Combicoverslip在室温下完全干燥。
21. 在37°C下用3 ml DNA结合阻断液（DC-BS）阻断20分钟。
22. 制备DNA结合一级抗体溶液（DC-PAS）。
注意：DC-PAS必须是新制备的，因为它可以立即使用。
23. 将20µl DC-PAS添加到含有延伸DNA的Combicoverslip顶部（从步骤C21开始）。用塑料盖玻片盖住。在37°C下避光培养1h。
24. 用1x PBS清洗两次，每次3分钟。
25. 制备DNA结合二级抗体溶液（DC-SAS）。
注意：DC-SAS必须是新制备的，因为它可以立即使用。
26. 将20µl DC-SAS添加到含有拉伸DNA的Combicoverslip顶部（从步骤C24开始）。用塑料盖玻片盖住。在37°C下避光培养1h。
27. 用1x PBS清洗两次，每次3分钟。
28. 制备DNA结合抗ssDNA溶液（DC-anti-ssDNA）。
注意：DC抗ssDNA必须是新制备的，因为它可以立即使用。
29. 在含有拉伸DNA的盖玻片顶部添加20µl DC抗ssDNA（从步骤C27开始）。用塑料盖玻片盖住。在37°C下避光培养2小时。
30. 用1x PBS清洗两次，每次3分钟。
31. 准备DNA梳理Alexafluor350（DC-alexa350）。
注意：DC-alexa350必须是新制备的，因为它可以立即使用。
32. 将20µl DC-alexa350添加到包含拉伸DNA的盖玻片顶部（从步骤C30开始）。用塑料盖玻片盖住。在37°C下避光培养1h。
33. 用1x PBS清洗两次，每次3分钟。
34. 确保所有的液体都从含有DNA拉伸的盖玻片上取下。将盖玻片贴在玻片上，加入20µl长效金防腐蚀剂。用无色指甲油密封，室温下干燥至少1小时。
35. 用荧光显微镜获取DNA纤维的图像。使用Cell F Olympus或ImageJ软件合并采集的图像。
笔记：
a。观察较长的DNA纤维需要捕获相邻的区域。
b。沿着每个分子的拉伸因子是恒定的（1µm=2 kb）。
c.c。分析中必须排除<100 kb的纤维，以提高分析的准确性。
d。必须从包含第一个模拟轨道（IdU）中添加包含第一个模拟轨道（IdU）或包含第二个模拟轨道（IdU）的复制，以确定第二个包含蓝色轨道（IdU）的复制。
e。绿色轨迹的长度必须从完整的绿色光纤测量：蓝绿-红（BGR）、红-绿-蓝（RGB）和蓝-绿-红-绿-蓝（BGRGB）事件。
36. 使用以下公式估计平均复制速率：

（一）

其中v是平均复制速率（inkb.分钟-1） n为分析的DNA纤维数，t为CldU脉冲时间（分钟）。
注：必须至少进行三次独立的化验，以提高化验的准确性

数据分析

1. 并用前面得到的染色体复制率公式（i）计算各染色体的平均着丝粒数。

（二）

问题是染色体复制的平均持续时间。N五S
注：如果公式右侧的结果是一个单位的分数，则下一个更高的整数单位必须作为公式的结果，它由上限函数表示(⌈ ⌉).

2. 准备一张表格来添加发现的MO值，并将其与其他方法（如DNA梳理、MFA序列分析）估计/映射的复制源数量进行比较。表1和表2中的AES可用于证明表1中的任何生物体。

表1。比较T.brucei中的MO、MFA-seq技术绘制的起源（Tiengwe等人，2012年）和DNA梳理法估计的起源（Stanojcic等人，2016年）

S期持续时间=138.6分钟（da Silva等人，2019年），复制率=1.84 kb·min-1（Stanojcic等人，2016年）。本表中的数值最初发表于（da Silva等人，2019年）。

表2。比较酿酒酵母中的MO、已知复制起源（Nieduszynski等人，2006年）和DNA梳理估算的来源（Lengronne等人，2001年）

S相持续时间=30分钟（Brewer等人，1984年；Ivanova等人，2020年），复制率=1.6 kb·min-1（Sekedat等人，2010年）。本表中的数值最初发表于（da Silva等人，2020年）。

3. 建立一个图表，以显示所分析的每种方法的趋势线（图3为布鲁氏杆菌，图4为酿酒酵母）。

图3。布鲁氏菌起源估计方法的比较分析。图中显示了染色体大小与来源数量之间的正相关：MO（黑色）、MFA-seq（蓝色）和DNA梳理（红色）估算的起源数量。给出了这些方法的趋势线和方程。图表图例中引用了研究结果。图中所示的数据最初发表在da Silva et al。（2019年）。

图4。用于估计酿酒酵母起源的不同方法的比较分析。图中显示了染色体大小与来源数量之间的正相关：MO（黑色）、已知复制来源（绿色）和DNA梳理估算的来源（红色）。给出了这些方法的趋势线和方程。图表图例中引用了研究结果。图中所示的数据最初发表在da Silva et al。（2020年）。

可以观察到起源数目与每条染色体大小之间的预期正相关，即染色体越大，在S期内复制它所需的起源越多。MO允许建立一个阈值，该阈值可以作为其他方法的参数。例如，在T.brucei（图3）中，当比较MO值与MFA-seq值时，很明显有些染色体不能只与MFA-seq所映射的原点重复，即有些蓝圈超出了MO值设定的阈值（黑色虚线）。简单地说，原因是由于MFA-seq方法的分辨率较低，并且绘制的主要是结构性（频繁）成因（da-Silva等人，2019年和2020年）。进一步的分析和完整的解释可以在衍生该方法的原始出版物中找到（da Silva et al.，2019）。

笔记

A、一般注意事项
1. 如果染色体大小、S期持续时间和复制率的值已在文献中提供（即，可以从其他研究中获得），则“程序”中描述的步骤A-C是不必要的。
2. 程序中描述的步骤c中分析的DNA纤维（n）的数量必须尽可能高，因为n越高，对复制率的估计就越准确。

B、技术提示
1. 为了避免在估计EdU阳性细胞的过程中出现假阳性（步骤B），采集步骤中不要过度曝光荧光图像。
2. 卤化胸苷类似物（IdU和CldU）的孵育时间根据倍增时间（程序步骤C）而变化，并且可以针对其他细胞类型进行优化。这同样适用于EdU（EdU脉冲）的培养时间（步骤B）。
3. 如果可能的话，在黑暗中进行DNA梳理的整个过程（步骤C），因为加入卤化胸苷类似物的DNA对光更敏感。

食谱

1. 磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）
137毫米NaCl 2.7毫米KCl 10毫米Na2HPO4 2毫米KH2PO4
a、将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4加入800 ml蒸馏水中制备缓冲液
b、用盐酸将pH调至7.4
c、用蒸馏水使体积达到1L
d、将溶液分为小份（如250毫升）并通过高压灭菌（20分钟，120°C，液体循环）进行灭菌
e、在室温下储存6个月
f、长时间使用后检查pH值
2. 氯化血红素溶液（HS）
50毫克/毫升氯化血红素
a、将50 mg氯化血红素和1 ml 1 M NaOH加入80 ml MilliQ水中制备溶液
b、用磁力搅拌器使劲搅拌
c、用MilliQ水将体积增加到100毫升
d、过滤灭菌（使用0.22μm过滤器）
e、在4°C下储存一个月
3. SDM-79培养基（用于培养布氏原环细胞）90%（v/v）SDM-79培养基（不完全）
10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）
7.5微克/毫升氯化血红素
0.134微克/毫升硫酸链霉素盐0.060微克/毫升青霉素g钠盐
a、通过在400 ml SDM-79培养基（不完整）中添加50 ml热灭活FBS、75µl HS、67 mg硫酸链霉素盐和30 mg青霉素G钠盐来制备培养基
b、将pH调至7.3，并用SDM-79培养基（不完全）将体积补充至500毫升
c、过滤灭菌（使用0.22μm过滤器）并分配到小份（例如100 ml）
d、在4°C下储存一个月
4. 5′-氯-2′-脱氧尿苷溶液（CldU-S）
10 mM CldU在水中稀释
a、将26.26 mg 5′-氯-2′-脱氧尿苷加入9 ml水中制备缓冲液
b、溶解并使体积达到10毫升
c、过滤消毒（使用0.22μm注射器过滤器），并将溶液分为小份（如1 ml）
d、在-20°C下储存6个月
5. 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷溶液（EdU-S）
在1x PBS中稀释10 mM EdU
a、通过将2ml 1x PBS添加到Click-iT®EdU成像套件的组分a中，制备溶液
b、混合均匀使其溶解
c、过滤消毒（使用0.22μm注射器过滤器），并将溶液分为小份（如1 ml）
d、在-20°C下储存6个月
6. 5′-碘-2′-脱氧尿苷溶液（IdU-S）
在碱化水中稀释10 mM的IdU
注：IdU在生理pH值下不易溶解。
a、将35.4 mg 5′-碘-2′-脱氧尿苷加入5 ml碱化miliq水中制备缓冲液（使用5 M NaOH和pH计将Milli-Q水的pH值调整为9.5）
b、溶解并用Milli-Q水将其溶解至10mL
c、过滤消毒（使用0.22μm注射器过滤器），并将溶液分为小份（如1 ml）
d、在-20°C下储存6个月
7. 0.5 M EDTA，pH值8.0
a、在800 ml蒸馏水中加入186.1 g EDTA·2H2O二钠，制备溶液
b、在磁力搅拌器上剧烈搅拌，同时用NaOH（约20 g NaOH颗粒）将pH调至8.0
c、用蒸馏水将体积增加到1升
d、分为小份（如250毫升）并通过高压灭菌灭菌
e、在室温下储存6个月
8. 0.65 M EDTA，pH值8.0
a、将24.2 g EDTA·2H2O二钠加入80 ml蒸馏水中制备溶液
b、在磁力搅拌器上剧烈搅拌，同时用NaOH将pH调至8.0
c、用蒸馏水将体积增加到100毫升
d、高压灭菌器
e、在室温下储存一个月
9. 1.5 M Tris HCl，pH值8.8
a、将181.65 g Tris碱加入800 ml MilliQ水中制备溶液
b、使用浓盐酸将pH值调节至8.8
c、用MilliQ水将体积提高到1L
d、分为小份（如250毫升）并通过高压灭菌灭菌
e、在室温下储存6个月
10. 1M氯化钠
a、在800 ml蒸馏水中加入58.44 g NaCl制备溶液
b、在磁力搅拌器上用力搅拌（加热帮助溶解）
c、用蒸馏水将体积增加到1升
d、分为小份（如250毫升）并通过高压灭菌灭菌
e、在室温下储存一年
11. 70%乙醇
a、在15 ml蒸馏水中加入35 ml无水乙醇制备溶液
b、充分搅拌，并在4°C下储存一年
12. 90%乙醇
a、通过在5 ml蒸馏水中添加45 ml无水乙醇来制备溶液
b、充分搅拌，并在4°C下储存一年
13. DNA梳理洗涤液（DC-WB）
100毫米EDTA，pH值8.0
10毫米Tris HCl
20毫米氯化钠
a、通过在77.33 ml MilliQ水中添加20 ml 500 mM EDTA、666µl Tris HCl和2 ml NaCl来制备缓冲液
b、混合均匀，过滤灭菌（使用0.22μm过滤器）
c、在4°c下储存一个月
14. DNA结合裂解缓冲液（DC-LB）
0.65 EDTA，pH值8.0
1%N-月桂酰肌氨酸
100μg/ml蛋白酶K
a、将50µg N-月桂酰肌氨酸和500µg蛋白酶K加入4 ml 0.65 M EDTA（pH 8.0）中制备缓冲液
b、混合均匀，使用0.65 M EDTA（pH 8.0）将体积增至5 ml
c、室温下储存一周
15. DNA梳理阻断液（DC-BS）
1个PBS
1%牛血清白蛋白（BSA）
0.1%Triton X-100
a、在9880µl 1x PBS中加入100µg BSA和10µl Triton X-100，制备溶液
b、混合均匀，过滤灭菌（使用0.22μm过滤器）
c、在4°c下储存一周
16. DNA结合变性缓冲液（DC-DB）
0.5 M氢氧化钠
1M氯化钠
a、在8 ml蒸馏水中加入200 mg NaOH和58.4 mg NaCl制备溶液
b、混合均匀，用蒸馏水将体积增加到10毫升
c、室温下储存一周
17. DNA结合初级抗体溶液（DC-PAS）
1/10抗IdU（小鼠抗BrdU）
1/10抗CldU（大鼠抗BrdU）
100%直流-断路器
a、通过在16µl DC-BS中添加2µl抗IdU和2µl抗CldU来制备溶液
b、搅拌均匀，立即使用
18. DNA结合二级抗体溶液（DC-SAS）
1/20抗鼠Alexafluor 568
Alexa 488抗氟鼠
100%直流-断路器
a、通过在18µl DC-BS中添加1µl抗鼠Alexafluor 568和1µl抗鼠Alexafluro 488来制备溶液
b、搅拌均匀，立即使用
19. DNA结合抗ssDNA溶液（DC-anti-ssDNA）
1/5抗ssDNA（小鼠抗ssDNA）
100%直流-断路器
a、通过在16µl DC-BS中添加4µl抗ssDNA来制备溶液
b、搅拌均匀，立即使用
20. DNA梳理Alexafluor350（DC-alexa350）
1/10抗鼠Alexafluor 350
100%直流-断路器
a、通过在18µl DC-BS中添加2µl抗鼠Alexafluor 350来制备溶液
b、搅拌均匀，立即使用
21. T10E1缓冲器
10毫米Tris HCl，pH值8.8
1毫米EDTA，pH值8.0
a、通过混合66.6µl 1.5 M Tris HCl、20µl 0.5 M EDTA和9913µl MilliQ H2O制备缓冲液
b、混合均匀，过滤灭菌（使用0.22μm过滤器）
c、在4°c下储存一个月
22. 0.5 M MES缓冲液，pH值5.5
a、在80 ml蒸馏水中加入9.76 g MES游离酸制备溶液
b、用磁力搅拌器使劲搅拌
c、使用NaOH将pH值调整到5.5
d、使用蒸馏水将体积增加到100毫升
e、高压灭菌
f、在室温下储存一个月
23. 固定缓冲液（FB）4%（w/v）多聚甲醛（1x PBS）
a、在40 ml 1x PBS中加入2.1 g多聚甲醛（粉末，95%）制备缓冲液
b、用1x PBS溶解并使体积达到50 ml
c、在4°c下储存一个月
24. 聚赖氨酸溶液（PLS）0.1%（w/v）聚赖氨酸盐酸盐在水中稀释
a、将10毫克聚赖氨酸盐酸盐加入9毫升水中制备缓冲液
b、溶解并用水使体积达到10毫升
c、过滤消毒（使用0.22μm注射器过滤器），并将溶液分为小份（如1 ml）
d、在4°C下储存6个月
25. 渗透溶液（PS）
在1x PBS中稀释0.1%（v/v）Triton X-100
a、通过在9990μl 1x PBS中添加10μl Triton X-100制备缓冲液
b、混匀，过滤灭菌（使用0.22μm注射器过滤器），并将溶液分为小份（如1ml）
c、在4°c下储存6个月

致谢

这项工作来源于dasilva等人。（2019年）和da Silva等人。（2020年）。本文提出的方案的制定得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）-毒素、免疫反应和细胞信号中心（CeTICS）的资助，资助资金为2014/24170-5和2017/18719-2。目前，Marcelo S.da Silva是FAPESP的研究员（拨款2019/10753-2和2020/10277-3）。

相互竞争的利益

作者声明这篇文章的发表不存在利益冲突。

工具书类

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