材料和试剂
TRIVET系统的构建
细菌菌株和质粒
一种。大肠杆菌DH5αλ PIR ˚F -恩达1 glnV 44 THI -1的recA 1 RELA 1的gyrA 96 deoR nupG Φ80d的lacZ ΔM15Δ（lacZYA - ARGF ）U 169 HSDR 17（R ķ -米ķ + ）λ PIR RK6 （54）

b。大肠杆菌XL-1个F ':: Tn10转的ProA + B + LAC q Δ（lacZ启动）M15 / recA基因1恩达1的gyrA 46（NAL - [R ）THI HSDR 17（R ķ -米ķ + ）SUPE 44 RELA 1个lac启动（新英格兰生物实验室）

C。大肠杆菌SM10λ pirthi -1 THR亮氨酸TONA拉齐SUPE的recA :: RP4-2锝::穆λ PIR RK6 （Miller和Mekalanos，1988）

d。E7946（O1 El Tor Inaba），Sm R的霍乱弧菌WT自发链霉素抗性（Sm R ）突变体（Miller等人，1989）

e。pCVD442自杀载体，OriR6K，sacB，Ap R （Donnenberg和Kaper，1991）

F。pAC1000 Cm R （Hava et al。，2003）

G。pGOA1193 pIVET5n tnpR，oriR6K mobRP4 lacZ tnpR，Ap R （Osorio et al。，2005）

H。pGP704 oriR6K mobRP4，Ap R （Miller and Mekalanos，1988）

一世。pTrc99A-Km pBR322来源，Km R （Amann等，1988）

j。pRR51 （Reed和Grindley，1981年）

k。pSL134 pPCR-Script：:( res1 - res1 ）（Osorio et al。，2005）

l。pPCR-Script Amp SK（+）（Stratagene）

米 pGAO2 [pPCR-Script：:( res ）（Osorio et al。，2005）]

。pGAO3 [pPCR-Script：:( res1 ）（Osorio et al。，2005）]

o。pGAO4 [pPCR-Script：:( res - res ）（Osorio et al。，2005）]

p。pGAO5 [pPCR-Script：:( res1 - res1 ）（Osorio et al。，2005）]

q。pGAO6 [pGOA4 :: neo - sacB （Osorio et al。，2005）]

河 pGAO7 [pGOA5 :: neo - sacB （Osorio et al。，2005）]

s。带res-neo-sacB-res盒的pRes pSL111，Km R （Osorio et al。，2005）

t。带res1-neo-sacB-res1盒Km R的pRes1 pSL111 （Osorio et al。，2005）

你基于pLOFKm Tn10的传递质粒Km R ，Ap R （Herrero et al。，1990）

寡核苷酸
一种。tetR-5'-BamHI AATGGATCCTAGAGTGTCAACAAAAATTAGGAATTA

b。tetR-3'- Kpnl TTAGGTACCATCACGGAAAAAGGTTATGCT

C。phoA-5'-KpnI TTTGGTACCTTTTTAATGTATTTGTACATGGAGAA

d。phoA-3′-XbaI AAATCTAGACATTAAGTCTGGTTGCTAACAGCA

e。猫5'-XbaI AAATCTAGATAAGCTTGATGAAAATTTGTTTGA

F。cat-3'-BamHI TTTGGATCCTTCTTCAACTAACGGGGCA

G。tetRphoAcat-5'-NotI TATGCGGCCGCCCCCTAGGTAATTAGGATCCTAGAGT

H。tetRphoAcat-3'-NotI TTTGCGGCCGCCCTAGGTCTCATCCGCCAAAACAGCCAA

一世。lacZ-5'-SacI TTTGAGCTCTGATTTACCGCCGCTGCCAA

j。lacZ-3′-NheI TTTGCTAGCTTATTGTGGGGGAGATGACGCTTT

k。tnpR-5′- BgIII CGACCCGGGAGATCTCAATTGTTCGAATTTAGGATACATTTTTAT

l。tnpR-3′-XbaI TTTTCTAGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT

米 PtetA-5′- 3′CTAGCCAGAGAGCCTTAAGGCTCTCTTTTTTCTAATTTTTGTTGACACC

CTATCAGTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGA

。PtetA-3′- 5′GATCTCTATCACTGATAGGGAGTGGTAAAATAACTCTATCACTGATAGG

GTGTCAACAAAAATTAGAAAAAAGAGAGCCTTAAGGCTCTCTG G

o。Ptet1-5′- 3′CTAGCAGAGAGCCTTAAGGCTCTCTTTTTTCTAATTTTTGTCCCTATCA

GTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCACATCA

p。Ptet1-3′- 5′GATCTGATGTGCTCAGTATCTCTATCACTGATAGGGATGTCAATCTCTAT

CACTGATAGGGACAAAAATTAGAAAAAAGAGAGCCTTAAGG CTCTCTG

q。1RES-F TCTATTGAATTCCGTCCGAAATATTATAAATTATCGCAC

河 1RES-R TCTAATCTCGAGTGTATCCTAAATCAAATATCGGACAAG

s。1RES1-F TCTAATGAATTCCGTCCGAAATATTACAAATTATCGCAC

t。2RES-F TCTAATCTCGAGTCTAGACGTCCGAAATATTATAAATTATCGCAC

你 2RES1-F TCTAATCTCGAGTCTAGACGTCCGAAATATTACAAATTATCGCAC

诉2RES-R TCTAATGGTACCTGTATCCTAAATCAAATATCGGACAAG

w。T3 AATTAA CCCTCACTAAAGGG

X。T7 AATACGACTCACTATAGGGC

用料
一种。移液器吸头（Greiner Bio-One，目录号：740290、739290和771291）

b。PCR管（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB0266）

C。双重蒸馏H 2 O（ddH 2 O）

d。dNTPs，10 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0192）

e。DNA上染染料（6x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）

F。Q5高保真DNA聚合酶（NEB，货号：M0491S）

G。Taq DNA聚合酶（NEB，货号：M0273S）

H。GeneRuler 1 kb Plus DNA梯子（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM1331）

一世。QIAquickGel提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）

j。QIAquickPCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）

k。QIAprep Spin Miniprep试剂盒（QIAGEN，目录号：27104）

l。剪切智能缓冲区（NEB，目录号：B7204S）

米适当的限制酶（NEB）

。南极磷酸酶（NEB，目录号：M0289S）

o。T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202S）

p。T4 DNA连接酶缓冲液（NEB，目录号：B0202S）

q。甘油（AppliChem，目录号：A0970,1000）

河酵母提取物（Applichem ，目录号：A1552）

s。Bacto Tryptone（Thermo Fisher Scientific，目录号：211701）

t。NaCl（VWR，目录号：27810.364）

你琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5054）

v。用于质粒载体的适当抗生素（例如，氨苄青霉素，卡尔·罗斯，目录号：K029.2）

w。LB琼脂板含有用于质粒载体的适当抗生素（请参见食谱）

X。LB培养基（请参阅食谱）

TRIVET库的构建
细菌菌株和质粒
一种。大肠杆菌DH5αλ PIR ˚F -恩达1 glnV 44 THI -1的recA 1 RELA 1的gyrA 96 deoR nupG Φ80d的lacZ ΔM15Δ（lacZYA - ARGF ）U 169 HSDR 17（R ķ -米ķ + ）λ PIR RK6

b。大肠杆菌SM10λ PIR THI -1 THR列伊托纳拉齐苏佩的recA :: RP4-2锝::穆λ PIR RK6

C。E7946（O1 El Tor Inaba），Sm R的霍乱弧菌WT自发链霉素抗性（Sm R ）突变体（Miller等人，1989）

d。pCVD442自杀载体OriR6K，sacB和Ap R （Donnenberg和Kaper，1991）

e。带res - neo - sacB - res盒的pRes pSL111 ，Km R （Osorio et al。，2005）

F。带res1 - neo - sacB - res1盒的pRes1 pSL111 ，Km R （Osorio et al。，2005）

G。pLOF :: tpc （Cakar等人，2018）

H。pTRIVET （Cakar等人，2018）

一世。pTRIVET1 （Cakar等人，2018）

j。pRES [pSL111 ::（（res - neo - sacB - res ）（Osorio et al。，2005）]

k。pRES1 [pSL111：:( res1 - neo - sacB - res1 ）（Osorio et al。，2005）]

寡核苷酸
一种。tetRphoAcat-5'-SacI ATAGAGCTCAGAGTGTCAACAAAAATTAGGAATTAA

b。tetRphoAcat-3'-SalI TTTGTCGACTTCTTCAACTAACGGGGCA

C。irgA-SphI-1 AATGCATGCTCCGAGTAAACCGCAAACACTT

d。irgA-SacI-2 AATGAGCTCGTATCCCGCCGCAGTGACCA

e。irgA-SalI-3 AAAAGTCGACCGAACTATTCCATGTGT

F。irgA-XbaI-4 AATTCTAGACGTGAGGTTTGGCGCTTA

G。yrb_SacI_1 AAAGAGCTCGCGATATTGGCAATGTTTGAAC

H。yrb_SphI_2 AAAGCATGCGATAAGGATAATTAATTGGAATC

一世。yrb_SalI_3 AAAGAATTCTCAGGATGTCGACCTAACAG

j。yrb_XbaI_4 TTTTCTAGAGATTAAGGTTACGGATCAGTTC

k。seqPrimer-cat GAATTGTCAGATAGGCCTAATG

用料
一种。PCR管（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB1771）

b。针26G（B 。布劳恩，目录号：4657683）

C。管管（Thermo Scientific，目录号：10793527）

d。针管注射器1毫升（Henry Schein，目录号：9003016）

e。5日龄CD-1小鼠

F。双重蒸馏H 2 O（ddH 2 O）

G。dNTPs，10 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0192）

H。DNA上染染料（6x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）

一世。Q5高保真DNA聚合酶（NEB，货号：M0491S）

j。Taq DNA聚合酶（NEB，货号：M0273S）

k。GeneRuler 1 kb Plus DNA梯子（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM1331）

l。QIAquickGel提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）

米 QIAquickPCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）

。QIAprep Spin Miniprep试剂盒（QIAGEN，目录号：27104）

o。QIAprepMidiprep套件（QIAGEN，目录号：12143）

p。剪切智能缓冲区（NEB，目录号：B7204S）

q。适当的限制酶（NEB）

河南极磷酸酶（NEB，目录号：M0289S）

s。T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202S）

t。T4 DNA连接酶缓冲液（NEB，目录号：B0202S ）

你酵母提取物（Applichem，目录号：A1552）

诉的NaCl（VWR，目录号：27810.364）

w。Bacto Tryptone（Thermo Fisher Scientific，目录号：211701）

X。琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A5054）

y。质粒载体的适当抗生素（例如氨苄青霉素，卡尔·罗斯，目录号：K029.2）

z。Tris（Sigma-Aldrich，目录号：10708976001）

啊 MgSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：M7506）

bb。ZnCl 2 （西格玛奥德里奇，目录号：746355）

抄送 SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）

dd。氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：372978）

ee。KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P0662）

ff。磷酸对硝基苯酯（Sigma-Aldrich，目录号：4876）

gg。EDTA （Sigma-Aldrich，目录号：03620）

嗯异氟烷IsoFlo（Zoetis，目录号：50019100）

ii。琼脂糖peqGOLD（VWR，目录号：732-2789）

j 50x TAE缓冲液（Thermo Scientific，目录号：10399519）

kk。2,2'-联吡啶（Sigma-Aldrich，目录号：D216305）

二。FeSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：450278）

毫米 X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷; Thermo Scientific，目录号：R0404）

nn。DMSO（Roth，目录号：4720）

喔 LB琼脂板含有用于质粒载体的适当抗生素（请参见食谱）

第LB培养基（见配方）

qq。蔗糖琼脂平板（请参见食谱）

设备

移液器（Eppendorf）
组合兽医异氟烷给药仪（Rothacher，目录号：CV 30301）
剪刀（Thermo Scientific，目录号：10694962）
镊子（Thermo Scientific，目录号：15809651）
组织匀浆器（Biospec，目录号：985370）
Vortexer（Thermo Fisher Scientific）
孵化器（Thermo Fisher Scientific，ThermoScientific TM ，型号：Heraeus B12功能线，目录号：50042307）
微量仪（Eppendorf，型号：CentrifugeMiniSpin ®，目录号：5452000018）
热循环仪（Bio-Rad C1000）
NanoDrop TM （ND 2000）
光度计（贝克曼DU730）

软件

blastN（blast.jcvi.org/cmr-blast/）
T m计算器软件（例如NEB T m计算器）

程序

通用协议
PCR扩增片段以构建质粒
对于PCR反应，请遵循各个制造商的规程。简而言之，温度计算如下：将每个杂交AT对的温度为2°C，将每个GC对的温度为4°C。在扩增的片段的长度之后计算延伸时间，并且循环量为30。基于本文使用的试剂，用于PCR扩增用于质粒质粒构建的片段的PCR反应的标准配方为：

试剂量（微升）

染色体DNA 8

dNTP的5

底漆I（1 µg / ml）5

底漆II（1 µg / ml）5

GC增强剂20

Q5聚合酶3

Q5聚合酶缓冲液25

ddH 2 O 32

一种。进行PCR反应。

b。向PCR反应中添加适量的加载染料，并使用0.8至1％的琼脂糖凝胶通过水平凝胶电泳分离条带。10 V每厘米凝胶。

C。从琼脂糖凝胶中提取条带，并按照制造商的说明通过QIAGEN凝胶提取试剂盒纯化相应的PCR片段。

菌落PCR
对于PCR反应，请遵循各个制造商的规程。用于菌落PCR的模板源自使用移液器尖端从琼脂板中挑选的菌落。将选定的菌落重悬于50 µl ddH 2 O中，并在100°C下煮沸10分钟。基于本文使用的试剂，用于PCR扩增片段以构建质粒的PCR反应的标准配方为：

试剂量（微升）

模板（殖民地重煮）3

dNTP的0.5

底漆I（1 µg / ml）0.5

底漆II（1 µg / ml）0.5

热聚合酶缓冲液2.5

Taq聚合酶0.25

ddH 2 O 17.75

一种。进行PCR反应。

b。向PCR反应中添加适量的上染染料，并使用0.8至1％的琼脂糖凝胶通过水平凝胶电泳分离条带，并施加约10,000倍。10 V每厘米凝胶。

限制性消化
对于限制性摘要，请遵循各个制造商的规程。基于本文使用的试剂进行限制性消化的标准配方为：

试剂量（微升）

质粒（通过QIAGEN质粒Midi试剂盒分离； 100 ng / µl）5

限制酶I 1.5

限制酶II 1.5

10x缓冲液（适合酶）10

ddH 2 O 81

要么

试剂量（微升）

PCR片段（通过QIAGEN凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化； 100 ng / µl）15

限制酶I 1.5

限制酶II 1.5

10x缓冲液（适合酶）10

ddH 2 O 71

一种。使用APPR执行过夜（ON）消化opriate限制性内切酶组合根据S和温度到制造商的指示。在PCR片段的情况下，本文合适的限制酶由寡核苷酸的名称指示（参见上面的寡核苷酸列表）。

b。在限制性消化的情况下，使用PLA小号米IDS，去磷酸化5 ' -ends通过加入1在37℃微升南极磷酸酶的混合物，并培育1个小时下进行。

C。向样品中添加适量的上样染料，并使用0.8％至1％的琼脂糖凝胶通过水平凝胶电泳分离条带，并施加约5％的染料。10 V每厘米凝胶。

d。从琼脂糖凝胶中精确条带化，并按照制造商的说明通过QIAGEN凝胶提取试剂盒从凝胶中纯化线性化，去磷酸化的质粒。

e。如果使用PCR片段进行限制性酶切，请在65°C灭活10分钟。

F。随后按照制造商的说明使用QIAGEN PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR片段。

结扎
对于结扎，请遵循各个制造商的规程。基于本文使用的试剂进行限制性酶切的标准配方为：

试剂量（微升）

质粒（消化+去磷酸酶； 30 ng / µl）5

PCR片段I（已消化； 30 ng / µl ）5.75

PCR片段II（已消化； 30 ng / µl ）5.75

10x DNA连接酶缓冲液1.5

T4 DNA连接酶1

一种。在室温下连接1小时。

b。在65°C灭活连接酶10分钟。

PhoA分析
在体外测试条件下将菌株培养至对数生长期后期（例如，此处LB在37°C和180 rpm下（在irgA融合菌株的情况下补充2,2'-联吡啶或FeSO 4 ））。
使用微量离心机（5分钟，6,000 xg ，室温）沉淀每种培养物1 ml 。
在P1缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM MgSO 4 ）中洗涤细胞一次，然后将沉淀重悬于1 ml P1缓冲液中。
在0.9 ml P1缓冲液中稀释来自步骤A5c的0.1 ml重悬细胞，并测量OD 600 。
将来自步骤A5c的0.1 ml重悬细胞添加到0.9 ml P2缓冲液（1 M Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM ZnCl 2 ）中。同时，准备没有细胞的阴性对照。
向每个样品中加入50 µl的0.1％SDS和50 µl的氯仿，涡旋振荡并在室温下孵育10分钟以使细胞通透。
要开始酶促反应，向每个试管，涡旋和记录时间添加0.1 ml的0.4％对硝基苯基磷酸酯（在1 M Tris-HCl中，pH 8.0）。
孵育每个试管直至出现浅黄色，然后加入120 µl 0.1 M EDTA，pH 8.0、1 M KH 2 PO 4终止反应并记下时间。
使用阴性对照样品作为空白，测量每个样品的OD 420 。
计算反应开始和停止之间的持续时间。
使用数据分析一章中所述的公式计算PhoA活性。

鉴定霍乱弧菌体内阻抑（ivr）基因的随机方法
TRIVET组件的构造
TRIVET系统需要部分基于RIVET的组件构造几个元素（Osorio等，2005）。

一种。通过转座子诱变构建用于随机整合到细菌染色体中的tetR-phoA-cat （tpc ）盒。

为了获得最佳的PCR结果，请计算所有给定寡核苷酸的最佳T m 。
PCR使用来自大肠杆菌XL-1的染色体DNA和寡核苷酸对tetR-5'-BamHI和tetR-3'-Kpnl扩增无启动子的tetR片段（有关详细信息，请参阅Ste p A1）。
PCR扩增的无启动子的phoA启动-Fragment使用染色体DNA从SM10λ PIR寡核苷酸对phoA启动-5'- KpnI和phoA启动-3'-的XbaI （见S TE p A1的详细信息）。
PCR从pAC1000扩增cat 。寡核苷酸将cat-5'与XbaI和cat-3'与BamHI配对（有关详细信息，请参阅Ste p A1）。
凝胶纯化PCR片段，然后进行限制性酶切和第二次纯化（有关详细信息，请参阅Ste ps A1和A3 ）。
消化（使用BamHI），去磷酸化并凝胶纯化pTrc99A-Km（有关详细信息，请参阅Ste p A3）
将消化的tetR- ，phoA-和猫片段连接到BamHI消化并去磷酸化的pTrc99A-Km中，以获得pTrc-tpc质粒（有关详细信息，请参阅Ste p A4）。
转化到感受大肠杆菌DH5αλ PIR细胞并通过在LB琼脂电镀补充有卡那霉素（KM）和氯霉素（CM）中进行选择。
在37°C下孵育平板过夜。
使用寡核苷酸对tetR-5'-BamHI和cat-3'-BamHI通过菌落PCR确认正确的pTrc-tpc构建体。
用正确的pTrc-tpc构建体在LB-Km / Cm + 2％葡萄糖（Glc）中生长验证的菌落，在37°C和180 rpm下过夜。
使用QIAprep MidiprepKit隔离pTrc-tpc。
PCR扩增整个tetR的- phoA启动-猫（TPC使用寡核苷酸对tetRphoAcat -5'- NotI和tetRphoAcat -3'- NotI位）r -盒（见S TE p A1的详细信息）。
凝胶纯化PCR片段，然后用NotI进行限制性酶切消化，然后进行第二次纯化（有关详细信息，请参阅Ste ps A1和A3）。
结扎纯化，NotI位消化的TPC r -盒到NotI位消化，脱磷酸的pLOFKm获得pLOF :: TPC（见S TE PS A1，A3和A4的详细信息）。
变换连接产物到感受大肠杆菌DH5αλ PIR细胞和琼脂补充有氨苄青霉素（AP）与Cm通过电镀在LB选择。
在37°C下孵育平板过夜。
使用寡核苷酸对tetR-5'-BamHI和cat-3'-BamHI，通过菌落PCR确认正确的pLOF :: tpc构建体（有关详细信息，请参阅Ste p A2）。
在LB-Ap / Cm + 2％Glc中以正确的pLOF :: tpc构建物生长经过验证的菌落，在37°C和180 rpm下过夜。
按照制造商的说明，使用QIAprep Spin Miniprep Kit分离pLOF :: tpc 。
变换PRES和前S1到感受SM10λ PIR细胞，并通过电镀在LB琼脂中选择补充有鸭。
在37°C下孵育平板过夜。
b。pTRIVET和pTRIVET1质粒的构建

使用寡核苷酸对lacZ-5'-SacI和lacZ-3'-NheI，PCR从霍乱弧菌WT染色体DNA扩增lacZ片段。
PCR使用寡核苷酸对tnpR-5'-BgIII和tnpR-3'-XbaI从pGOA1193扩增tnpR片段。
凝胶纯化的PCR片段，随后restric吨离子消化和第二纯化（见S TE PS A1和A3的详细信息）。
混合寡核苷酸对PtetA-5'-3'和PtetA-3'-5'或Ptet1-5'-3'和Ptet1-3'-5'，煮沸寡核苷酸混合物5分钟以确保变性并在室温下冷却。这将允许寡核苷酸对在每个末端上具有相容的NheI和BglII位点杂交。生成的ds DNA序列包含原始的tetA启动子序列p tet （在PtetA-5'-3'和PtetA-3'-5'的情况下），或者对于不太严格的转录调控，稍微改变的tetA启动子序列p tet1具有突变TetR结合位点（在Ptet1-5'-3'和Ptet1-3'-5 '的情况下）。
将消化的lacZ片段，消化的tnpR片段和两个tetA启动子序列版本（p tet或p tet1 ，通过步骤B1bviii获得）之一连接到SacI / XbaI消化的，去磷酸化的pGP704中，从而得到包含启动子的pTRIVET p tet或pTRIVET1分别包含启动子p tet1 （有关详细信息，请参阅步骤A4）。
变换连接产物到感受DH5αλ PIR细胞，并通过电镀在LB琼脂中选择补充有鸭。
在37°C下孵育平板过夜。
确认正确pTRIVET或pTRIVET1 CON小号使用寡核苷酸对通过菌落PCR tructs lacZ启动-3'- SacI和TNPR -3'-的XbaI以及限制分析。
在37°C和180 rpm下，在LB-Ap + 2％Glc中用正确的pTRIVET或PTRIVET1培养经过验证的菌落过夜。
通过QIAprep Spin Miniprep试剂盒按照制造商的规程分离pTRIVET和pTRIVET1质粒。
变换pTRIVET和pTRIVET1到感受SM10λ PIR细胞，并通过电镀在LB琼脂中选择补充有鸭。
在37°C下孵育平板过夜。
C。根据Osorio等人的方法构建pRes和pRes1 。（2005年）

PCR使用pRR51作为模板，通过寡核苷酸对1RES-F和1RES-R通过PCR扩增res序列（有关详细信息，请参见步骤A1）。或者，PCR使用pSL134和寡核苷酸对1RES1-F和1RES1-R通过PCR扩增res1序列（有关详细信息，请参见步骤A1）。
凝胶纯化PCR片段，然后进行限制性酶切（使用EcoRI和XhoI）和第二步纯化（有关详细信息，请参见步骤A1和A3）。
结扎消化的PCR片段引入到Ñ的EcoRI / XhoI位消化，脱磷酸的PPCR脚本放大器SK（+）（Stratagene）中以产生质粒pGOA2和pGOA3（详见步骤A4）。
使用第二组寡核苷酸对（2RESF和2RESR或2RES1F和2RESR）进行PCR扩增res或res1的第二个拷贝。将它们紧接着与它们在pGOA2和pGOA3中的对应物亚克隆以生成质粒pGOA4和pGOA5，它们分别具有两个res或res1序列。
通过将sacB-neo基因从pGOA1亚克隆到XbaI消化的pGOA4和pGOA5中，生成pGOA6和pGOA7。
使用寡核苷酸对T3和T7，通过PCR从pGOA6和pGOA7扩增res-和res1-cassettes，并将它们连接到经T4 DNA聚合酶处理的KpnI消化的pSL111中，以生成pRES和pRES1。
变换LIG通货膨胀产品到感受DH5αλ PIR细胞，并通过电镀在LB琼脂中选择补充有鸭。
在37°C下孵育平板过夜。
通过限制性酶切分析和测序确认正确的pRES和pRE S1构建体。
按照制造商的规程，通过QIAprep Spin Miniprep Kit分离pRES和pRES1质粒。
变换PRES和前S1到感受SM10λ PIR细胞，并通过电镀在LB琼脂中选择补充有鸭。
在37°C下孵育平板过夜。
TRIVET库的构建
一种。在插入资源-盒

通过缀合和等位基因交换将抗性自杀质粒pRES和pRES1插入霍乱弧菌WT中，以将每个盒放入lacZ基因座中，从而获得Vc_res和Vc_res1，如下所述。
动员自杀质粒PRES或前S1到霍乱弧菌通过缀合大肠杆菌SM10λ PIR的pR ES或前S1与获得由步骤B1C霍乱弧菌WT [（链霉素抗性（SM - [R ）。这是通过交叉划线足以进行两种菌株的细胞材料在同一LB琼脂平板上，于37°C孵育6小时。通过pRES或pRES1上存在的同源区域，自杀质粒和霍乱弧菌染色体上的lacZ基因座的等位基因交换是可能的通过存在于pRES或pRES1上的同源区域以低频率进行检测。
然后通过在LB- Sm / Ap / Km琼脂平板上划线形成结合混合物中的单个菌落，选择带有整合的pRES和pRES1的霍乱弧菌。
在37°C下孵育平板过夜。
在LB-Sm / Ap / Km琼脂平板上条纹纯化菌落至少两次。
生长在LB-SM /公里纯化的菌落在37℃下过夜，以180rpm和在LB-SM板适当稀释/公里PL茨补充有5-溴-4-氯-3-吲哚基的β-d吡喃半乳糖苷（40微克/ ml溶于DMSO，X-Gal）。
在37°C下孵育平板过夜。
白色菌落是双重组事件和lacZ基因座与res或res1盒的等位基因交换的潜在候选者。
通过在LB-Sm / Km（生长）和LB-Ap（无生长）上划线确认自杀载体主链的丢失。
将平板在37°C下孵育过夜，然后以Sm R / Km R进行培养，但出现Ap S菌落。
验证通过菌落PCR和/或测序确定res或res1-盒在lacZ基因座中的正确插入，产生菌株Vc_res和Vc_res1。
b。Vc_res和Vc_res1中的转座子诱变。

转座诱变是通过将pLOF :: tpc转座子质粒动员到V中来实现的。如下所述通过缀合形成霍乱。在较长的潜伏期中，质粒的转移导致霍乱弧菌的自发转座事件。
动员自杀载体pLOF :: TPC入霍乱弧菌通过缀合大肠杆菌SM10λ PIR pLOF从步骤菌素B1a :: TPC得到任一Vc_res和Vc_res1从得到的步骤B 2a中通过过滤器的配合在LB琼脂平板上。为此，将菌株生长到OD 600约为。1，然后以2：1的比例混合受体和供体，最终体积为2 ml。
颗粒混合物通过离心（5 ，000 ×g下，5分钟，RT），并在100μl的LB肉汤轻轻重悬细胞。
将细菌悬液放置在LB板的中心，并在37°C下孵育1.5 h，以使其结合。
使用移液器吸头吸取板中的细菌，并将其重悬于1 ml LB肉汤中。
通过铺板适当稀释的重悬缀合混合物，以达到每个LB- Sm / Km / Cm平板约50-200个菌落，选择转座子突变体。
在37°C下孵育平板过夜。
通过在LB-Sm / Km / Cm琼脂平板上划线并平行在LB-Ap琼脂平板上纯化菌落。在37°C下孵育过夜后，仅对LB-Sm / Km / Cm耐药，但对Ap敏感的菌落代表真正的转座子突变体（pLOF主链丢失）。
通过在平板顶部添加1-2 ml LB，并在整个菌落上漂洗多次，合并约500个真正的菌落，以产生异质气源性。
重复步骤的B2Bi至B2bvi约20倍为Vc_res以及Vc_res1以获得用于多个独立的转座子池Vc_res分别或Vc_res1。
C。pTRIVET和pTRIVET1的集成

动员自杀质粒pTRIVET或pTRIVET1入霍乱弧菌由步骤的B2B获得插入转座子池的三脚架或pTRIVET1经由下游同源重组的lacZ -locus如下所述。
为了这样做，的横条纹足够的细胞材料大肠杆菌SM10λ PIR pTRIVET或大肠杆菌SM10λ PIR从获得pTRIVET1步骤与B1b矮秆基因霍乱弧菌由步骤的B2B获得转座子池（见步骤B2aii细节）。
在1 ml LB肉汤中重悬缀合混合物，并通过将适当重悬的缀合混合物稀释液铺在LB- Sm / Km / Ap板上选择插入pTRIVET或pTRIVET 。
在37°C下孵育平板过夜。
通过在平板顶部添加1-2 ml LB并合并多个漂洗液，合并约2,000个克隆以维持异质性。这些池代表最终的TRIVET池。
鉴定IVR基因
一种。预筛选，以消除由于TetR表达低而导致的高分辨率频率的融合菌株。

让每个TRIVET池在LB-Sm / Ap肉汤中生长到对数后期，而不用Km作为维持res或res1盒式磁带的选择标记。这允许以不足的TetR表达来沉默tnpR的融合菌株的解析。
在LB-Sm / Km / Ap平板上连续平板稀释，并在37°C下孵育过夜，以选择TRIVET池中未分离的菌株（res-或res1盒在体外条件下稳定保持）。
合并约1,000-2,000个菌落以通过在平板顶部添加1-2 ml LB并在菌落上漂洗多次来维持异质性。（可选：要确认异质性，请使用Southern印迹分析从50个随机选择的菌落中检测tpc- fusion基因座的限制性片段长度多态性。）
b。使用婴儿小鼠模型（体内）筛选霍乱弧菌的ivr基因。

在LB-Sm / Km / Ap平板上一式三份地分散每个库的等分试样，并在37°C下孵育过夜。
从每个板中收集约5,000个菌落，并在LB中稀释至约10 6 cfu / ml的浓度。
使用50微升细菌悬液在胃内接种5 d大CD-1小鼠（由异氟烷麻醉）。
在感染后22 h通过颈椎脱位安乐死小鼠，去除小肠，并使用组织匀浆器在中等功率下上下移动，在含有20％G甘油的1 ml LB培养基中匀浆30 s。
在蔗糖琼脂上平板接种系列匀浆稀释液，以选择sacB的丢失（选择现在缺少res或res1盒的体内分离菌株）。
在室温下孵育48小时。
确认分辨率（通过在LB-SM /鸭（生长）的平行条纹水库或RES1盒的损失d LB-公里（无生长）。
在37°C下孵育平板过夜，然后根据S tep B 3d鉴定具有Sm / Km抗性但Km敏感菌落的tpc盒插入位点。
C。PhoA分析是体内分离菌株的完善步骤

基于以前使用拆分技术的研究，由于某些TRIVET文库菌株中TetR的体外表达水平较低，因此体内筛选具有相当大的假阳性自发拆分率。实施phoA启动作为第二报告使得能够在相当大的表达水平的确认体外生长的每个的体内在步骤B3b上确定解决菌株。我们强烈建议您执行此优化步骤，以消除误报。
为了降低相对较高的基于分辨酶的筛选的假阳性率（约15％），必须将自发的体外分辨频率定义为临界值。重新分析以前基于分辨酶的筛选所获得的合并数据（Osorio等人，2005； Schild等人，2007； Seper等人，2014）发现，体外分离频率低于30％的菌株只有5％有机会是假阳性。由于tpc盒保持稳定整合在染色体中，可以在体外条件下测定体内分离株的PhoA活性，并将获得的活性与分离频率相关。根据针对irgA融合测试菌株获得的结果，体外解析频率为30％或更低与10 Miller单位或更高的PhoA活性相关。因此，我们在描述TRIVET的原始研究中使用了该临界值（Cakar等人，2018）。
鉴定在可控的体外培养条件下受到不同调控的启动子。在本文中，我们使用霍乱弧菌的铁调节的irgA启动子，该启动子在低铁水平下高表达，在高铁浓度下被抑制。通过添加不同量的铁螯合剂2,2'-联吡啶或FeSO 4可以在LB中模拟体外的差异铁可用性。
构建霍乱弧菌三脚架报告菌株Vc_res_多脚架IRGA :: TPC与的特定转录融合TPC r -盒的铁调节IRGA启动子（详见步骤C1）。
平行评估Vc_res_TRIVET irgA :: tpc报告基因在LB中生长8小时后的解析频率和PhoA活性，并补充不同量的铁螯合剂，例如2,2'-联吡啶或FeSO 4 （有关详细信息，请参见步骤C2和C3））。对于两种试剂，我们建议以50 µM的增量测试0至150 µM的最终浓度范围。
所述Vc_res_的相关成分的PhoA活性和分辨率频率多脚架IRGA :: TPC在LB菌株生长的不同的铁的可用性。选择最接近临界值的生长条件（低于30％的分辨频率），并使用相关的PhoA活性作为精制标准（在我们的情况下为10 Miller单位）。
在LB中于37°C和180 rpm下培养体内分离的菌株8 h。
如上所述执行PhoA分析（有关详细信息，请参阅步骤A5）。
仅对显示PhoA活性等于或高于精制标准（如上确定）的体内分离菌株进行处理。
d。通过亚克隆和测序鉴定tpc融合蛋白

从体内分离的目标菌株的过夜培养物中分离染色体DNA 。
用EcoRI消化染色体DNA，并使用消化的染色体DNA与EcoRI消化的去磷酸化pBR322质粒连接（有关详细信息，请参见步骤A3和A4）。
变换连接产物进大肠杆菌DH5αλ PIR和板在LB-CM平板以选择猫的TPC-盒包括下游染色体DNA的-基因TPC -融合位点。
使用QIAprep Spin Miniprep Kit分离Cm R-克隆的质粒。
用寡核苷酸seqPrimer-cat进行测序，以获得下游序列tpc-融合位点。
使用blastN识别霍乱弧菌N16961基因组数据库的BLAST序列，以鉴定tpc盒式磁带的插入位点。

分辨率测定以测量基因沉默
自杀质粒的TPC盒到特异启动子的转录融合，通过举例说明的构建IRGA-TPC或YRB - TPC融合。
一种。自杀质粒的构建。

在CAS E中的IRGA-TPC融合，PCR扩增TPC使用r -盒的寡核苷酸对tetRphoAcat -5'- SacI和tetRphoAcat -3'- SalI位以及子Ptrc-TPC作为模板（见步骤A1的详细信息）。
PCR使用寡核苷酸对irgA-SphI-1和irgA-SacI-2以及irgA-SalI-3和irgA-XbaI-4扩增位于irgA插入位点上游和下游（irgA启动子）的800 bp片段（请参见有关详细信息，请执行步骤A1。
在该情况下YRB-TPC融合，PCR扩增TPC r -盒用寡核苷酸对tetRphoAcat-5 ' -SacI和tetRphoAcat-3 ' -SalI以及子Ptrc-TPC作为模板（详见步骤A1）。
PCR扩增位于上游和下游的800bp的片段YRB -insertion位点（YRB所述的启动子）的TPC使用的寡核苷酸对，yrb_SacI_1和yrb_SphI_2 r -盒以及yrb_SalI_3和yrb_XbaI_4。
凝胶纯化PCR片段，然后进行限制性酶切和第二次纯化（有关详细信息，请参见步骤A1和A3）。
在的情况下，IRGA-TPC融合，结扎消化的TPC-盒以及所述上游和下游片段（参见步骤C1ai和ii）进入一个SphI位/ XbaI位消化，脱磷酸的pCVD442。
在该情况下YRB-TPC融合，结扎消化的TPC-盒以及所述上游和下游片段（参见步骤C1aii和iv）成一个SphI位/ XbaI位消化，脱磷酸的pCVD442。
变换连接产物到感受DH5αλ PIR细胞，并通过电镀在LB琼脂中选择补充有鸭。
在37°C下孵育平板过夜
确认正确pCVD442 IRGA :: TPC或pCVD442yrb :: TPC CON小号tructs通过使用寡核苷酸对菌落PCR IRGA-SphI位-1和IRGA-的XbaI-4或yrb_SphI_2和yrb_XbaI_4 ，分别。
在37°C和180 rpm下，在LB-Ap中用正确的pCVD442 irgA :: tpc或pCVD442yrb :: tpc生长经过验证的菌落过夜。
通过QIAprep Spin Miniprep试剂盒按照制造商的规程分离pCVD442 irgA :: tpc或pCVD442yrb :: tpc质粒。
变换pCVD442 IRGA :: TPC或pCVD442yrb :: TPC到感受SM10λ PIR细胞，并通过在LB琼脂电镀补充有鸭选择。
在37°C下孵育平板过夜。
b。三脚架携带的菌株具体的施工TPC -融合到感兴趣的基因。

为了获得Vc的IRGA :: TPC和Vc YRB :: TPC ，发动自杀质粒pCVD442irgA :: TPC或pCVD442yrb :: TPC入霍乱弧菌通过接合和等位基因交换以将TPC r -盒的各启动子的下游。
动员自杀质粒pCVD442 IRGA :: TPC或pCVD442yrb :: TPC入霍乱弧菌通过缀合大肠杆菌SM10λ PIR pCVD442irgA :: TPC或pCVD442yrb :: TPC由S取得TE p庆大霉素C1a与霍乱弧菌WT [（链霉素抗性（Sm R ）]。为此，在相同的LB琼脂平板上交叉划线两个菌株的足够细胞材料，并在37°C下孵育平板6 h。通过pCVD442irgA :: tpc或pCVD442yrb :: tpc上存在的同源区域自杀质粒与霍乱弧菌染色体上各个基因座的等位基因交换可能是低频的。
单个菌落的条纹形成在LB-Sm / Ap琼脂平板上的缀合混合物，选择带有整合的pCVD442 irgA :: tpc或pCVD442yrb :: tpc的霍乱弧菌。
在37°C下孵育平板过夜。
在LB-Sm / Ap琼脂平板上条纹纯化菌落至少两次。
将纯化的菌落在LB-Sm中于37°C，180 rpm培养过夜，然后将适当的稀释液铺在蔗糖琼脂上。
在室温下孵育板长达48小时。
通过在LB-Sm（生长）和LB-Ap（无生长）上划线确认自杀载体主链的丢失
将平板在37°C下孵育过夜，然后用Sm R克隆，但用Ap S克隆。
所述的验证正确的插入TPC r -盒通过菌落PCR和/或导致在VC测序IRGA :: TPC和Vc YRB :: TPC 。
将res-或res1-盒式磁带插入Vc irgA :: tpc或Vc yrb :: tpc中，以获得Vc_res irgA :: tpc ，Vc_res1 irgA :: tpc ，Vc_res yrb :: tpc或Vc_res1 yrb :: tpc如上所述（请参见步骤） B2a了解详情）。
整合pTRIVET或pTRIVET1成Vc_res IRGA :: TPC ，Vc_res1 IRGA :: TPC ，Vc_res YRB :: TPC或Vc_res1 YRB :: TPC以获得Vc_res_TRIVET IRGA :: TPC ，Vc_res1_TRIVET IRGA :: TPC ，Vc_res_TRIVET YRB :: TPC或Vc_res1_TRIVET YRB :: TPC以及Vc_res_TRIVET1 IRGA :: TPC ，Vc_res1_TRIVET1 IRGA :: TPC ，Vc_res_TRIVET1 YRB :: TPC或Vc_res1_TRIVET1 YRB :: TPC如上所述（详见步骤B2C）。
基因沉默的定量
一种。体内和体外分辨率测定

用tpc盒与目标启动子的转录融合体生长TRIVET菌株[例如，在Cakar等人中使用的Vc_res1_TRIVET yrb :: tpc 。（2018）]在LB-Sm / Km / Ap板上; 在37°C下过夜。
从板中收获细菌细胞，并将其重悬于LB-Sm / Km / Ap中。
测量OD 600和OD调整600使用适当的稀释液，以产生接种物为1。
为了评估在体内的分辨率，感染5-d-旧CD-1小鼠（通过异氟烷麻醉）用50μl的接种物（的〜10 6 CFU）。在感兴趣的感染后时间点（例如Zingl等人所用的6和22 h）。（2020）通过使颈椎脱位使小鼠安乐死，去除小肠并在含有20％甘油的1 ml LB培养基中匀浆。在LB-Sm / Km和LB-Sm / Ap板上平板接种适当的系列匀浆稀释液，并在3 7°C下孵育过夜。
要评估体外分辨率，请在50 ml接种物中接种5 ml LB-Sm / Ap，并在37°C和180 rpm下与小鼠感染平行孵育。在LB-Sm / Km和LB-Sm / Ap平板上平板接种适当的系列匀浆稀释液，并在37°C下孵育过夜。
评估平板上单个菌落的数量，并计算原始样品中抗Sm / Km和抗Sm / Ap的cfu。
计算数据分析一章中描述的体内和体外公式的分辨率（％）。
b。体外的PhoA测定作为替代quantific一个转录活性的灰。

使用感兴趣的培养条件培养菌株。
如上所述执行PhoA分析（有关详细信息，请参阅步骤A5）。

数据分析

分辨率测定的结果将表示为分辨率百分比，它是使用给定培养样品中Sm / Km抗性和Sm / Ap抗性群体的测定cfu计算得出的。抗Sm / Ap的菌落反映了整个种群，抗Sm / Km的菌落反映了未分离的种群。从整个种群中减去未分离的种群得到了分离的种群（res- / res1-cassette的损失）。

分辨率的计算公式为：

分辨率（％）= [ cfu（耐Sm / Ap ）– cfu（耐Sm / Km ）] / cfu（耐Sm / Ap ）

要计算碱性磷酸酶活性，请使用以下公式：

活性（米勒单位）=（1,000 x OD 420 ）/ [反应时间（分钟）x OD 600 ]

菜谱

LB肉汤/琼脂（g / L）
Bacto TM胰蛋白10 10克

酵母提取物5克

氯化钠10克

琼脂15克

蔗糖琼脂（g / L）
Bacto TM胰蛋白10 10克

酵母提取物5克

琼脂15克

蔗糖100克

如果需要，在高压灭菌后添加以下浓度的抗生素：抗生素和其他补充剂的最终浓度如下：链霉素（Sm，100 µg / ml），氨苄青霉素（Ap，50 µg / ml与其他抗生素联合使用，否则100 µg / ml），卡那霉素（Km，50 µg / ml）和氯霉素（Cm，霍乱弧菌为2 µg / ml ；大肠杆菌为10 µg / ml ）。

致谢

感谢波士顿大学塔夫茨大学的安德鲁·卡米利（Andrew Camilli）提供了原始的RIVET组件，并为建立TRIVET系统提供了有益的讨论。这项工作得到了奥地利科学基金（FWF）的拨款W901（DK分子酶学）（授予FGZ和SS），27654和P25691（授予SS）的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

根据格拉茨大学伦理委员会的规则以及相应的动物规程，所有实验均使用动物，该规程已获得奥地利联邦科学与研究部的批准。II / 10b。随意给小鼠饲养食物和水，并在专职人员的照顾下进行监测。

参考文献

Amann，E.，Ochs，B。和Abel，KJ（1988）。严格调控的tac启动子载体可用于表达大肠杆菌中未融合和融合的蛋白。基因69：301-315。
Bookout，AL和Mangelsdorf，DJ（2003）。定量实时PCR协议，用于分析核受体信号通路。核受体信号1：e012。
Cakar，F.，Zingl，FG，Moisi，M.，Reidl，J.和Schild，S.（2018）。体内的压抑基因霍乱弧菌揭示的H的逆要求+ /氯-沿着胃肠道转运蛋白。美国国家科学院院刊115（10）：E2376-E2385。
Cakar，F.，Zingl，FG和Schild，S.（2019）。沉默是黄金：肠道定殖过程中霍乱弧菌的基因沉默为耐酸反应提供了新的方面。肠道微生物10（2）：228-234。
Donnenberg，MS和Kaper，JB（1991）。使用正选择自杀载体构建肠致病性大肠杆菌的eae缺失突变体。感染免疫59：4310-4317。
Eisen，MB和Brown，PO（1999）。用于基因表达分析的DNA阵列。方法酶303：179-205。
Hava，DL，Hemsley，CJ和Camilli，A.（2003）。RlrA在肺炎链球菌rlrA致病性胰岛中的转录调控。细菌学杂志185（2）：413-421。
M.的Herrero，V。的de Lorenzo和KN的Timmis（1990）。含有非抗生素抗性选择标记的转座子载体，用于在革兰氏阴性细菌中克隆和稳定地插入外源基因。细菌学杂志172（11）：6557-6567。
List，C.，Grutsch，A.，Radler，C.，Cakar，F.，Zingl，FG，Schild-Prufert，K.和Schild，S.（2018）。暴露于秀丽隐杆线虫后由霍乱弧菌激活的基因表明，甘露糖敏感的血凝素对定殖至关重要。mSphere 3（3）。
Miller，VL，DiRita，VJ和Mekalanos，JJ（1989）。鉴定toxS，这是一种调控基因，其产物可增强toxR介导的霍乱毒素启动子的激活。细菌杂志171（3）：1288-1293。
Miller，VL和Mekalanos，JJ（1988）。一种新型的自杀载体及其在插入突变构建中的应用：霍乱弧菌中外膜蛋白和毒力决定因素的渗透调节需要toxR。细菌学杂志170（6）：2575-2583。
Osorio，CG，Crawford，JA，Michalski，J.，Martinez-Wilson，H.，Kaper，JB和Camilli，A。（2005）。基于第二代重组的体内表达技术，用于大规模筛选在小鼠小肠感染过程中诱导的霍乱弧菌基因。感染免疫73（2）：972-980。
里德（Reed）和格林德利（ND）（1981）。体外转座子介导的位点特异性重组：重组位点的DNA切割和蛋白质-DNA连锁。单元格25（3）：721-728。
Schild，S.，Tamayo，R.，Nelson，EJ，Qadri，F.，Calderwood，SB和Camilli，A.（2007）。感染后期诱导的基因释放到环境中后，可增强霍乱弧菌的适应性。细胞宿主微生物2（4）：264-277。
Seper，A.，Pressler，K.，Kariisa，A.，Haid，AG，Roier，S.，Leitner，DR，Reidl，J.，Tamayo，R.和Schild，S.（2014）。在动态生物膜系统中鉴定霍乱弧菌诱导的基因。Int J Med微生物304（5-6）：749-763。
Wang，Z.，Gerstein，M.和Snyder，M.（2009）。RNA-Seq：转录组学的革命性工具。Nat Rev Genet 10（1）：57-63。
Zingl，FG，Kohl，P.，Cakar，F.，Leitner，DR，Mitterer，F.，Bonnington，KE，Rechberger，GN，Kuehn，MJ，Guan，Z.，Reidl，J.和Schild，S.（ 2020）。外膜囊泡促进霍乱弧菌的表面交换和体内适应。细胞宿主微生物27（2）：225-237 e228。