材料和试剂
无菌注射器过滤器，孔径0.22 μ米（默克，目录号：小号LGV033RK）
丁腈手套
13 ml 培养管（TPP，目录号：91016）
1.5 ml微量离心管（Eppendorf，安全锁定管，货号：0030120086）
注意：原则上，市场上所有预包装的试管均不含RNase，可以使用。
50 ml离心管（Sarstedt ，目录号：62.547.254）
移液器吸头（VWR，目录号：89041-404、89041-412、89041-400）
注意：原则上，市场上所有预包装的吸头均不含RNase，可以使用。
半微量比色杯（Sarstedt，目录号：67.742）
弗氏志贺氏菌5a M90T （Sansonetti et al。，1982），也可以从ATCC购买，也可以应作者要求提供。
胰蛋白tone大豆肉汤（TSB）即用型粉末（Merck，目录号：105459）
胰蛋白tone大豆琼脂（TSA）即用型粉末（Merck，目录号：105458）
刚果红（西格玛，目录号：C6277）
焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma，目录号：40718）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma，目录号：L3771）
溴酚蓝钠盐（西格玛，目录号：B8026）
二甲苯氰FF（Sigma，目录号：X4126）
甘油（Sigma，目录号：G5516）
甲酰胺（Sigma，目录号：47671）
绝对乙醇（VWR C hemicals，目录号：20821.558）
乙酸钠3 M，pH 5.5（Ambion ，目录号：AM9740）。
EDTA，二钠盐，二水合物（Sigma，目录号：324503）
氢氧化钠（Sigma，目录号：S8045）
Trizma基座（Sigma，目录号：T1503）
醋酸（西格玛（Sigma），目录号：695092）
琼脂糖（VWR Life Science，目录号：35-1020）
DNase I 10 U / ml（罗氏（Roche），货号：04716728001）
RNaseOUT 40 U / ml（Invitrogen，货号：10777019）
氯仿（Sigma，目录号：C2432）
苯酚溶液pH 4.3±0.2（Sigma，目录号：P4682-400ML）
异戊醇（Sigma，目录号：W205702）
乙酸钠pH 5.5（Ambion ，目录号：AM9740）
糖原20毫克/毫升（Invitrogen公司，Ç atalog号：R0551）
寡聚物SF-HFQ-F 5 ' - ACGATGAAATGGTTTATCGAG-3 ' 和SF-HFQ-R 5 ' -ACTGCTTTACCTTCACCTACA-3 ' （Sigma 公司，按订单生产）
GeneRuler 1 kb DNA阶梯（Thermo Scientific，目录号：SM0211）
接头-RNA-适配器5 ' -GACCUUGGCUGUCACUCA-3 ' （Sigma 公司，按订单生产）
用于细菌的Ribo- Zero rRNA去除试剂盒（Illumina，目录号：MRZB12424 ）
注意：该产品不再在市场上出售，但可以用Pan-Prokaryote riboPOOL 试剂盒（siTOOLS BIOTECH，Pan-Prokaryote v2），RiboCop rRNA细菌耗竭试剂盒（Lexogen ，目录号：125-127）或任何其他产品代替其他基于杂交探针的rRNA消耗方法。依赖于基于酶的rRNA耗竭的替代产品（例如Ribo- Zero Plus rRNA耗竭套件（Illumina，目录号：20037125））不适用。
终结者-5 ' 磷酸依赖性外切核酸酶（TEX）（Lucigene ，目录号：TER51020）
5'-焦磷酸水解酶5,000单位/毫升（RppH ）（New England BioLabs ，目录号：M0356S）
T4 RNA连接酶10,000 U / ml（New England BioLabs ，目录号：M0204L）
T4多核苷酸激酶（PNK）10,000 U / ml （New England BioLabs ，目录号：M0201L）
RNaseZap （Ambion ，目录号：AM9780）
Dream Taq DNA聚合酶（Thermo Scientific，目录号：EP0701）
dNTP混合，每个2 mM（Thermo Scie ntific，目录号：R0241）
GelRed 核酸凝胶染料（Biotium ，目录号：41003）
ATP溶液（100 mM）（Thermo Scientific，目录号：R0441）
胰蛋白so大豆肉汤（TSB）培养基（请参阅食谱）
胰蛋白so大豆琼脂（TSA）板（请参阅食谱）
刚果红溶液（请参阅食谱）
无核酸酶水（小号EE 食谱）
十二烷基硫酸钠（SDS）10％溶液（请参阅食谱）
EDTA 0.5 M，pH 8（请参见配方）
6 x DNA上样缓冲液（请参阅食谱）
2 x RNA上样缓冲液（s 配方）
停止解决方案（s 配方）
乙醇80％（请参阅食谱）
裂解液（请参见食谱）
10 x TAE（请参阅食谱）
1％琼脂糖（s 配方）
Phe -CHISAM解决方案（请参阅食谱）
CHISAM（请参阅食谱）

设备
冷冻微型离心机（VWR，型号：Micro Star 17R）
分光光度计（Amersham ，型号：Ultrospec 2100 pro）
移液器（Eppendorf Research plus）
微波炉（惠而浦，型号：MD101）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
NanoDrop ND-1000分光光度计（Saveen ＆Werner AB）
轨道摇床（埃德蒙· 比勒，型号：SWIP SM25）
整体加热器（VWR，型号：460-0353）
DynaMag-2磁铁（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
T100热循环仪（Bio-Rad，目录号：186-1096）
化学罩
卧式凝胶电泳系统（VWR，型号：700-0015）
电泳电源（VWR，型号：E0202）

小号oftware

程式
该协议中使用的所有程序均可免费获得。
bcl2fastq（https://emea.support.illumina.com/downloads/bcl2fastq-conversion-software-v2-20.html）
FastQC /0.11.8（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/download.html#fastqc）（Wingett和安德鲁斯，2018）
MultiQC / 1.8（https://multiqc.info/）（Ewels 等，2016）
trimmomatic / 0.36（http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic）（Bolger 等人，2014年）
samtools / 1.9（http://www.htslib.org/doc/samtools.html）（Li 等，2009）
bowtie2 / 2.3.5.1（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）（Langmead和Salzberg，2012年）
IGV / 2.3.82（https://software.broadinstitute.org/software/igv/）（Thorvaldsdottir 等人，2013年）
ReadXplorer /2.2.3（https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/ReadXplorer）（Hilker 等人，2014; Hilker 。等人，2016）

资料库
GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/182?genome_assembly_id=493862）
以RefSeq （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP037923.1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP037924.1）
RegulonDB （http://regulondb.ccg.unam.mx/）
DRNA -SEQ原始数据可在所述下登录号SRA数据库：SRR8921222（DRNA-Seq_TEX_Positive ），SRR8921223（DRNA-Seq_TEX_Negative ）（https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/）

程序
在开始RNA 纯化之前，请确保已使用RNaseZap 清洁了移液器，离心机，工作台，化学罩，凝胶设备和标记笔，以确保所有内容均不含RNase。在操作规程的每一步，您都应戴上丁腈/乳胶手套，以免污染RNase。
使用热酚法纯化总RNA，并通过电泳控制RNA质量
通过接种5毫升TSB培养基的制备预培养用的单个菌落福氏5A M90T 从刚果红的胰蛋白胨大豆琼脂平板上并在37℃下搅拌（150rpm）下生长过夜（〜16小时）。
注意：确保使用的菌落具有分泌能力（由于刚果红吸收而在平板上形成红色菌落）（Sharma and Puhar，2019）。
通过稀释100传代培养μ 升（：100稀释1）在10毫升TSB的预培养物。
摇动生长至OD 600 = 0.3。如果介质已预热，则大约需要2小时。
将培养物与2 ml冷终止溶液混合。
将混合的培养液与终止溶液在冰上孵育30分钟。
注意：为稳定RNA并防止降解，将其在冰上孵育至少30分钟，但不要超过2小时。
将培养物转移到15 ml管中。
在4°C下以16,200 x g 离心5分钟。
倾析除去上清液。保留约2 ml上清液以重悬沉淀。
将重悬的细胞转移到两个1.5 ml试管中。
在4°C下以16,200 x g 离心5分钟。
倾析弃去上清液。
注意：此时，样品可用液氮冷冻并保存在-80°C。样品稳定数月。
如下使用热酚法纯化总RNA。
重悬细胞沉淀在500 μ 升室温下的裂解溶液。
下的化学通风橱中添加500 μ 升苯酚pH为4预热至65℃的。颠倒混合至少20次。
注意：在开始RNA纯化之前，先加热加热苯酚。
剧烈涡旋20 s。
在加热块中于65°C孵育5分钟。
在室温下以13,800 x g 离心3分钟。
注意：如果离心步骤是在4°C下完成的，则SDS将会沉淀并且溶液变成白色，这不会影响该过程的效率，但是很难区分这两个阶段。经过这一离心时间后，您应该看到两个阶段，上一个阶段应该发白（当SDS冷却时，它变得不溶）。RNA在水相（上层相）中，而在白色盘状中间相中则存在蛋白质层和DNA，而脂质和其他一些细胞成分则溶解在有机相的下层透明相中。
传送上层相（〜500 μ 升化学罩下）到一个新的无RNase的管。
加入1毫升冷（4°C）无水乙醇。
涡旋5秒钟彻底混合，直到看到均匀的混合物。
在4°C下以16,200 x g 离心5分钟。
倾析掉含有乙醇溶液的上清液。
注意：在此步骤中，您可以在底部看到白色/透明颗粒。
在室温下加入1 ml 80％的乙醇。剧烈摇动试管10秒钟。
注意：不要使用的漩涡，它可以分离从底部的沉淀物。
在4°C下以16,200 x g 离心2分钟。
倾析弃去上清液。
离心（短旋转）试管，并通过移液将剩余的液体丢弃。
在室温下干燥样品，方法是将试管放在工作台上盖好盖子。
注意：一旦样品完全干燥，它将变成透明的。可能需要10分钟才能获得完全干燥的样品。
重悬100中的RNA样品μ 升的无核酸酶的水。
如下在TAE 1x 中的1％琼脂糖凝胶中检查纯化的RNA的质量。
在1.5 ml试管中准备要分析的样品。加入1 μ 升样品的加5 μ 升RNA装载的缓冲液2 X 和4 μ 升的无核酸酶的水。
将样品在65°C下加热5分钟，以使二级和三级结构变性。
在冰上冷却管5分钟。
旋转2秒钟并加载凝胶。
在TAE 1 x 缓冲液中以100 V 运行凝胶40分钟。
用3 x 浓缩的凝胶红将凝胶染色10分钟。
用20 ml无核酸酶的水在室温下振摇洗涤凝胶10分钟。
在紫外光下可视化凝胶（图3A）。如果总RNA纯化成功，则可见23S和16S为清晰的重条带，而在凝胶下部则观察到较弱的tRNA条带。无法看到mRNA。如果发生RNA降解，条带表现为涂片。
在NanoDrop 分光光度计中对R NA进行定量（图3B）。
注意：至少有20 μ 克（10 μ 克的每两个条件）的总RNA是必要继续与协议。典型浓度应在500-900 ng / ml左右。非常成功的纯化产生高达1,500 ng / ml的RNA。

图3.总RNA质量控制。A.在志贺氏志贺氏菌5a M90T的TAE的1％琼脂糖凝胶中，从三个重复样本中分离出总RNA，作为总RNA质量控制。B.从NanoDrop中总RNA定量获得的典型值的示例。260/280的比例应在1.88-2.00左右。

在-20°C下冷冻RNA样品。RNA样品可稳定保存数月。

DNase处理可从总RNA中去除污染的基因组DNA
协议量是针对一个反应的，但是每个步骤都可以扩展到两个或更多反应。

稀10 μ 克总RNA至30的最终体积的μ 升用无核酸酶的水。
在加热块中于65°C下在无核酸酶的水中使RNA变性5分钟。
在冰上冷却5分钟。
制备含有所指示的数量是足够的在表1中列出的组分的反应混合物为含有10一个采样μ 克RNA组成。

表1的DNA Ë反应混合为一个反应
注：1 1个单位DNA酶I的μ 克总RNA。

将反应混合物加到冰上的RNA样品管中。
将反应混合物在加热块中于37°C孵育60分钟。
注意：请确保加热块处于正确的温度，DNase在37°C时可有效工作。
添加到反应管60 μ 升的无核酸酶的水，以获得100 μ 升终体积。
用氯仿纯化RNA ：异戊醇提取和乙醇沉淀
100添加μ 升CHISAM的到反应管中的化学通风橱下。
与涡旋剧烈混合15秒钟。
在13,800 xg （4°C）下离心2分钟。
下的化学通风橱转移〜100 μ 升从水相（上部），包含RNA至新的1.5毫升管。丢弃有机相（下部），缓冲液中溶解的蛋白质和盐会溶解在该相中。
重复步骤小号C1-C4。
添加300 μ 升冷的无水乙醇（3个样品体积），10 μ 升的小号裂果乙3 中号pH为5.5（样品体积的1/10）和1 μ 升糖原（20毫克/毫升）。
将混合物剧烈涡旋5秒钟。
将试管在-20°C下孵育30分钟。
注意：此步骤是可选的，但最好这样做以减少后续步骤中RNA的损失。
在4°C下以16,200 x g （或最大速度）离心30分钟。
注意：离心步骤可能需要更长的时间。最小时间为30分钟，但可能需要2到4小时。
轻轻倒掉上清液。
注意：在试管底部应有白色沉淀。弃去上清液而不分离沉淀。
在室温下添加1 ml的80％乙醇洗涤RNA。
颠倒20次将其混合。
在13,800 x g （4°C）下离心5分钟。
倾析弃去上清液。
离心机（短纺），丢弃剩余的液体，具有100 μ 升移液管。
保持试管在冰上干燥以干燥样品。
注：干燥样品所需的时间取决于如何以及除去液相（û sually它需要10-15分钟）。一旦完全干燥，颗粒就完全透明。
重悬23总RNA μ 升的无核酸酶的水。
在总RNA提取后，通过目视检查1％琼脂糖凝胶上的23S和16S条带，检查不含DNase的RNA的完整性。
按照步骤A30-A37制备运行样品。
在紫外光下可视化凝胶（图4A ）。
量化在所述RNA 纳米滴分光光度计（最终RNA浓度应〜600-1 ，000纳克/毫升）（图4B）。由于DNA的存在会增加样品的吸光度，因此在处理后检测较低的浓度是正常的。

图4. DNase处理后的总RNA质量控制。A. 在志贺氏志贺氏菌5a M90T的TAE 的1％琼脂糖凝胶中，从三个重复样本中分离出总RNA，作为总RNA质量控制。B.在NanoDrop中DNase处理后从总RNA定量中获得的典型值的例子。

在-20°C下冷冻RNA样品。RNA样品可稳定保存数月。

PCR验证基因组DNA的去除
为了确保RNA样品中没有DNA痕迹，通过PCR检查基因组DNA的缺失非常重要。
使用1 μ 升（〜1 μ 克的）的DNA酶处理RNA样品作为模板来核实没有基因组DNA。
作为阳性对照使用〜10纳克来自基因组DNA的弗氏志贺菌5A M90T。可以使用（He，2011）中所述的酚-氯仿方案提取基因组DNA 。
作为阴性对照，使用没有任何模板的反应。
准备PCR混合物（表2）。所示数量足以容纳一个样品。

表2. 用于PCR对照的反应混合物

注：寡核苷酸使用这里扩增〜909 bp的所述的长的产品HFQ 基因（303 个nt 从福氏5A M90T包括300bp的上游和300bp的所述的下游）HFQ 基因。

PCR反应设置（表3）。

表 3.设置为控制PCR
按以下步骤在1％琼脂糖凝胶中检查产品。
准备要分析的样品。添加6 μ 升样品的加2 μ 升DNA加载缓冲器6 X 。
在100 V下在TAE 1x 缓冲液中运行1％琼脂糖凝胶40分钟。
用Gel Red 3 x 将凝胶染色10分钟。
用无核酸酶的水洗涤凝胶。
在紫外光下可视化凝胶（图5）。

图5. 使用基因组DNA 作为阳性对照，用hfq基因加300pb弗氏志贺氏菌5a M90T的上游和下游作为靶标的hpq 基因加上基因组DNA的对照PCR 。TAE中1％的琼脂糖凝胶1 x 。在泳道2-4中不存在被视为909 bp带的PCR产物，这表明纯化的RNA没有DNA污染。
rRNA耗竭
核糖体RNA是最丰富的RNA种类。如果不去除rRNA，则测序的大多数读数将来自rRNA。结果，所比较的样品都需要具有或不具有rRNA，否则测序深度将非常不同，并且无法进行统计分析。下一部分中描述的用于富集一级RNA的TEX处理会去除所有未被三磷酸化的RNA（包括rRNA），从而使该库中的rRNA耗尽。因此，为了能够将TEX处理的样品与模拟处理的样品进行比较，需要先从总RNA中特异性去除rRNA，然后再将RNA分成两部分进行进一步处理。
使用商购试剂盒进行rRNA消耗，该试剂盒可根据制造商的说明专门消耗细菌rRNA。细菌rRNA的特异性消耗通常依赖于与识别rRNA中保守序列的带标签泛细菌探针杂交，然后去除捕获的rRNA，例如通过用与探针标签结合的磁珠沉淀。
我们已经使用了Illumina 的Ribo -Zero rRNA细菌去除试剂盒，但不幸的是，它在市场上不再可用。但是，可以用您选择的任何基于杂交的试剂盒替换它。我们在“材料”部分提供了一些建议。
终止子核酸外切酶（TEX）处理以丰富初级转录本
准备两个（TEX-和TEX +）1.5ml反应管s的10 μ 克（10 μ 升在无核酸酶的水），每个DNA酶I处理过的RNA（来自相同样品）。
在90°C下将RNA变性2分钟。
在冰上冷却5分钟。
添加到的Reacti每个管上组合描述于表4中指示的数量是足够的含10一个采样μ 克RNA的：

表4. TEX处理的反应混合物

注意：VOLU最终的反应我将是20 μ 升添加酶用于TEX +样品或水的TEX-样品之后。
添加1 μ 升的无核酸酶的水至TEX-样品。
加入1 μ 升TEX（1单位/毫升）至TEX +样品。
在热循环仪中于30°C孵育60分钟。
注意：此步骤可以在加热块中进行，但是温度变化和液体蒸发是妨碍良好结果的重要因素，并且这些影响在加热块中更强。
添加80 μ 升的无核酸酶的水，以获得100 μ 升终体积。
100添加μ 升的苯丙氨酸- CHISAM到反应管中的化学通风橱下。
与涡旋剧烈混合15秒钟。
在13,800 x g （4°C）下离心2分钟。
转印〜100 μ 升包含化学通风橱下的RNA至新管上部相。
重复步骤小号F9到F12。
添加300 μ 升冷的无水乙醇（3个样品体积），10 μ 升的小号裂果3M乙pH为5.5（样品体积的1/10 ）和2 μ 升糖原（20毫克/毫升）。
剧烈涡旋样品。
将试管在-20°C下孵育过夜（约16小时），但可以更长一些，例如在周末。
注意：此步骤非常重要。它有助于完成RNA的回收。
在4°C下以16,200 x g 离心1 h。
注意：离心步骤可能需要更长的时间。最少1小时，但可能会持续2-4小时。
倾析小心弃去水相。
注意：在试管底部应有白色沉淀。丢弃水相而不分离颗粒。在的情况下看不到任何沉淀弃去上清液之前，只是一个DD 10 μ 升号第裂果乙3 中号pH为5.5（样品体积的1/10）和2 μ 升糖原（20毫克/毫升）和重复步骤s F 16至F18）。
在室温下加入1 ml 80％的冷乙醇洗涤RNA。
在13,800 x g ，4°C下离心5分钟。
通过倾析丢弃水相。
离心机（短纺），丢弃剩余的液体，具有100 μ 升移液管。
保持试管在冰上干燥以干燥样品。
注意：干燥样品所需的时间取决于去除液相的程度。大约需要10-15分钟。一旦完全干燥，颗粒将完全透明。
重悬13 RNA μ 升ö ˚F无核酸酶的水。
通过在1％琼脂糖凝胶上目视检查，检查TEX-和TEX +处理过的RNA的完整性。
按照步骤A 29- A 36 制备运行样品。
在紫外光下可视化凝胶（图6 ）。

图6. 用TEX处理过的志贺氏菌5a M90T RNA（TEX + ）和未处理过的（TEX- ）（TEX- ）
注意：正常情况下，在此凝胶中看不到mRNA的清晰条带，该条带是可变长度的不同转录本的混合物。要看到凝胶手段的治疗是successf涂抹ü 湖如果您没有大量的RNA，也许您只会看到tRNA。

在NanoDrop 分光光度计中定量RNA （最终RNA浓度应为〜20 ng / ml）。
在-20°C下冷冻RNA样品。RNA样品可稳定保存数月。

RNA的RNA 5' 焦磷酸水解酶（RppH ）处理以去除末端磷酸盐
在下面的步骤中，5 ' 的RNA的-ends中制备程序F 修饰有已知序列的接头-RNA-适配器，它允许TSS的识别单核苷酸精度。这是必需的，因为在文库制备过程中添加的用于测序的衔接子序列可能是商业秘密（Illumina衔接子的完整序列仅在最近才公开，并且存在使用未知序列的衔接子的其他平台）。在对测序结果进行生物信息学分析时，有时不完全从读物中除去衔接子的序列，如果转录的碱基恰好与DNA序列比对，则可能会将其余的核苷酸与转录的碱基混淆。但是，可以通过在衔接子和TSS 之间引入已知序列的RNA衔接子来避免此问题。而且，接头-RNA-适配器允许在文库制备期间唯一地鉴定在RNA剪切之前存在的5 ' 末端。为了在文库制备过程中将衔接子连接至接头RNA适配器的5'末端，接头RNA适配器的5 ' 末端必须具有三磷酸。

变性剩下的1 0 μ 升TEX +和TEX-的处理的RNA进行1分钟，在90℃。
在冰上冷却5分钟。
如表5所述制备RppH 混合物。所示数量足以用于一种样品：

表5. TEX处理的RNA的R ppH 反应的反应混合物

在热循环仪中于37°C孵育30分钟。
加入80 μ 升的无核酸酶的水，然后按照步骤F8-F23。
重悬13 RNA样品μ 升的无核酸酶的水。
通过在1％琼脂糖凝胶上目测检查RppH 处理的RNA 的完整性。
注意：此步骤并非严格必要，并且每一步都会丢失一些RNA。凝胶外观应类似于图6 所示。
在NanoDrop 分光光度计中定量RNA 。
连接至TEX +和TEX-文库之前，接头RNA适配器磷酸化
变性100 皮摩尔（1 0 μ 升每溶解在不含核酸酶的水中5分钟，在90℃下样品的接头-RNA-适配器）。
在冰上冷却5分钟。
注意：准备反应时，您可以将寡核苷酸在冰上放置更长的时间。
根据表6准备T4 PNK混合物。

表6. 接头-RNA- 接头的T4 PNK磷酸化反应混合物

在热循环仪中于37°C 孵育30分钟。
加入80 μ 升的无核酸酶的水，按照步骤F8-F23。
重悬在10 RNA样品μ 升的无核酸酶的水。
注意：此步骤后，可将RNA接头冷冻在-2 0°C并稍后使用。

接头RNA适配器与TEX +和TEX-样品的连接
接头-RNA-接头连接的效率约为80-90％。
变性磷酸化RNA适配器（10 μ 升与处理过的）和RNA的RppH （10 μ 升）在65℃下5分钟。
在冰上冷却5分钟。
如表7中所述准备T4 RNA连接酶混合物（表中描述的数量仅适用于一个样品，如果您要处理更多样品，请按比例放大）。

表7. 接头-RNA-接头连接的反应混合物

在热循环仪中于25°C孵育16小时。
添加6 0 μ 升的无核酸酶的水。
停止反应并按照步骤F9-F23沉淀反应。
重悬23 RNA样品μ 升的无核酸酶的水。
注意：重悬液量由您决定使用的测序设备定义。在我们的情况下，RNA浓度为23纳克150 μ 升。
通过NanoDrop 分光光度计定量RNA衔接子。
用于Illumina测序的文库制备
测序和RNA测序的文库制备可在您选择的服务平台或公司进行。必须准备链状文库以鉴定编码DNA链。应执行读取长度为150 nt的配对末端测序。我们在HiSeq 2000平台上使用了TrueSeq 库。对于微生物基因组，每个样品10-20 M读数将提供适当的测序深度，但5 M足以获得可接受的覆盖范围。

数据分析
该协议中使用的所有程序均基于Linux，并且可以在网上免费获得。我们在高性能计算机集群上远程执行所有分析。但是，如果无法访问高速远程分析，则可以在下载程序后在本地运行所有分析，但是如果计算能力较低，则可能会花费很长时间。
将所有程序，原始数据和参考基因组下载到工作目录中。在此协议中，我们以工作目录dRNA_seq为例。

注意：如果使用Windows系统，则应安装Ubuntu（https://ubuntu.com/download/desktop）并在此环境中运行所有程序。
d Illumina公司的emultiplexing读
注意：仅当您在自己的实验室中执行测序时，才需要执行此步骤。如果是这种情况，您将获得一个名为* .bcl.gz的文件，该文件首先需要多路分解以进行下游分析。如果您使用测序服务，则无需执行此步骤，因为您将获得已处理的* .fastq.gz文件。

bcl2fastq

转到您的工作目录，您在其中拥有* .bcl.gz文件。
执行bcl2fastq
$ bcl2fastq [选项]

原始数据质量控制
FastQC （图7）
转到您的工作目录。在此示例中，工作目录：
$ cd dRNA_seq

创建一个新目录以输出FastQC 分析。
$ mkdir FastQC_1

执行FastQC 。
$ fastqc / dRNA_seq /your_file.fq.gz -o / dRNA_seq / FastQC_1

图7. 质量控制的FastQC 报告。A.成功的质量控制。对于已测序片段的整个长度，质量得分应在绿色区域中。B.质量控制失败。部分读取的质量得分很低（在橙色或红色区域中找到）。

多质量控制
运行MultiQC 以合并所有FastQC 输出。

$ multiqc / FastQC_1

从低质量序列和Illumina适配器清除原始数据
Trimmomatic

在您的工作目录中运行Trimmomatic 。

$ java -jar trimmomatic.jar PE /your_raw_data_1.fq.gz your_raw_data_2.fq.gz your_raw_data_paired_1.fq.gz your_raw_data_unpaired_1.fq.gz your_raw_data_paured_2.fq.gz your_raw_data_unpaired_2.fqCL。 2:30:10领先：20牵引：20滑窗：4：15敏伦：100

选择包含RNA适配器序列的fastq 文件
执行此步骤的最简单方法是在终端中使用命令grep。此步骤中的接头RNA适配器应为DNA格式。

$ zgrep -B 1 -A 2 GACCTTGGCTGTCACTCA your_raw_data_paired_1.fq.gz> Picked_ Up.fastq

基因组参考指数
您的参考基因组很可能具有多个复制子。我们建议将它们全部合并到一个文件中，用作参考基因组。
$ cat 染色体.fasta质粒.fasta > reference_genome.fasta

使用bowtie2创建索引。
$ bowtie2-build reference_ 基因组.fasta index_base_name

基因组参考图谱
将选择的读数与参考基因组作图。

$ bowtie2 -q -N 0 – 非-unal -x index_base_name -U your_raw_data_paured_1.fq.gz -S mapping_1.sam

按位置排序并建立BAM文件的索引
Bowtie2的输出文件应进行排序和索引以便在IGV中使用。

$ samtools 视图-Sb- o mapping_1.bam mapping_1.sam

$ samtools sort -o mapping_Sorted_1.bam mapping_1.bam

在IG V中可视化映射文件（图8）
创建一个基因组参考索引。
$ samtools 索引reference_ 基因组.fasta reference_genome

在IGV中创建您的基因组文件。
IGV>基因组> 创建.genome 文件

加载您的reference_ 基因组.fasta 和reference_genome.gbk 文件

加载映射文件。
IGV>文件>从文件加载

图8.用于对齐可视化的IGV浏览器的屏幕截图。与参照基因组TEX +和TEX-库的对准福氏5A M90T。蓝色直方图显示TEX-样本的覆盖率，红色直方图显示TEX +样本的覆盖率。红色突出显示了假定的转录起始位点。

识别转录起始位点
将三个副本合并到一个文件中。
$ samtools 合并输出。sam mapping_Sorted_1.bam mapping_Sorted_2.bam mapping_Sorted_3.bam

将合并的文件加载到ReadXplorer中。
使用以下参数运行TSS分析（表8）：

表8. ReadXplorer中的TSS分析设置

TSS 的ReadXplorer 分析的输出文件是纯文本表格，其中包含39个不同的列，可用于下游分析。作为示例，您可以看到图9中输出文件的某些列的摘录。

图9.从ReadXplorer 输出文件中提取的示例

根据与分析ReadXplorer ，我们确定6723 的PTS 和7328 STSS 在福氏5A M90T （塞万提斯-Rivera的等人，2020），它是围绕着相同数量的TSS中鉴定大肠杆菌MG1655 （Conway的等。，2014； Thomason 等人，2015）。这些结果也可以在RegulonDB 上获得，网址为http://regulondb.ccg.unam.mx/central_panel_menu/integrated_views_and_tools_menu.jsp。

菜谱
胰蛋白so大豆汤（TSB）
30克TSB中等粉末
MilliQ 瓦特亚特至1L
高压灭菌解决方案
胰蛋白so大豆琼脂（TSA）板
40克胰蛋白so大豆琼脂粉
的MilliQ 瓦特亚特至1L
高压灭菌解决方案
在水浴中冷却至〜50°C，加入10 ml 1％浓红色溶液，倒入板中
刚果红溶液1％（w / v）
1克刚果红
100毫升M illi Q 水
过滤消毒溶液中，用一个0.2 μ 米的膜过滤器。
注：在刚果红溶液在室温个月。
无核酸酶的水
1 ml 焦碳酸二乙酯（DEPC），（终浓度0.1％）
1升MilliQ 水
使用磁力搅拌棒在晚上搅拌均匀
高压釜
使用前让其冷却至室温
十二烷基硫酸钠（SDS）10％（w / v）
10克SDS粉
无核酸酶水100毫升
高压灭菌解决方案
EDTA 0.5 M，pH 8
18.61 g d 乙二胺四乙酸二钠钠（EDTA）
2克氢氧化钠
无核酸酶水100毫升
充分混合并消毒
注意：EDTA在pH 8时溶解。
DNA上样缓冲液6 x
0.125 g b 苯酚蓝（终浓度0.025％）
0.125克x亚乙基氰基（终浓度0.025％）
30毫升甘油
不含核酸酶的水至100毫升
混合均匀，在室温下稳定多年
RNA上样缓冲液2 x
0.125 g b 苯酚蓝（终浓度0.025％）
0.125克x亚乙基氰基（终浓度0.025％）
100毫升甲酰胺
混合均匀，在室温下稳定多年
停止解决方案
95毫升乙醇
5毫升的苯酚pH 4
最终体积100毫升
拌匀，储存在4℃
乙醇80％
80毫升乙醇
20毫升无核酸酶的水
充分混合并储存在4°C
裂解液
5 ml SDS 10％（终浓度0.5％）
0.6毫升的小号裂果醋酸盐pH 5.5（20mM的最终浓度）
2 ml EDTA pH 8（最终浓度10 mM）
不含核酸酶的水至100毫升（92.4毫升）
拌匀，储存在室温下。
注意：在低温下，SDS会沉淀。如果发生这种情况，请在微波炉中以最大功率预热15秒。
10 x TAE
11 。42 毫升乙酸
48.4克的的Trizma 碱基
20 ml EDTA 0.5 M，pH 8
不含核酸酶的水至1 L
琼脂糖1％
1克琼脂糖粉
100毫升TAE 1 x
将琼脂糖在微波炉中融化
Phe -CHISAM解决方案
25毫升酚酸pH 4
24毫升氯仿
1毫升异戊醇
充分混合，室温下储存在化学通风柜中
基萨姆
96毫升氯仿
4毫升异戊醇

充分混合，室温下储存在化学通风柜中

Acknowledg 发言：

该协议的简短版本发表在Cervantes-Rivera 等人的文章中。（2020年）。我们非常感谢肯普基金会（JCK-1528），克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会（KAW 2015.0225），于默奥微生物研究中心（UCMR），于默奥大学和瑞典分子感染医学实验室（MIMS）的资助。我们感谢国家感染与抗生素博士计划（NDPIA）组织的旅行支持和课程。在SNIC 2017-7-258项目下，由SNIC通过Uppsala高级计算科学多学科中心（UPPMAX）提供的资源进行了计算。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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