材料和试剂

1. 一次性使用常模JECT 注射器（赛默飞世尔科技，1-毫升，5毫升，10毫升，20毫升）

2. 一次性针头18G（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-840-96）

3. 注射器过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：SLGVM33RS）

4. pH指示剂条pH 0-14通用指示剂（Millipore Sigma，目录号：1095350001）

5. 1.5 ml微量离心管（每袋500个）（锥形底部，Millipore Sigma，目录号：1000-0785）

6. 2.0 ml带螺帽的Fisherbrand TM 自由式微量离心管（Thermo Scientific，目录号：02-682-558）

7. 滤纸（Whatman，以适合布氏漏斗）

8. 3％-氨基-2'，3'-二脱氧鸟苷，99％（Alfa Aesar ，目录号：J65326）

9. 3'-氨基-2'，3'-二脱氧胸苷，99％（Alfa Aesar ，目录号：J64342）

10. 98％的3'-氨基-2'，3'-二脱氧腺苷（Alfa Aesar ，目录号：J65090 ）

11. 3'-氨基-2'，3'-二脱氧胞苷（Biosynth Carbosynth ，目录号：NA05183）

12. 3'-（TFA）氨基-2'，3'-二脱氧胞苷5'-CED 亚磷酰胺（ChemGenes ，目录号：ANP-1242）

13. 反向RNA 亚磷酰胺：

2'-TBDMS-3'-DMT-rA（N- bz ）（ChemGenes ，目录号：AN-3401）

2'-TBDMS-3'-DMT-rC（N-乙酰基）（ChemGenes ，目录号：AN-3405）

2'-TBDMS-3'-DMT-rG（N- iPr PAC）（ChemGenes ，目录号：AN-3406）

2'-TBDMS-3'-DMT-rU （ChemGenes ，目录号：AN-3404）

14. 3'-（6-FAM）CPG（Glen Research，目录号：20-2961-41E，用于Expedite TM 8900核酸合成系统）

15. 9-氟芴基甲基N- 琥珀酰亚胺碳酸酯，Fmoc - OSu （Combi-Blocks，目录号：ST-5099）

16. 吡啶（Py ）（Millipore S Sigma，目录号：270970-100ML）

17. 二氯甲烷（DCM）（Millipore Sigma，目录号：320269-4L）

18. 二乙醚（Et 2 O）（Millipore Sigma，目录号：296082-2.5L）

19. 高氯酸钠（NaClO 4 ）（Millipore Sigma，目录号：410241-500G）

20. 丙酮（Millipore Sigma，目录号：179124-4L）

21. 3A分子筛（Thermo Fisher Scientific，目录号：AC197255000）

22. N，N- 二甲基甲酰胺（DMF）（Millipore公司Sigma，目录号：227056-100ML）

23. 二甲基亚砜，无水（DMSO）（Millipore公司Sigma，目录号：276855-100ML）

24. 二甲基亚砜-d 6 （d 6 -DMSO）（Millipore Sigma，目录号：156914-25G）

25. 磷酸三甲酯（TMP）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AC157970500）

26. N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）（Millipore Sigma，目录号：387649-100ML）

27. 三乙胺（TEA）（Millipore Sigma，目录号：8083521000）

28. 无水乙腈（MeCN ）（Glen Research，目录号：40-4050-50）

29. 乙腈，DNA合成级（MeCN ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A21）

30. 99％（POCl 3 ）的三氯氧化磷（Thermo Fisher Scientific，目录号：AA1052530）

31. 干冰（固体二氧化碳）

32. 2-氨基-1H-咪唑，HCl（2AI · HCl）（Combi-Blocks，目录号：SS-6610）

33. 三苯膦（TPP）（Millipore Sigma，目录号：8082700250）

34. 2,2'-联吡啶二硫化物（DPDS）（Combi-Blocks，目录号：QA-4326）

35. 哌啶（Millipore Sigma，目录号：411027-100ML）

36. 氢氧化钠（NaOH）（50％的水溶液）（Millipore S Sigma，目录号：415413-100ML）

37. 将三乙胺三氢氟酸盐（净3 · 3HF）（Millipore公司Sigma，目录号：344648-25G）

38. 乙酸钠（NaOAc ）（Millipore Sigma，目录号：S2889-250G）

39. EDTA溶液（500 mM，pH 8，Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G ）

40. 二甲苯氰FF（Millipore Sigma，目录号：X4126-10G）

41. 溴酚蓝（Millipore Sigma，目录号：B0126-25G）

42. Tris-Borate-EDTA缓冲液（TBE）（Millipore Sigma，目录号：T4415-1L）

43. 尿素（Millipore Sigma，目录号：U5378）

44. 乙醇200证明（EtOH）（Decon Labs，目录号：2716）

45. 甲醇（MeOH）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A412）

46. 氯仿（CHCl 3 ）（Millipore Sigma，目录号：472476-2.5L）

47. 氯化钠（Millipore Sigma，目录号：S7653-250G）

48. 氯化镁（MgCl 2 ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9530G）

49. NH 4 OH溶液（水中28％NH 3 ，Millipore Sigma，目录号：338818-100ML）

50. MeNH 2 溶液（40％wt。水溶液，Millipore Sigma，目录号：426466-100ML）

51. SequaGel （UreaGel 浓缩液）（National Diagnostics，目录号：EC-830）制造19：1（w / w）丙烯酰胺：双-丙烯酰胺

52. SequaGel （UreaGel 稀释剂）（National Diagnostics，目录号：EC-840）制造19：1（w / w）丙烯酰胺：双-丙烯酰胺

53. N，N ，N'，N'- 四甲基乙二胺（TEMED）（Millipore Sigma，目录号：T9281-50ML）

54. 1 M Na + -HEPES pH 8（Thermo Fisher Scientific，目录号：AAJ63578AK）

55. 过硫酸铵（APS）（Millipore Sigma，目录号：A3678-100G）

56. Sep-Pak C 18 Plus短药筒，360毫克（水，目录号：WAT020515）

57. RNA模板（集成DNA技术，HPLC纯化）

58. 含有RNA引物3' -NH 2 终端（在HO合成用途，参见步骤d）

设备

分析天平（例如，Sartorius TM Secura TM 分析天平，目录号：14-557-401）
圆底烧瓶（25 ml，50 ml，100 ml，500 ml，Chemglass Life Sciences）
圆底烧瓶的隔膜塞（Chemglass Life Sciences）
真空过滤设置（布氏漏斗，锥形过滤瓶，过滤器适配器（氯丁橡胶），Chemglass Life Sciences）
水浴（例如，大锥形烧瓶，化学玻璃生命科学）
单通道移液器（1 ，000 微升，200 微升，20 微升，2 微升，赛默飞世尔科技）
移液管控制器（赛默飞世尔科技，例如，BrandTech TM ACCU-喷射TM 亲，目录号：03-840-311）
搅拌棒（例如19毫米（3/4''）x 19毫米（3/4''）x 9.5毫米（3/8''），VWR，货号：58947-822）
旋转蒸发仪（高效Heidolph Laborota 4001）
低分辨率质谱（Bruker Esquire 6000）
Combi Flash Rf-200自动快速色谱系统（Teledyne Isco ，部件号：68523006）
RediSep Rf色谱柱（Teledyne Isco ，目录号s ：69-2203-340（40 g）和69-2203-380（80 g））
RediSep Rf Gold C18色谱柱（Teledyne Isco ，目录号：69-2203-336）
台式离心机（Eppendorf，型号：5910R）
剃须刀（Fisherbrand TM ，目录号：12-640）
Speedvac中浓缩器（Thermo Scientific的萨文特SPD111V）
数字块加热器（VWR，目录号：12621-088）
NanoDrop 2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：DN-2000C）
核酸自动合成仪Expedite 8909
热循环仪（B io -R ad ，T100 TM 热循环仪）
电泳电源（Bio-Rad，目录号：164-5056）
0.75毫米厚，1.5毫米厚的垫片（Millipore Sigma，目录号s ：EP14 18-2EA，EP1420-2EA ）
30孔VS20梳子（Millipore Sigma，目录号：EP1428）
预备梳子（Apogee电泳，目录号：21076021）
垂直电泳系统玻璃板（Apogee电泳，目录号11074010）
电泳玻璃板（15 x 17 cm垂直凝胶板，Apogee电泳）
Amersham 台风RGB生物分子成像仪（GE Healthcare Life Sciences，目录号：29187193）
核磁共振（NMR，400MHz变体）

软件

ChemDraw（珀金埃尔默）
ImageQuant TM （GE Healthcare Life Sciences）

程序

活化的3'-氨基单体的制备是通过从市售起始原料进行的四次化学转化完成的。首先使用芴基甲基氧羰基（Fmoc）基团保护亲核胺，然后进行化学磷酸化步骤以生成核苷5'-单磷酸酯。在5'-单磷酸处安装2-氨基咪唑基，然后除去Fmoc保护基，提供了最终的活化单体。对于所用的四种单体（3'-氨基-2'，3'-二脱氧核苷5'-磷-2-氨基咪唑啉化物（3'-NH 2 -2AIpddN））中的每一个都重复此过程，其中核苷（N）为腺苷（ A），鸟苷（G），胞苷（C）和胸苷（T））。概述了3'-氨基-3'-二脱氧胸苷的分步操作方案（图2），并突出显示了与其他三种单体的区别。应该注意的是，所有化学反应都应在指定用于化学反应的通风橱中进行。

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图2. 3'-氨基-3'-二脱氧胸苷活化的单体（3'-NH 2 -2AIpddT）的合成

Fmoc保护的3'-氨基-2'，3'-二脱氧核苷的制备（图2，左起第二个化学结构）
用分析天平称出1.0g（4.1mmol）的3′-氨基-3′-脱氧胸苷，并转移到装有搅拌棒的100ml圆底烧瓶中。
使用配有一次性针头的2 0 ml一次性注射器添加12 ml吡啶。
将烧瓶放在搅拌盘顶部，并在25 °C下开始搅拌2分钟。
用分析天平称出1.7 g（5.0 mmol）Fmoc- OSu ，然后转移到装有核苷溶液的烧瓶中。
将反应在25 °C下搅拌1小时。
使用旋转蒸发仪除去溶剂。
注意：将水浴从室温缓慢升高，直到在旋转蒸发器冷指上观察到冷凝水为止。

使用旋转蒸发仪与20 ml MeCN 共蒸发残留吡啶。
注意：将水浴从室温缓慢升高，直到在旋转蒸发器冷指上观察到冷凝水为止。

重复两次步骤A7，得到黄色胶。
使用DCM（约10 ml）重新溶解胶。
注意：如果难以重新溶解，可在搅拌下逐滴滴定MeOH，直到完全溶解。

纯化使用自动化正相快速色谱法的产物，配备有RediSep ® RF正相硅胶柱（40g），使用（A）和DCM（B）的MeOH之间梯度洗脱。色谱柱梯度如下：前两个色谱柱体积（CV）为0％B，11个CV为0％至20％B，2个CV为20％B，流速为40 ml / min。
含有产物的馏分可以使用低分辨率质谱法进行鉴定。或者，可以使用薄层色谱法（例如，使用1：9（v / v）MeOH：DCM 溶剂系统）。
合并纯化产物的级分。
使用旋转蒸发除去溶剂。
注意：将水浴从室温缓慢升高，直到在旋转蒸发器冷指上观察到冷凝水为止。

使核苷在高真空下进一步干燥（在25 °C下> 8小时）。

其他核苷的注意事项：

3'-氨基-2'，3'-二脱氧胞苷：类似的方法可用于3'-氨基-2'，3'-二脱氧胞苷（500 mg），除少数例外。所使用的反应溶剂是DMF（22ml）。使用配备有热浴的旋转蒸发仪除去溶剂。柱梯度（A：DCM，B：MeOH）如下：前2个CV为0％B，11个CV为0％至40％B，2个CV为20％B，流速为40 ml /分钟。在高真空下（在25 °C 下> 8小时）进一步干燥产品。

3'-氨基-2'，3'-二脱氧腺苷：将核苷（1 g）与吡啶（10 ml）和水（5 ml）合并，然后合并Fmoc- OSu （1.6 g）。剧烈搅拌1小时。使用旋转蒸发除去大部分溶剂（直到约3 ml）。加入100毫升冷水沉淀产品（0 °C）1：1（v / v）MeCN：CHCl 3 溶液。使用真空过滤（设备部分中指定的设备）隔离产品。在高真空下（在25 °C 下> 16小时）进一步干燥产品。

3'-氨基-2'，3'-二脱氧鸟苷：将核苷（0.4 g）与吡啶（10 ml）和水（4 ml）合并，然后加入Fmoc- OSu （0.6 g）。剧烈搅拌1小时。加入500 ml 冷（0 °C ）1：1（v / v）MeCN：CHCl 3 溶液沉淀产品。使用真空过滤（设备部分中指定的设备）隔离产品。在高真空下（在25 °C 下> 16小时）进一步干燥产品。

Fmoc保护的3'-氨基-2'，3'-二脱氧核苷-5'-单磷酸的制备（所有4个核苷的制备方法相似）（图2，左起第三个化学结构）
使用分析天平称出230 mg（0.5 mmol）3'-NHFmoc-3'-脱氧胸苷，然后转移至配有搅拌棒的25 ml圆底烧瓶中。
使用配有一次性针头的10毫升一次性注射器添加5毫升磷酸三甲酯。
注意：这将产生0.1 M的核苷溶液，这对于该反应很重要。

用橡胶塞塞住烧瓶。
将装有溶液的烧瓶放在冰水浴中，然后放在搅拌盘的顶部。
放置搅拌板，以在冰水浴中剧烈搅拌样品5-10分钟。
使用单通道移液器（容量为200 µl）添加187 µl （2 mmol）的三氯氧化磷（POCl 3 ）。
在冰水浴中剧烈搅拌10分钟。
使用单通道移液器（容量为200 µl ）滴加44 µl （0.25 mmol）二异丙基乙胺（DIPEA ）。
注意：这里可能会观察到反应发烟。

在冰水浴中剧烈搅拌20分钟。
再重复三遍步骤B8和B9，总共添加1 mmol DIPEA。
使用一个单一通道移液器，骤冷〜1μl的反应到500微升的去离子水在微量离心管（注意，沉淀可淬火期间观察到的）的。充分混合，如果观察到沉淀，则滴加MeCN，直到沉淀溶解为止。使用负离子模式低分辨质谱分析淬火的材料（注：淬火溶液应使用装有注射器过滤器的一次性注射器进行过滤，或离心（例如，20 ，在室温下000×g下），以避免注入微粒成质谱仪）。质谱图中应缺少与原料相对应的信号（请注意，可能会观察到氯化物加合物）。或者，如果没有质谱仪，可使用薄层色谱法监测反应进程。
如果仍然存在起始原料，则向反应混合物中加入47 µl（0.5 mmol）的POCl 3 ，然后添加44 µl（0.25 mmol）的DIPEA。重复反应分析（步骤B11）。
反应完成后，在0 °C 剧烈搅拌下，将反应混合物添加到250 ml圆底闪蒸器中，其中含有50 ml碳酸氢三乙铵（1 M）溶液。这将导致发烟，甚至起泡。
注意：预计会有产品沉淀。

在剧烈搅拌下（约30分钟）使其升至室温。
如果在步骤B14之后沉淀仍然存在，请缓慢滴定MeCN 到淬灭的反应中，直到观察到固体物质溶解为止。
注意：解决方案可能会保持轻微混浊，尤其是在ddG 的情况下。

使用RediSep Rf Gold C18柱，使用自动反相反相快速色谱法纯化产物，并在（A）2 mM TEAB水溶液（pH 7.5）和（B）乙腈之间进行梯度洗脱。柱梯度在13个CV上应在0％到70％B之间，流速为40 ml / min。
通过低分辨率质谱法鉴定含有产物的馏分。或者，如果无法使用质谱仪，则可以使用薄层色谱法来鉴定含有产物的馏分。
在500 ml圆底烧瓶中合并含有纯净产物的馏分。
通过旋转蒸发除去大部分溶剂，直到剩下<10 ml，以除去大部分MeCN 。
注意：使包含TEAB的溶液处于低压状态可能会导致剧烈/快速的起泡/沸腾。在冰水浴中开始旋转蒸发，然后逐渐升高温度。在升高温度之前，先让溶液“鼓泡”稳定下来（这可能很耗时）。

将溶液收集在干净的50 ml圆底烧瓶中（记录转移前空烧瓶的质量）。
将溶液在冰箱（-20 °C ）或干冰-丙酮浴中冷冻，然后在室温下于高真空下冷冻干燥产品。或者，如果无法进行冷冻干燥，则旋转蒸发直至完成。使用无水吡啶（3 x 5 ml）将残留物共蒸发3次。使残留物在室温下在高真空下进一步干燥。
记录装有产品的烧瓶的质量。

3'-氨基-2'，3'-二脱氧核苷-5'-磷酸-（2-a 氨基咪唑化物）的制备（所有4个核苷的制备方法相似）（图2，最终产物，左起第四个化学结构）
使用分析天平称重270 mg的3'-NHFmoc-3'-dideoxythymidine-5'-monophosphate，并将其转移至配有搅拌棒的干燥50 ml圆底烧瓶中。
使用配有一次性针头的20毫升一次性注射器添加16毫升无水DMSO。
使用分析天平称重297 mg的2-氨基咪唑盐酸盐，并将其转移至反应容器中。
开始搅拌。
使用配有一次性针头的1毫升一次性注射器添加0.43毫升DIPEA。
用分析天平称重1.3克三苯膦（TPP），然后转移到反应容器中。
使用分析天平称量910毫克2-2'-联吡啶二硫化物（DPDS），然后转移至反应容器中。
将反应在25 °C下搅拌1小时。
使用31 P NMR 监测反应进程，方法是将150 µl d 6 -DMSO（添加1 µl PO（OEt ）3 作为参考标准液）中的450 µl反应样品。
笔记：

原料信号接近1 ppm，PO（OEt ）3 接近-3 ppm，TPP接近-6 ppm，三苯基氧化膦（TPPO）接近27 ppm，产物应接近-10.5 ppm。
低分辨率质谱也可用于跟踪反应进程（如S tep B11）。
如果反应不完全，则加入650 mg三苯膦和455 mg DPDS，并搅拌30分钟。重复步骤C9。
加入DIPEA（300 µl），再加入哌啶（960 µl），除去Fmoc保护基。该反应应在25 °C下通过31 P NMR 监测（约10-30分钟）。
将反应混合物加至预冷（0 °C ）的500 ml EtO 2 ：丙酮1：1（v / v）溶液中，其中包含2 ml 丙酮的高氯酸钠（NaClO 4 ）饱和溶液（在1 L布歇烧瓶）。
使沉淀物沉淀在冰浴中。
使用移液器控制器除去大部分上清液。
将剩余的约100毫升转移到两个50毫升锥形离心管中。
注意：如果从抽吸步骤C14剩余的液体超过100毫升，则重复离心步骤两次。

离心以3000rpm（约4管，700 ×g下），用于使用台式离心机（在0 3分钟℃下，如果可能的话）。
倒出并丢弃管中的上清液。
通过将试管置于高真空下（如有可能，使用冷冻干燥器真空容器），除去颗粒物料的残留溶剂。
将干燥的粗物质重悬于5 ml 1 M TEAB（pH 7.5）中。
使用RediSep Rf Gold C18色谱柱，通过自动反相快速色谱纯化产物，并在（A）2 mM TEAB水溶液（pH 7.5）和（B）乙腈之间进行梯度洗脱。柱梯度在13个CV上应在0％到15％B之间，流速为40 ml / min。
通过LR-MS，NMR或TLC测试含有UV活性物质的馏分中是否存在产物。
合并含有纯产物的馏分，并使用校准的pH探针测试pH。
使用1 N NaOH（对于约20 ml的产品通常为5-20 µl）将纯化的储备液的pH调节至9.25-10。
注意：尽管此步骤对时间敏感，但pH值不应“过高”。因此，碱的滴定应谨慎进行。

进行紫外线测量并记录在260 nm处的读数。
使用比尔朗伯定律（A = εcl ，其中A为吸光度（au 。），ε为摩尔消光系数（M -1 cm -1 ），l为光程长度（cm））计算浓度。
注意：可以从相应的三磷酸酯（例如Maravai LifeSciences-TriLinkTechnologies ，对于3'-Amino-ddT三磷酸酯为9650 M -1 cm -1）获得摩尔消光系数。

等分储备溶液在2倍微摩尔在1.5ml微量离心管中的样品。
将产品等分试样冷冻在液氮中。
注意：冷冻箱可用于此步骤。处理液氮时，应使用适当的个人防护设备。

冷冻干燥样品（最好在-20 °C下）。
将样品储存在-80 °C 直至准备使用。

具有3'-末端3'-氨基-2'，3'-二脱氧胞苷的5'-FAM标记引物的制备（图3，顶部序列标记为“ 3'-NH 2 -RNA引物”）
根据制造商的说明书（通常在无水乙腈中为66 mM）准备反向RNA 亚磷酰胺溶液。
制备3'-（TFA）氨基-2'，3'-二脱氧胞苷5'-CED 亚磷酰胺溶液（在无水乙腈中通常为66 mM）。
将干燥的分子筛添加到每种溶液中，以确保和维持无水条件。
根据制造商对3'-（6-FAM）CPG固体支持物的说明，使用自动固相合成方法制备寡核苷酸。
根据3'-（6-FAM）CPG（Glen Research）的说明切割并脱保护寡核苷酸。更具体地说，首先在室温下用1 ml NH 4 OH（28％）水溶液处理CPG 30分钟，然后添加等体积的MeNH 2 水溶液（40％）。再孵育30分钟，然后从CPG色谱柱中除去溶液。
将溶液转移到干净的2 ml螺旋盖微量离心管中并密封。
使用干式恒温箱将溶液加热至65 °C，持续10分钟。
让溶液冷却至室温。
使用speed-vac浓缩器除去溶剂，无需额外加热。
将100μlDMSO 加入沉淀。
加入125 微升网3·在通风橱中使用3HF，并仔细密封管。
用涡旋轻轻混合。
使用干燥的恒温箱将溶液加热至65 °C，持续2.5 h。加热1小时后涡旋1分钟。
让溶液冷却至室温。注意：溶液热时请勿打开盖子。
向含有低聚物的溶液中加入1 ml异丙醇和100 µl 3 M乙酸钠（pH 5.2）以引发沉淀。
将溶液在-20 °C下保存20分钟。
在4 °C下以20,000 xg 离心样品10分钟。
小心地使用除去上清液的单通道移液器（200 微升容量）。
注意：应保留上清液，直到确认产品可回收为止。

将沉淀重悬于1 ml的75％乙醇水溶液中，然后重复步骤s D16-D18。
重悬200沉淀微升8M的尿素水溶液中的溶液。将样品分成两半，在-80 °C下储存一半的原油。
用80％（v / v）乙醇：水洗涤20 x 20 cm凝胶板。
根据制造商的说明组装预备凝胶设备。1.5毫米的厚度通常足以进行纯化。
在1x TBE缓冲液中制备75 ml 19：1（w / w）丙烯酰胺：双-丙烯酰胺的20％溶液。注意：丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液有毒，应采取适当的预防措施处理。
通过添加TEMED（30引发聚合微升）和新鲜制备的20％（W / V）过硫酸铵水溶液（150 微升）到该溶液中，在步骤D23的报道。
注意：重要的是要完全准备好准备好的凝胶设备，以便可以在凝胶基质“固化”之前将凝胶溶液倒入板组件中。

小心地将凝胶溶液倒入板组件中。
将准备的凝胶梳插入板组件的顶部。
注意：避免气泡；这通常可以通过以对角线的方式插入梳子来实现。

让凝胶聚合1 小时。
移开梳子，用1x TBE彻底清洗孔。
根据制造商的规格，使用1x TBE作为运行缓冲液（5 W功率10分钟）预运行凝胶。
停电。
在引入样品之前，使用配有一次性针头的60毫升一次性注射器彻底清洁1 x TBE孔。
将100μl 样品（重悬浮于8 M尿素中）均匀地沉积在孔的底部。
将指示剂（二甲苯腈和溴酚蓝）添加到参考孔中。
注意：此孔通常放置在凝胶边缘附近。这些指示剂可用作分子量大小的指示剂（例如，对于丙烯酰胺凝胶的这种浓缩，溴酚蓝的迁移类似于八核苷酸的迁移）。

通过施加5W功率15分钟将样品加载到凝胶基质中。
将功率增加到20W。
进行电泳分离，直到蓝色染料（溴酚蓝）到达凝胶底部为止。
注意：通常可以目视跟踪含FAM的寡核苷酸（黄色物种）。这对于实时解决其他包含FAM的物质很有用。

从运行室中取出凝胶。
小心地将板相互移开。
使用方形剃须刀切割与产品对应的凝胶带。
注意：如果不清楚哪个频段对应于所需产品，请切除所有潜在的产品频段。

注意：- [R 亚所叶片应小心处理和正确存储/使用后废弃的立即。

将凝胶带转移到新的50 ml锥形管中，并压成小块凝胶。
注意：如果切除了多个凝胶条带，请将每个条带放在单独的锥形管中。

加入9 ml 100 mM乙酸钠和1 ml 500 mM EDTA（pH 8）。
让混合物轻轻摇晃过夜。
根据制造商的说明，使用反相Sep-Pak柱对含寡核苷酸的上清液进行脱盐。
注意：通常使用10 ml注射器和三通阀执行此操作。

使用1：1（v / v）MeCN：水溶液从固定相洗脱低聚物到两个2 ml螺帽小瓶中。
注意：大多数低聚物将被捕获在第一个样品瓶中。

使用speedvac 浓缩器干燥物料。
将低聚物重悬于300 µl去离子水中。
将1 µl样品稀释到49 µl水中。
记录260 nm处的UV吸光度。
使用计算出的低聚物的摩尔消光系数（例如，使用最近邻法计算的摩尔消光系数）估算浓度。（例如，可通过https://www.idtdna.com/pages/tools访问）
准备浓度为100 µM的引物储备液。
分析醇通过液相色谱igomer 质谱。
注意：低聚物纯度应超过95％。考虑repurifying 通过其它方式（例如，IEX-HPLC或RP-HPLC）的材料如果纯度低于95％。

引物延伸反应（示例如图3所示）。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 1902787--1476 Derek O'Flaherty 802271 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

图3.使用3'-NH 2 -2AIpddNs 将混合序列RNA模板化学复制到3'-NP-DNA中。顶部：引物序列显示为绿色，RNA模板显示为蓝色，引物的逐步延伸显示为红色。底部：引物延伸时PAGE分析过程中，进行使用10mM激活NP -DNA 单体（3'-NH 2 -2AIpddA，3'-NH 2 -2AIpddG，3'-NH 2 -2AIpddC，3'-NH 2 -2AIpddT），50毫摩尔MgCl 2 ，200 mM的钠+ -HEPES pH 8.0中，25℃。P，底漆。C，对照，其是没有活化的NP- DNA 单体的反应混合物。

1. 按照表1在PCR中结合FAM标记的引物，RNA模板（内部合成或购买），50 mM Na + -HEPES（pH 8）缓冲液，NaCl，EDTA（pH 8）和水管。

表1.预先退火的引物-模板双工预混合物的组分量

组件

库存浓度

4倍浓缩双工溶液

体积（微升）

引物链

100 微米

6 微米

1.2

RNA模板链

50 微米

10 微米

4

EDTA

5毫米

1毫米

4

Na-HEPES，pH 8

1000毫米

50毫米

1个

氯化钠

500毫米

40毫米

1.6

高氧2

8.2

总体积（微升）

20

2. 使用热循环仪（95 °C 至25 °C，历时15分钟）对引物-模板双链体进行退火。

3. 根据表2 合并退火的双相材料，Na + -HEPES（pH 8）缓冲液，MgCl 2 和水。

注意：该实验应一式三份进行（即，引物延伸反应在三个单独的试管中进行，进行三个重复）。

表2 。每个引物延伸实验重复的成分数量

组件

库存浓度

最终浓度

体积（微升）

预退火的引物-模板双链体

4倍

1倍

3.75

Na + -HEPES，pH 8

1000毫米

200毫米

3

氯化镁2

500毫米

50毫米

1.5

高氧2

0.75

单体混合物

25毫米

10毫米

6

总体积（微升）

15

4. 在19 ° L水中，在1 °C的水中用1μl1M HEPES（pH 8）重悬每种单体，以产生浓度为100 mM的储备溶液。

5. 使用pH纸检查每种单体原料的pH。

注意：这是一个粗略的估计，目的是验证原料浓度在pH 8.0-8.5附近。

6. 在新的微量离心管中混合10 µl每种单体。

7. 通过向每个重复样品中添加单体混合物（6 µl）来启动引物延伸反应。反应通常在25 °C 的数字块加热器或热循环仪中进行。注意：没有必要保护反应不受光照。

8. 在29 µl淬灭溶液（13 mM EDTA （pH 8），〜8 µM互补RNA（内部合成或购买）和90％（v / v）甲酰胺）中淬灭1 µl引物延伸反应混合物。水）在所需的反应时间。

注意：在此特定情况下，根据以前的文献/数据选择了0.5 小时，1小时，2小时，3小时，5小时和24小时的时间间隔。如果缺少此信息，则通常进行两个独立的实验：粗略的时间过程（例如5分钟，10分钟，0.5小时，1小时，2小时，4小时，24小时，48小时），然后是精确的时间课程（例如，如上所述）。

9. 使用0.75 mm垫片和30孔梳子准备分析性PAGE凝胶（类似于制备型PAGE）。

注意：30 ml的凝胶混合物通常就足够了，可以使用15 µl TEMED和75 µl 20％（v / v）过硫酸铵水溶液引发聚合。

10. 将凝胶在5 W下预电泳15分钟。

11. 使用配有一次性针头的一次性注射器，使用1x TBE清洗每个孔。注意：应在将样品加载到凝胶上之前立即进行此操作。

12. 将时间过程中的淬灭样品（3 µl）装入单独的孔中。

13. 在侧井中加载染料溶液（溴酚蓝和二甲苯腈）作为分子量标记。

14. 在5 W下开始电泳10分钟。

15. 将功率调至20 W，持续1小时。

16. 停电，并用温水清洗板的外部。

17. 干燥板。

18. 根据制造商的说明，使用Amersham 台风生物分子成像仪分析凝胶。

注意：FAM 荧光团最好由蓝色激光（488 nm）激发。所有凝胶均应以至少100μm的分辨率成像。

19. 使用ImageQuant TM 在每个时间点（％）量化剩余引物的比例以及每种引物延伸产物的比例。这可以由软件自动完成（例如，背景扣除，频带检测等）。然后，用户根据需要手动调整参数（例如，为每个波段选择区域，添加波段，删除自动检测到的伪像）。有关定量的更多信息，请参见用户手册。

注意：背景扣除对于生成可重现和可靠的数据很重要。

数据分析

主要数据处理涉及引物和引物延伸产物禁令的相对定量（方案的程序E）。ImageQuant TM 用于所有报告的分析。可以使用其他软件，例如Ima geJ（美国国立卫生研究院的免费软件）。软件兼容性使用前应验证软件小号以外ImageQuant TM 。

笔记

为了获得可重复的引物延伸结果，用于独立实验的材料必须具有相同的质量，并且必须以相同的方式进行制备和存储。当单体原料被> 10％的降解产物污染时，或者在重新悬浮于50 mM Na + -HEPES（pH 8）中后，如果原料溶液的pH值不正确，则会观察到显着的可变性。

菜谱

8 M尿素（在水中）
将8摩尔尿素（480.48克）转移到1 升瓶中
将去离子水加至约850 ml刻度，并搅拌30分钟
将混合物进一步稀释至1 大号毫安RK作出8M尿素溶液
20％APS
将200 mg过硫酸铵转移到1.5 ml微量离心管中
向微量离心管中加入1 ml去离子水，离心直至室温完全溶解
注：Ť 他的解决方案应约1个月内使用，并储存在4 ℃下。

1 M茶叶
将1摩尔三乙胺（101.2克/ 139.4毫升）转移到1 升瓶中
去离子水添加到〜900 ml标记
解放军CE在冰浴这一解决方案
使用气体扩散装置，将气态CO 2 鼓泡到三乙胺/水中，直到溶液的pH值达到7.5（取决于扩散速度，大约3小时）
然后，用去离子水将溶液稀释至1 L 刻度
储存在4 °C
使用前检查pH值，如果需要，将CO 2 重新鼓泡至pH 7.5。

致谢

最初的工作是发表在美国化学会志（J.化学会志2019，141，10481。- 10488）。作者要感谢Constantin Giurgiu先生，Anna Wang博士和Tom Wright博士有关这项工作的有益讨论。JWS是霍华德·休斯医学研究所的研究员。这项工作得到了西蒙斯基金会（Simons Foundation）向JWS的赠款（290363）和NSF（CHE-1607034）向JWSDKO的赠款的部分支持，该奖学金是魁北克基金会（Fonds de Recherche du Quebec）的博士后研究奖学金（B3）的获得者-加拿大魁北克的自然与技术研究所（FRQNT），加拿大加拿大卫生研究院（CIHR）的博士后研究金。

利益争夺

作者宣称没有竞争性的经济利益。

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