材料和试剂

I型胶原包被的板96 - 孔板（格雷纳乙IO 多功能一体，目录号：655956）
针头和注射器解剖（费希尔小号系统求解，目录号：08-965B）
高压灭菌玻璃载玻片（VWR，目录号：16004-422）
2 ml血清移液器（Fisher Scientific，目录号：170354N）
50 ml猎鹰管（Corning，货号：14-432-22）
一次性血细胞计数器（iNCYTO ，目录号：DHC-N01-5）
粘板密封件（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），目录号：538619）
尼龙过滤器，40 µm筛孔，无菌（BD ，Falcon ，目录号：352340）
过滤装置，500毫升（Corning ，目录号：431097）
Biocoat Matrigel基质5毫升（Corning ，目录号：356234）
10毫升注射器（Fisher Scientific，目录号：201635）
台盼蓝（Sigma，目录号：T8154-20ML）
猿猴原代肝细胞（食蟹猴肝细胞（BioIVT））（https://bioivt.com/）
威廉姆斯（William's E）培养基（生命技术，目录号：12551-032）
电镀介质（Life Technologies ，目录号：CM3000）
恢复介质（Life Technologies ，目录号：CM7000）
胎牛血清克隆II（Hyclone ，目录号：SH30066.03）
氢化可的松（Sigma ，目录号：H0396-100 mg）
青霉素/链霉素/ L-谷氨酰胺（Life Technologies ，目录号：10378016）
人胰岛素（Sigma ，目录号：I3536-100 mg）
无菌试剂容器（Corning ，目录号：29442-476）
两性霉素B（Amp B），无菌水中储备量为250 µg / ml（Sigma ，目录号：A2942）
FISHERBRAND TM 易读TM 的15ml锥形聚丙烯离心管（Fisher Scientific公司，目录号：05-539-12）
FISHERBRAND TM 易读TM 的50mL锥形聚丙烯离心管（Fisher Scientific公司，目录号：05-539-13）
甲醇（Sigma ，目录号：34860-1L-R）
1x PBS（Life Technologies ，目录号：10010-023）
DAPI（Sigma ，目录号：D9542-5MG）
甲nti- P.食蟹猴HSP70（PcyM_0515400）多克隆抗体（由GenScript定制合成）
甲nti- P.食蟹猴LISP2（PcyM_0307500）单克隆抗体（由GenScript定制合成）
的Alexa 488缀合的山羊抗兔免疫球蛋白（我nvitrogen ，目录号：11034）
的Alexa 594缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白（我nvitrogen ，目录号：11032）
兔抗H3K9ac抗体（Abcam，目录号：ab177177）
食蚊（P. cynomolgi）感染的蚊子按蚊（Anopheles dirus）剪下了它们的翅膀蚊子（曼谷武装部队医学研究所武装部队医学研究所）
莱博维茨L-15媒体（Gibco ，目录号：11415049）
Leibovitz L-15培养基，4 x 50毫升，补充有2.5 µg / ml的AmpB。
莱博维茨L-15培养基4 x 50毫升，补充2 x P / S（青霉素/链霉素）
水中70％（v / v）乙醇
液氮
William's E维护介质（Life Technologies，目录号：12551-032），50 ml，补充有0.5 µg / ml Amp B
酚红（Life Technologies，目录号：A1 217601）
电镀介质（过滤除菌，1个月的保质期）（见ř ecipes）
威廉姆斯E维护介质（过滤器灭菌，保质期为1个月，在4°C下储存）（请参阅食谱）
设备

细头镊子（Fisher Scientific，目录号：12-000-122）
多通道移液器（Thermo Fisher ，目录号4661050N）
37℃水浴 °C
带摆桶转子和带盖桶的冷冻离心机（Thermo Scientific，型号：Megafuge 40R）
核计数器（ChemoMetec，型号：NC-100）
Potter-Elvehjem组织匀浆器，30 m l
恒温箱设置在37 °C ，5％CO 2
荧光显微镜
我们使用配备DFC365FX摄像机的Leica DMI6000B倒置荧光显微镜，该摄像机使用HC PL APO 63x / 1.40-0.60油物镜。

冷藏台式离心机，用于Eppendorf管（Eppendorf，型号：5415R），带有固定角度转子，预冷至4 °C
干冰制冰盒
生物安全柜（BSC）

软件

对于图像采集：Leica Application Suite X（LAS X）（Leica microsystems）www.leica-microsystems.com
对于显微镜图像处理：斐济（Schindelin 等，2012; Schneider 等，2012）
https://imagej.net/Fiji

程序

猿猴原代肝细胞的播种
预孵育胶原包被的96 - 在37孔板中℃的培养箱中，直到准备使用。有关该协议的摘要和工作流程，请参见图1。
D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902769--1458蒂埃里·迪亚加纳793027 \图jpg \图1.jpg

图1. 体外培养和疟疾肝阶段可视化的工作流程摘要。简而言之，将原代猿猴肝细胞接种在胶原原涂板上。交24小时，新鲜分离的子孢子从A.按蚊与原代肝细胞孵育蚊子。温育/感染3小时后，洗涤肝细胞以除去剩余的子孢子。用免疫荧光测定法观察到在感染后3-7天内侵入肝细胞并发展成肝阶段的子孢子。合并后的IFA图像显示感染后第6天的食蟹猴肝阶段寄生虫，用DAPI观察DNA含量（蓝色）和对食蟹猴HSP70蛋白具有特异性的多克隆抗体（绿色）。比例尺，35 µm。Hz是指含次生子的单核，Sz是指多核的裂殖体。

在37 °C 水浴中预孵育回收培养基（每小瓶肝细胞25 ml）和平板培养基（每小瓶肝细胞13 ml）至少15分钟。
从液氮罐中取出肝细胞冷冻管，放入装有干冰的冰箱中，以运送到实验室。
从干冰中取出冷冻管，中途快速打开盖子，以完全释放困在其中的液氮。盖紧瓶盖。
在37 °C 水浴中解冻细胞并连续摇动，直到小瓶中残留一小块冰为止。
用2 ml血清移液管小心地将细胞转移到生物安全柜（BSC）中的50 ml Falcon管中。
每10 s以1 ml的速率逐滴滴加，将25 ml的热回收培养基轻轻地加入细胞中。
倒转试管一次，以使细胞与培养基轻轻混合。
在28 °C 下以100 xg （677 rpm）旋转4分钟（加速= 9，制动= 9）。
用血清移液器小心吸出上清液。
用血清移液管，用足够的温和平板培养基轻轻重悬细胞沉淀。
用锥虫蓝和Neubauer改良的血细胞计数器芯片计数细胞。
如果需要，用其他预热的平板培养基将肝细胞悬液调节至1 x 10 6 细胞/ ml。
种子每孔83周的perl，相当于每孔83000组的肝细胞在96 - 孔平板中。
在37 °C ，5％CO 2 下孵育平板过夜。限制进入培养箱。
第二天，清洗（一次）并用100预热预热的维护介质更换旧的用过的介质。
在光学显微镜下观察以确定孔的覆盖率。
在37 °C ，5％CO 2 下孵育平板，直到需要感染为止。

分离P.食蟹猴从子孢子大劣按蚊的蚊子
食自食蟹猴（B. cynomolgi）（感染B）的猴子的血液中饲喂的A. dirus 蚊子来自泰国的AFRIMS。一旦蚊子被送到实验室，请立即进行唾液腺的解剖和隔离（Coleman 等，2007 ；Dembélé 等，2014）。
将孤立的唾液腺放在冰上。
将整个唾液腺制剂转移到置于冰上的特富龙均质器中。
上下旋转至少10次，使唾液腺悬液均质化。
在40 ml预冷的Falcon管顶部通过40μm尼龙滤器过滤均质子孢子。
用1 ml含两性霉素B（Amp B）的冷维持培养基在Teflon匀浆器中洗涤剩余的子孢子。
像以前一样，将40个过滤网过滤器倒入Falcon管中。
在4 °C下以6128 x g 旋转1 分钟，持续3分钟。
吸出上清液，并用维持培养基重悬沉淀。
等分试样10 OFL 1:10和1：100稀释的悬浮液均化到一次性血球并确定子孢子计数和活力在40光学显微镜X 放大率。剩下的放在冰上。
用维护培养基将子孢子（spz）悬浮液调整为1 x 10 6 子孢子/ ml。

猿猴原代肝细胞被分离的食蟹猴子孢子虫感染
从孔中吸出用过的培养基，并向每孔板中的1 x 10 6 spz / ml悬浮液中加入60 perl 。
对于未感染的对照孔，每孔添加60毫升William E维护培养基。
将板以44 8 x g f的速度离心，或在4 °C的条件下离心10分钟（加速度= 9，制动= 1）。
注意：以低速刹车旋转，将子孢子沉降到细胞上。

小心地将板从离心机中取出，并在第一次更换培养基之前在37 °C ，5％CO 2 下孵育3小时。限制进入培养箱。
孵育三个小时后，用多通道移液器小心地从孔中除去培养基，并向每个孔中加入150毫升的新鲜培养基（维护培养基+ Amp B）。
替代步骤：添加基质胶覆盖物以增加原代肝细胞的寿命（Dembélé 等，2014）。

在冰上解冻基质胶。
注意：保持基质胶在冰中以防止聚合。

与子孢子一起孵育三个小时后，用维持培养基（每次洗涤100毫升）洗涤肝细胞3次。
在细胞上轻轻加入Matrigel（每孔60 perl），使整个孔都被Matrigel覆盖
将Matrigel板在37 °C下放置15分钟。
在Matrigel孔上添加150毫升的新鲜培养基（维护培养基+ Amp B）。
在37 °C ，5％CO 2 下孵育板，每48小时后用150种维持液+ Amp B更换培养基。

免疫荧光检测可显示受感染的肝脏阶段
从板上移出用过的培养基，并用1 x PBS（每次150 µl /孔）洗涤2次。
除去PBS，并在室温下用100毫升冰冷的甲醇固定细胞3-5分钟。
除去甲醇，并用1 x PBS 洗涤3次。在每个孔中加入100ul PBS，并保存在4 °C 直至需要，或进行IFA染色（图2）。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902769--1458蒂埃里·迪亚加纳793027 \图jpg \图2.jpg

图2：感染后7天后原代肝细胞中食蟹猴的肝阶段寄生虫的代表性图像，用DAPI（蓝色），抗食蟹猴HSP70蛋白抗体（绿色）和抗-P 显现了子孢子。食蟹猴LISP2抗体（红色）。小号Cale的酒吧小号，35微米。箭头显示次生动物的免疫染色。

准备一抗在1 X PBS ：抗P.食蟹猴HSP70兔抗体稀释1：2000在1×PBS和抗P.食蟹猴在1×PBS 500：LISP2小鼠抗体稀释。
将固定细胞与一抗（每毫升50 ml ）在37 °C下孵育1小时。
注意：避免在37 °C下长时间孵育，因为这会导致较高的荧光背景。或者，如果需要，可在4度温育更长的时间。

抽吸并用1 x PBS 洗涤3次（每次洗涤100 perl）。
如下在同一试管中制备二级抗体稀释液：Alexa 488偶联的山羊抗兔免疫球蛋白（1：5,000）和Alexa 594偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白（1：5,000），并每毫升DAPI补充1μg。
每孔添加50 ml二级抗体稀释液，然后在37 °C 下将固定的培养板孵育一两个小时。
抽吸并用1 x PBS 洗涤3次。
使用具有40荧光显微镜可视化疟疾肝期（hypnozoite和裂殖）X ，60 X 或100 X 放大率。
根据体外条件下肝细胞的活力，该染色试验可用于可视化从感染后第1 天到第1 5-21 天的疟疾肝阶段（图3）。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 1902769--1458蒂埃里·迪亚加纳793027 \图jpg \图3.jpg

图3. 肝阶段发育的时程动力学。固定感染食蟹猴子孢子的培养的亚曼肝细胞，并在IFA分析中使用抗LISP2（红色）和抗HSP70（绿色）抗体进行分析，以监测子孢子感染后第1天至第10天的肝阶段发展。LISP2表达在感染后第3天首次检测到，呈新月形，位于最早发育的寄生虫的一侧。对于随后的时间点，LISP2 在多核裂殖体的周围液泡膜结构中积累。热休克蛋白（HSP70）在所有时间段的所有肝阶段均表达和检测。本手稿中使用的疟原虫HSP70抗体对疟原虫具有特异性，不会与人和灵长类肝细胞发生交叉反应。比例尺s ，35 µm。

菜谱

电镀介质（过滤消毒，保质期为1个月）
不含血清和酚红的William E培养基（Life Technologies）
解冻/电镀补充剂（生命技术）
将两种成分混合在一起，过滤除菌并在4°C下储存
威廉姆斯E维护介质（过滤器灭菌，保质期1个月，在4°C下储存）
零件

库存浓。

待添加

最终浓度

威廉姆斯E媒介

上

500毫升

上

胎牛血清克隆II（非热灭活）

100％

50毫升

10％

无菌水中的氢化可的松

50毫米

0.5毫升

50微米

青霉素/链霉素/ L-谷氨酰胺

100x（10,000单位/毫升笔; 10,000μg/毫升链球菌; 200 mM L-谷氨酰胺）

5毫升

2x（100单位/毫升Pen; 100μg/ ml链球菌; 2 mM L-谷氨酰胺）

无菌水中的人胰岛素

5毫克/毫升

0.5毫升

5微克/毫升

致谢

作者要感谢比尔和梅琳达·盖茨基金会（OPP1141292和OPP1137694）的慷慨支持。该协议是根据我们先前发表的工作进行改编和完善的（Gupta et al。，2019）。

利益争夺

所有作者均受诺华制药公司（Novartis Pharma AG）的雇用。

伦理

在本研究中，我们使用非人类灵长类动物作为原代肝细胞的来源。美国新泽西州诺瓦提斯（Novartis-LAS），新加坡新健康（SingHealth）和泰国曼谷武装部队医学科学研究所（AFRIMS）的诺华大型动物服务实验室已批准了研究方案（参考编号：2015） / SHS / 1024）。有关详细信息，请参见已发表的文章（Gupta et al。，2019）。

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