材料和试剂

1. P ipette提示

2. 赠送细胞刮刀（毕天火，目录号：22003）

3. 平底96孔板（Corning，目录号：3599 ）

4. 15 ml锥形管（Corning，目录号：430791）

5. 90毫米x 15毫米培养皿（Alpha Plus，目录号：16001 ）

6. 1.5米升微量离心管（Corning公司，目录号：MCT-150-C）

7. 3毫升带23号针头的注射器（BD，目录号：302111 ）

8. 封口膜（Bemis，目录号：PM996）

9. 白色念珠菌SC5314菌株（ATCC MYA-2876）

10. 6-12周龄的C57BL / 6JNarl bacground中的雌性近交小鼠（国家实验动物中心，RMRC11005）

11. Percoll （GE H ealthcare，目录号：17-0891-01）

12. 10倍Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D PBS）（生物工业，目录号：02-023-1A）

13. 10倍汉克平衡盐溶液（HBSS）（生物工业，目录号：02-015-5A）

14. 0.4％台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：93595）

15. 7.5 ％碳酸氢钠（Biological Industries，目录号：03-040-1B）

16. 酵母-p- 右旋糖（YPD）肉汤（Bioshop ，目录号：YPD002.500）

17. 琼脂A（BIO BASIC，目录号：FB0010）

18. 2 x 10 6 U / ml微球菌核酸酶（MNase ）（NEB ，目录号：M0247S ）

19. 无菌双蒸馏水H 2 O（ddH 2 O），通过NaOH调节至pH 11

20. 1x Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（请参阅食谱）

21. 1x Hank的平衡盐溶液（HBSS）（请参阅食谱）

22. YPD琼脂平板（请参阅食谱）

23. 红细胞（RBC）裂解缓冲液（请参阅食谱）

24. 100％Percoll （请参阅食谱）

25. 55％，62％和81％Percoll （请参阅食谱）

26. 热灭活的微球菌核酸酶（MNase ，参见食谱）

设备

Finnpipette TM F1可变体积导管（Thermo Scientific，目录号：4641050N，4641080N和4641100N）
计数室经过Neubauer改进（HAUSSER，目录号：CB73811-01490）
高压釜机（见注2）
37°C，5％CO 2 培养箱（见注2）
30°C培养箱，用于培养白色念珠菌酵母（请参见注释2）
台式通用离心机，带有旋转斗式转子（KUBOTA，4000型，转子名称：ST-720M和PT-89M）
CellGard ES节能II类A2型生物安全柜（NuAire ，型号：N U-475-400）
Vortex-Genie 2（科学产业）
光学显微镜（见注2）
手术解剖剪刀（锋利/锋利）（请参阅注释2）
塞姆肯钳（见注2）
Eu的是，用于管理CO thanasia室2 安乐死（见注2）

软件

Prism GraphPad软件（美国加利福尼亚）

程序

小鼠骨髓中性粒细胞富集
将6-12周龄的小鼠置于安乐死室中，并根据《 AVMA安乐死指南》（Cima，2013）用二氧化碳安乐死4分钟。使用手术解剖剪刀和塞姆肯钳获取股骨和胫骨。
注意：所有动物操作规程和实验规程都必须经过AAALAC认可的寄主机构的批准。

将骨头浸入1毫升冰冷的1x HBSS中。
切开骨头的两端，一端插入装有冰冷的1x HBSS 的3 ml 注射器的针头，推动柱塞将骨髓细胞冲洗入15 ml锥形管中。
冲洗骨一个更多的时间如在小号TEP 甲3。
在室温下以300 x g 离心管10分钟，并弃去上清液。
将细胞沉淀重悬于1 ml冰冷RBC裂解缓冲液中，并在室温下放置1分钟。
向管中加入1 ml 1x D PBS。
将试管在室温下以500 x g的速度离心5分钟，弃去上清液并将沉淀物悬浮在1 ml的1x D PBS中。
准备三层不连续的Percoll 溶液（在15 ml的锥形管中，按从上到下的顺序依次排列55％，62％和81％Percoll 。每层由3 ml组成，如图1所示）。
在不连续的Percoll 梯度上覆盖骨髓细胞悬浮液，如图1所示。
在室温下以1400 x g的转速在可旋转的转子中离心30分钟，并关闭制动器。
如图1所示，用微量移液器“轻轻地”除去顶部的6毫升溶液，并在新的15毫升锥形管中收集1.0-1.5毫升在62％和81％界面处含有嗜中性白带的溶液。

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图1。通过不连续的Percoll 梯度离心富集骨髓中性粒细胞。将骨髓细胞悬液覆盖在55/62/81％Percoll 梯度的顶部（步骤A 10）。在摆出的转子中离心（步骤A 11）后，梯度溶液中将出现三个可见带。中性粒细胞位于62％和81％Percoll （最低谱带）的界面。小心地取出前6毫升该溶液并收集顶部1.0-1.5毫升含有细胞在最低频带中的剩余溶液（2.5之间- 在标尺4.0马克）（步骤A 12）。

向装有中性粒细胞的试管中加入8 ml 1x D PBS，在室温下以1,000 x g 离心5分钟，弃去上清液。
小号uspend在2ml的沉淀d PBS和离心机在500 X 克在室温下3分钟并弃去上清液。
将沉淀物悬浮在1 ml HBSS中。
在390微升的稀释10 OFL良好混合的细胞悬浮液的0.4 ％台盼蓝溶液和计数的数量通过加载10μl的该混合物的活细胞的纽鲍尔计数室。活细胞明亮有光泽，而死细胞则染成蓝色。有approxi 三方共同0.8×10 7 - 1 X 10 7 每只小鼠骨髓细胞。
将细胞置于室温下直至使用。

的新鲜制剂C. 白色念珠菌
解冻冷冻的白色念珠菌的等分试样，并将其铺在YPD琼脂平板上。
将培养皿在30°C下孵育过夜。
刮白色念珠菌菌落用sterile1 ，000 TIPL 尖端和条纹在YPD酵母琼脂平板上。
在30°C下孵育平板过夜。
刮白色念珠菌用无菌200个菌落TIPL类型并悬浮于1ml HBSS。
取10毫升充分混合的白色念珠菌溶液，将其在390微升4％台盼蓝溶液中稀释，并通过将10微升混合物装入Neubauer 计数室来控制活酵母细胞的数量。而存活酵母细胞是明亮而有光泽，死细胞染成蓝色（AP 邻近地0.5×10 7 - 2 X 10克7 的白色念珠菌酵母每毫升）。
将白色念珠菌放在冰上直至使用。

中性粒细胞和白色念珠菌制剂
每1 ml HBSS溶液将从S tep A 16 获得的骨髓中性粒细胞稀释至2 x 10 5 。
将从S tep B 7 获得的新鲜收获的白色念珠菌酵母稀释至每1 ml HBSS 4 x 10 5 。
通过在250 µl HBSS中稀释0.5 ofl 的酶储备液来制备4 x 10 3 U / ml MNase 。

白色念珠菌的净杀灭测定
在平底的96孔板的孔中接种2 x 10 4个中性粒细胞（100 µl），并通过在37°C（5％CO 2 培养箱）中孵育30分钟使其粘附。
如图2所示，在不添加嗜中性粒细胞的情况下，留出100份HBSS的孔。
如图2所示，向所有孔（包括对照孔）中添加4 x 10 4个非调理的白色念珠菌酵母（100 µl）。
加入0.5微升的MNase （4 X 10 3 单位/毫升）以10单位/毫升或热失活的最终浓度MNase 在否则当量浓度至适当的孔中，如图2Ç entrifuge将板在800 X 克在在室温下放置3分钟，以使酵母发酵。

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图2. 白色念珠菌NET杀死试验的布局。从三只不同的小鼠获得的骨髓中性粒细胞分别悬浮在1x HBSS中。将来自每只小鼠的嗜中性粒细胞浸入两个单独的孔中（步骤D 1）。为1x HBSS留一口井（步骤D 2）。之后将板在37温育° 下进行30分钟，白色念珠菌悬浮液一个dded所有三个孔中（步骤d 3）。同时，将MNase 和热灭活的MNase （∆ MNase ）分别添加到胎次孔中（步骤D 4）。

在37°C（5％CO 2 培养箱）中将板孵育3小时。
向所有孔中加入0.5 毫升的MNase 。
将板在37°C（5％CO 2 培养箱）中放置15分钟。
将每个孔的内容物（约2 00 µl ）收集到微量离心管中。
向每个孔中加入200毫升冰冷的H 2 O（pH = 11）。
使用微型细胞刮刀刮擦每个孔的底部，然后用力吹打除去白色念珠菌菌丝。
收集每个孔的内容物，并添加到相同的微量离心管中。
重复步骤9至11（现在在微量离心管中总共有600个溶液）。
向每个微量离心管中加入400毫升HBSS。
剧烈涡旋微量离心管20 s。
对上清液进行1:10连续稀释，并在YPD平板上一式两份地稀释100份稀释溶液。
用石蜡密封板，并在30°C 和培养箱中放置2天。
枚举菌落形成单位（CFU），如图3所示。

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图3.具有不同白色念珠菌菌落形成单位（CFU）的YPD板。连续稀释含有白色念珠菌的上清液（步骤D15），并铺在YPD板上。将板在30℃温育 ℃ 2天（步骤D16）。白色念珠菌菌落颜色光滑且呈乳白色。从三个1:10连续稀释的上清液中将有3个不同数量的菌落。选择菌落在30到300之间的板（B）进行计数，而忽略该范围以外的板（A）。即使每个菌落彼此非常靠近，也要仔细计数（B，红色虚线圆圈）。

数据分析

控制井的CFU为N 0 ; 含有MNase 的孔的CFU 为N M ; 含有热灭活的MNase 的孔的CFU 为N ∆ M ，如图4所示。
平均在YPD碟和重复的CFU计数的将被用于如N 0 ，N，中号和N Δ 中号。

MNase 组的杀死百分率=（N 0 -N M ）/ N 0 ; 如图4所示，热灭活的MNase 组中的杀死百分比=（N 0 -N ∆ M ）/ N 0 。

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图4. 白色念珠菌净杀灭％的计算。N 0 ，N M 和N ∆ M 由重复对照孔（仅白色念珠菌），含有中性粒细胞，白色念珠菌和MNase的孔以及包含中性粒细胞，白色念珠菌和加热的孔的CFU计数的平均值确定。灭活的MNase 。如下所示计算杀戮百分比

为了估计由NET杀死酵母细胞的％，数据由Mann-Whitney检验，通过比较在杀死％分析MNase 在热失活的组到该MNase 基。

笔记

MNase 消化NET。在步骤D 4中包括MNase 和灭活的MNase 都是为了确认杀伤是由NET介导的，而不是由其他因素介导的。在步骤D 6中添加MNase的目的是从NET中释放与NET绑定的白色念珠菌，以用于随后的平板计数。
所列制造商的试剂和材料是作者实验室中用于该测定的试剂和材料。我们尚未尝试使用不同制造商的试剂和材料。该设备没有自己的制成品列出的是常见的实验室设备。
完全溶解红细胞很重要，因为RBC污染可能会干扰NET的形成。还应注意，在步骤A 6 中重复或延长RBC裂解可能会导致嗜中性粒细胞死亡。因此，如果1 ml冰冷的RBC裂解缓冲液不能裂解所有RBC，则增加体积但不延长裂解时间。
的发芽缺陷株白色念珠菌（例如，HLC 54株）不诱导NET形成（吴等人，2019）。
YPD平板上的菌落计数在30到300之间，可确保准确计数。对微量离心管中收集的上清液的几种1:10连续稀释液进行电镀将确保电镀其中一种稀释液将导致计数在此范围内。

菜谱

1x Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D PBS）
将5 ml的10x DPBS稀释在45 ml的ddH 2 O中

1x Hanks的平衡盐溶液（HBSS）
5毫升10X HBSS中44.64毫升的双蒸水稀释2 ö补充有360 微升的钠BICAR bonate

YPD琼脂板
将50克YPD肉汤和20克琼脂A加入1升ddH 2 O中
搅拌溶液直至YPD溶解
高压灭菌后冷却至50°C，然后将23 ml培养基倒入无菌的10 cm培养皿中
将YPD餐具存放在冰箱中直至使用
RBC裂解缓冲液
将0.61克Tris-HCl和4.15克NH 4 Cl溶解在500毫升ddH 2 O中
调节pH值至7.4并高压灭菌
100％Percoll
将45 ml Perco ll 储备液与5 ml 10x DPBS混合

55％，62％和81％Percoll
通过用1x D PBS 稀释100 ％Percoll （在配方5中制备）来制备55％，62％和81％的Percoll。

热灭活的MNase
在65 °C下将MNase （4 x 10 3 U / ml ）加热4小时并储存在冰箱中直到使用。

致谢

这项工作得到了BWH的中央研究院主题项目AS-105-TP-B08的支持，科学技术部的研究补助金为104-2320-B-002-052-MY2和107-2321-B-002-053-MY3分别为BWH和SYW。该协议改编自Vonk 等人的出版物。（2012年），并根据在其他研究中量化生物膜形成微生物生存力的方案进行了修改（Morici 等，2016；Mohammed 等，2017）。

利益争夺

没有财务竞争利益。

伦理

严格按照《实验动物的护理和使用指南》（第三版）的要求进行了小鼠研究，该实验手册由中华台北实验动物科学学会于2007年出版。所有动物程序和实验方案均获得AAALAC的批准国立台湾大学医学院动物实验伦理委员会认可的机构（许可证编号：20140304、20140533和20180013）。

参考文献

Antachopoulos ，C.，Walsh，TJ和Roilides ，E。（2007）。原发性免疫缺陷的真菌感染。Eur J Pediatr 166（11）：1099-1117。
布朗（GD），丹宁（Denning），DW，高夫（Gow），NA，列维兹（Levitz），SM，内蒂（Netea），MG和怀特（TC）（2012）。隐藏的杀手：人类真菌感染。Sci Transl Med 4（165）：165рв113。
Chen PY，Chuang，YC，Wang，JT，Sheng，WH，Yu，CJ，Chu，CC，Hsueh，PR，Chang，SC and Chen，YC（2014）。2002年和2010年在台湾北部的一家教学医院中对念珠菌血症患者的流行病学和治疗结果的比较。《微生物免疫感染》（J），《微生物感染》47（2）：95-103。
Cima ，G。（2013）。AVMA动物安乐死指南：2013年版。Javma-J Am Vet Med A 242：715-716。
Horn，DL，Neofytos ，D.，Anaissie ，EJ，Fishman，JA，Steinbach，WJ，Olyaei ，AJ，Marr，KA，Pfaller ，MA，Chang，CH和Webster，KM（2009）。2019年念珠菌血症的流行病学和预后：前瞻性抗真菌治疗联盟注册中心的数据。临床感染Dis 48（12）：1695-1703。
Kullberg，BJ和Arendrup ，MC（2015）。侵袭性念珠菌病。Ñ 英格兰医学杂志373（15）：1445至1456年。
Lionakis ，MS和Netea ，MG（2013）。念珠菌和宿主对侵袭性念珠菌病易感性的决定因素。PLoS Pathog 9（1）：e1003079。
Mohammed，MMA，Pettersen，VK，Nerland ，AH，Wiker ，HG和Bakken，V.（2017年）。从核镰刀菌和牙龈卟啉单胞菌的单物种和双物种生物膜中提取的细胞外基质的定量蛋白质组学分析。厌氧菌44：133-142。
Morici ，P.，Fais ，R.，Rizzato ，C.，Tavanti ，A.和Lupetti ，A.（2016）。合成乳铁蛋白衍生肽hLF1-11 对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。PLoS One 11（11）：e0167470。
Vonk AG，Netea ，MG和Kullberg，BJ（2012）。鼠多形核中性粒细胞吞噬白色念珠菌并吞噬细胞。方法分子生物学845：277-287。
伍锡永，黄建华，陈文怀，陈玉元，林春水，陈玉江，刘FT，吴学熙（2017）。细胞内在的Galectin-3可通过调节CR3下游Syk激活来减弱念珠菌对中性粒细胞ROS的杀伤作用。前台免疫8:48 。
Wu，SY，Weng，CL，Jheng ，MJ，Kan，HW，Hsieh，ST，Liu，FT and Wu-Hsieh，BA（2019）。白色念珠菌通过dectin-2触发NADPH氧化酶非依赖性中性粒细胞胞外诱捕剂。PLoS Pathog 15（11）：e1008096。