材料和试剂

50 ml锥形管（True Line ，目录号：TR2005）
斑马鱼野生型3至9个月大的成年病毒（Neos Pet Shop ，目录号：a2-1020v3）
绿色荧光PE微球（Loligo Systems，目录号：AC10555）
氧气罐5 L（Pinole ，货号：4530896201169）
亚硫酸钠（和光，目录号：192-03415）

设备

型号170 ml，230 V，50 Hz的游泳隧道呼吸计（Loligo Systems ，型号：SW10000）
高速摄像机（影像开发系统，型号：UI-3240CP-C-GL）
绿色激光笔300 mW，532 nm （Loligo Systems，型号：AC10551）
Eheim 泵5 L / min，230 V，50 Hz（Loligo Systems ，型号：PU10050）
水族馆加热器300瓦（日产，型号：R300W）
10 ml量筒（Iwaki，型号：3022CYL10S）
电子天平0.01 g分辨率（A＆D ，型号：FZ-3000i）

软件

AutoResp TM 版本2（Loligo Systems＃AR12600）
uEye座舱（影像开发系统＃UI-3240CP-C-GL）
数字粒子跟踪测速（DPTV）（Loligo Systems＃AC10550）
图片J （https://imagej.nih.gov/ij/）
Microsoft Excel（Microsoft）

程序

水速校准
该系统由一个外部水箱和一个双缸组成（图1A）。外部水箱有助于维持双缸水温，双缸由外缸和内部游泳室组成（图1B）。在游泳室A螺旋桨通过控制产生所述双缸水流螺旋桨ř 浮选取决于由AutoResp软件控制的输入电压。必须校准输入电压和水速。可以通过使用高速相机控制软件uEye Cockpit使绿色荧光微珠在游泳室中流动并使用DPTV分析运动的珠子的速度来进行此校准。

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图1 。游泳馆的结构。一。游泳隧道呼吸计的示意图。C：高速摄像机；D：溶解氧密度计，T：温度计。乙。双缸尺寸。Ç 。双缸的放大图。该螺旋桨旋转产生的双缸在定向水流。荧光珠在双圆柱体中流动并通过接收来自绿色激光指示器的激发光而闪烁。M：网眼；警：螺旋桨。d 。在有水流的情况下，斑马鱼以相同的速度与水速保持相同的位置游泳。在游泳室里放了两个塑料丝网，以免疲劳的鱼撞击螺旋桨。

设置一个游泳隧道呼吸计，在外部水箱和内部双气瓶中装有18升水，以及一个将外部水温保持在26±0.2的加热器 °C（视频1）。鱼不是校准水速所必需的。

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视频1.设置游泳隧道呼吸计

用荧光激光指示器更换荧光珠指示器（视频2），将溶解氧密度仪插入内部游泳室内。

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视频2.水速校准

将1 mg荧光珠悬浮在2 ml水中，然后通过双筒侧面盖顶部的进水口将其施加到双筒中。
启动AutoResp软件并将输入电压设置为0.5 V，启动螺旋桨旋转以在内部游泳室内产生水流（图1C）（https://loligosystems.com/FileCatalog/GetCatalogItemFileUpload?catalogItemId=82）。
启动uEye Cockpit软件以进行视频捕获，并记录荧光珠在内部游泳室内的运动（https://en.ids-imaging.com/ueye-cockpit.html）。
重复小号吨EP 小号甲4和甲5b的与为0.25V增量ý变化的输入0.5至4.5 V的电压以逐步方式。
使用DPTV软件分析电影中约10,000个荧光珠的速度，并计算每个输入电压下的水流速度。可在此处获得DPTV软件的用户手册。
使用Microsoft Excel使用最合适的近似线来绘制输入电压和水流速度的图形（图2）。
在AutoResp软件中输入图形参数，以便自动校准输入电压和水速。

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图2 。电压-水速度图。由于水流速度与输入电压成比例，因此近似线变为直线。

溶解氧浓度校准
溶氧密度计的探头可以在泳车分析过程中插入内部游泳室，记录水温下每饱和d 可溶氧（常数）的溶氧（％）。可以在AutoResp软件中使用氧饱和水（100％）和亚硫酸钠溶液（0％）进行溶解氧浓度计的校准。

将探针放在50毫升锥形管中的40毫升水中约5厘米深，并在AutoResp软件中检查溶解的氧气（视频3）。

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视频3.溶解氧浓度的校准

气泡〜5升从氧气罐成水的氧通过一个喷嘴（内径1mm）的，直到溶解的氧的值不再增加。
通过在AutoResp软件中设置“ Lock Hi”，将探头校准为100％。
将2 g亚硫酸钠（一种除氧剂）溶于40 ml水中，制成无氧水。
清洁探头并将其放在无氧水中，然后通过在AutoResp软件中设置“ Lock Lo”将探头校准为0％。

MEA 游泳速度的surement
斑马鱼（斑马鱼）饲养，并保持在26 - 28 ℃下在14小时光照和10小时黑暗的光周期下，每天两次在常规护理供给。在测量之前，用于游泳分析的斑马鱼要保持20至24小时不进食，因为斑马鱼进食后会降低游泳速度。这种测量之间进行AM 10 ：00 和下午3 ：00 。
把一个成年斑马鱼到10ml测量圆筒（Φ 11毫米），其含有5ml水，并测量体积（水高度的增加）和鱼的由质量ELECTRI 碳平衡（图3）。

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图3 。成年鱼体积和质量的测量。通过将斑马鱼放入量筒中，水高的增量即为鱼的体积。鱼的重量可同时使用电子天平测量。

将斑马鱼转移到装满水的50毫升塑料管中，然后将其放在室外水箱中10分钟，使鱼适应狭窄的圆柱体和水温（26±0.2 °C ）。
使用油性标记笔在内部游泳室上预先标记3厘米的距离线。这有助于在游泳影片分析中测量鱼的总长度和标准长度（请参阅数据分析B）。
在双缸的内部游泳室内添加单个斑马鱼（视频4）。

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视频4.将斑马鱼加载到游泳隧道呼吸计中

将双气瓶放在游泳隧道呼吸计中。
启动AutoResp和uEye Cockpit软件，分别准备控制输入电压和视频记录。
以10 cm / s的水流量启动螺旋桨旋转并同时进行视频录制（视频5）。

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视频5. 斑马鱼可以以10 cm / s的水速继续游泳

在以10 cm / s的水温预热1分钟后，将水速设置为15 cm / s，以在AutoResp软件中启动自动步进方案（图4）。

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图4 。游泳时间和水速的协议。水速最初设置为10 cm / s，持续1分钟，最终提高到15 cm / s，持续1分钟。此后，分步方案每1分钟将水速提高1 cm / s。

鱼变得疲劳且无法继续游泳（视频6）之后，停止螺旋桨旋转和视频录制。

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视频6.斑马鱼未能以33 cm / s的水速继续游泳

记录鱼未能继续游泳时的水温和溶解氧浓度以及水速和时间。
注：我F你想改变水的温度，你可以通过改变热加热器的设置来增加温度或通过将一个冰袋在外面水箱减少它。

数据分析

临界游泳速度的计算
临界游泳速度（U crit ）是鱼可以保持游泳的最大水流速度。根据确定的公式计算鱼的U 临界值（Brett，1964）。U crit = U max + T / 60。U max （cm / s）：斑马鱼继续游动整个1分钟时的最高水流速度。T（s）：鱼在1分钟内没有继续游泳的时间。

身体尺寸的测量
已经建立了三种不同的体型定义；总长度，标准长度和尾鳍长度（图5）（Plaut，2000年）。与游泳电影画面（背面视图）中预先标记的3 cm距离线相比，可测量总长度和标准长度。在ImageJ软件中，画一条3厘米距离的线，并使用分析/测量功能按像素测量长度。同样，沿着鱼的中线从头到尾画一条线，以像素为单位测量长度，然后用手计算实际长度。标准长度由从尾鳍的头部到根部的线计算。总长度与标准长度之差为尾鳍长度。斑马鱼的运动能力随尾鳍的长度而变化（Wakamatsu et al。，2019）。

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图5 。斑马鱼体型的定义。在鱼类研究中建立了三种不同的体型参数。

笔记

我们可以使用该方案获得可重复的结果（Wakamatsu 等人，2019）。

致谢

我们感谢平田实验室成员的有用评论。这项工作得到了MEXT，日本，内藤基金会和日本癫痫研究基金会的B项科研补助金（16H04657、19H03329）和创新领域的科学研究（17H05578）的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

本手稿和斑马鱼使用指南中描述的所有动物实验均已获得青山学院大学动物保护和使用委员会的批准（A9：有效期至2021年3月）。

参考文献

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