材料和试剂

1. 96孔微量滴定板（BD Biosciences，目录号：353075）

2. EnzCheck磷酸盐分析试剂盒（Thermo Fisher，目录号：E6646）

3. ATP（西格玛，目录号：A2383）

4. ATP酶（西格玛，目录号：A7510）

5. Bio-Rad蛋白质测定（Bio-Rad实验室，目录号：500-0006）

6. 牛血清白蛋白（BSA）50 mg/ml（InvitrogenTM，目录号：15561020）

7. Tris基

8. 重组ATPase蛋白/您想测试的酶（我们使用GCN4 HisTag融合蛋白，以下简称测试蛋白）

9. 1 M Tris Cl（pH-8.0）（见配方）

设备

1. 微量平板阅读器（帝肯，型号：Infinite M200 Pro）

2. 水浴（Thermo Scientific，目录号：TSGP02）

3. 漩涡（FisherBrands，目录号：14-955-163）

4. 高压灭菌器

程序

A、用布拉德福德分析法估计蛋白质浓度（Bradford，1976）

1. 从50 mg/ml牛血清中制备100µg/ml牛血清白蛋白储备溶液。

2. 使用96孔微量滴定板制备反应混合物。所有的反应都要三倍。

3. 制备2.5、5、10、20和50µg BSA标准溶液，如下表1所示：

表1。蛋白质估计反应混合物成分

嗯

浓度µg/ml

牛血清白蛋白（100微克/毫升）微升

水µl

布拉德福德试剂µl

SD1型

2.5

4

156

40

SD2型

5

8

152

40

SD3型

10

16

144

40

SD4型

20

32

128

40

SD5型

30

64

96

40

SD6型

50

80

80

40

4. 通过在空白微量滴定板孔中添加160µl水制备空白。

5. 将纯化后的重组ATP酶蛋白/酶用水稀释几次，使其总体积达到160µl，在微滴度板中制备试验样品。

6. 向每个微量滴定板中加入40µl布拉德福德试剂，搅拌并在室温下培养5分钟。

7. 在微量滴定板阅读器上读取595nm处的吸光度（ABS）。

8. 如果分光光度计没有绘制标准曲线的软件，则通过在X轴上绘制已知BSA浓度，在Y轴上绘制ABS595，在Excel中绘制标准曲线。获得趋势线，并使用趋势线方程和未知物质的ABS595来解析未知浓度。代表性数据如图2所示。

图2。BSA标准曲线

B、 ATP酶测定

试剂制备

准备与EnzCheck磷酸盐分析试剂盒一起提供的储备溶液，以进行分析。

1. 通过直接向瓶子（a组分）中添加20 ml dH2O，制备1 mM MESG基质储备溶液。充分混合，使MESG完全溶解（大约10分钟）。

注：不要加热溶解。由于MESG接近饱和点，因此即使在大量混合之后，也可能残留少量固体。溶解MESG基质后，立即将溶液等分至合适的体积，并立即置于-20°C下。

2. 使用前，将一小份MESG基质放在37°C水浴中解冻，直到刚好融化（不超过5分钟）。用力旋涡，立即将溶液放在冰上冷却。

注：溶液在pH值为7.5的冰上至少稳定4小时。在室温下，MESG在ph8.0和ph6.0下的半衰期分别为4h和40h。不要重新冻结剩余的MESG基质。

3. 通过向小瓶中添加500µl dH2O来制备酶嘌呤核苷磷酸化酶（B组分）储备，以制备100 U/ml储备溶液，并在4°C下储存。

4. 制备重组ATPase蛋白（试验蛋白）储备。

注：用不同浓度的试验蛋白分析atp酶活性。

5. 准备1毫米ATP储备。将0.05 g ATP（二钠盐）加入10 ml 25 mM Tris-Cl（pH 8.0）缓冲液（9.75 ml灭菌水中250µl 1 M Tris-Cl pH 8.0）中，制成10 mM ATP储备。通过在9 ml 25 mM Tris Cl（pH 8.0）中添加1 ml 10 mM ATP稀释至1 mM ATP储备。

6. 用dH2O稀释一部分50 mM磷酸二氢钾（KH2PO4），磷酸盐标准溶液100倍，生成500µM溶液。此外，稀释一部分500µM溶液，制成1µM KH2PO4工作溶液。

磷酸盐标准曲线

1. 用1µM KH2PO4在相应的井中制备10、20、30、40和50 nmol无机磷酸盐标准溶液，至300µl反应混合物的最终体积，如下表2所示：

表2。磷酸盐标准曲线反应混合物成分

嗯

无机磷酸盐

nmol公司

（KH2PO4 1µM）µl

20x反应缓冲液µl

MESG基板µl

水µl

嘌呤核苷磷酸化酶µl

空白

0

0

15

60

222

3

SD1型

10

3

15

60

219

3

SD2型

20

6

15

60

216

3

SD3型

30

9

15

60

213

3

SD4型

40

12

15

60

210

3

SD5型

50

15

15

60

207

3

2. 使用96孔微量滴定板进行分析。

3. 通过添加最终组分嘌呤核苷磷酸化酶开始反应，并在22°C下培养30分钟。

4. 读取360 nm处的吸光度。通过从每个标准品中减去空白来校正吸光度。

5. 通过绘制已知无机磷酸盐在X轴和ABS360在Y轴上的浓度，在Excel中绘制磷酸盐标准曲线，得到趋势线和方程。代表性数据如图3所示。

图3。磷酸盐标准曲线

atp酶反应

1. 使用96孔微量滴定板进行分析。如果平板阅读器不可用，使用1ml分析混合物在试管中进行分析。

2. 所有反应一式三份。

3. 通过混合储备溶液制备分析混合物，在96孔板中制备300µl供平板阅读器使用的分析混合物，以及在反应杯中使用的1 ml分析混合物，如下表3所示：

表3。ATP酶测定反应混合物成分

储备溶液

分析混合物（300µl）

如果1毫升的分析混合物

20x反应缓冲液

15微升

50微升

MESG基质溶液

60微升

200微升

重组试验蛋白/酶（0.5-2µg）

100微升

500微升

嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）（1U）

3微升

10微升

水

补充至300µl

将体积加至1毫升

4. 以水代替重组atp酶试验蛋白，在微量平板上制备空白。

5. 制备重组ATP酶试验蛋白样品体积，从0.5到2µg的水中蛋白质到100µl的总体积。

6. 加入100µl上述制备的重组ATP酶试验蛋白，制备好供试品。

6. 用0.5个单位的ATPase（Sigma）代替重组ATPase试验蛋白，制备好阳性对照微量板。

7. 将反应于22℃在平板阅读器中孵育10分钟。摄氏度

8. 通过在每个微量滴定板中添加25µl ATP（1 mM）作为底物，开始反应，并在读版器中混合。如果使用1毫升比色杯，则需要相应增加ATP的量（83微升）。

9. 在360 nm条件下，以0分钟的速度在微量平板阅读器中读取吸光度，然后每隔10分钟读取一小时，或直到在22°C下达到饱和点。将平板培养在微量平板阅读器中。

数据分析

1. 计算ΔA360nm/min试验（饱和点（min）处的ABS360-试样0 min时的ABS360）。

2. 计算ΔA360nm/Min空白（ABS360在饱和点（Min）-ABS360在0 Min时用于空白）。

3. 计算ΔΔABS360=（ΔABS360nm/min试验-ΔABS360nm/min空白）。使用每个反应中的所有三个复制品计算平均和标准误差。

4. 绘制Y轴上的ΔΔABS360与X轴上重组蛋白的聚集。ΔΔABS360与重组试验蛋白的代表性数据如图4所示。

图4。ABS360nm与试验（GCN4 His）蛋白质浓度的比较

5. 使用磷酸盐标准曲线趋势线方程（图3）计算无机磷酸盐（Pi）的数量，用ΔΔABS360代替y。

6. 使用以下公式计算ATP酶活性：

ATP酶活性=Pi/（t×V）×D=nmol/min/μl=mU/μl=U/ml

哪里，

Pi是标准曲线中的无机磷酸盐量（nmol）（在步骤5中获得），

t是反应时间（min）（达到饱和点的时间），

V为加入反应井的样品体积（100µl重组ATP酶试验蛋白），μl，

D是样品稀释系数（100µl/300µl）=0.34。

单位定义：一个uATPase的nit是每分钟产生1.0µmol磷酸盐的酶量。

7. 绘制Y轴上ATPase活性（U/ml）与X轴上重组试验蛋白浓度的关系。

8. 为了计算比活度，用U/ml除以样品中的蛋白质含量（换算成mg/ml）。

食谱

1. 1 M Tris Cl（pH-8.0）

Tris base 12.11克

去离子水80毫升

用盐酸将pH调至8.0

用去离子水补充至100毫升

在121°C下高压灭菌15分钟

致谢

这项工作得到了Noble Research Institute，LLC.的资金支持。本协议来源于Kaundal等人，2017年手稿。

相互竞争的利益

作者声明没有金融或非金融竞争利益。

工具书类

1. 布拉德福德医学硕士（1976）。一种利用蛋白质染料结合原理快速、灵敏地定量蛋白质的方法。《肛生物化学》72:248-254。

2. Brune，M.，Hunter，J.L.，Corrie，J.E.T.和Webb，M.R.（1994年）。用新型荧光探针直接、实时测定无机磷的快速释放及其在肌动球蛋白亚组分1atpase中的应用。生物化学33:8262-8271。

3. Carter，S.G.和Karl，D.W.（1982年）。孔雀绿无机磷酸盐测定方法的改进与评价。生物化学与生物物理方法7（1）：7-13。

4. Kaundal，A.，Ramu，V.S.，Oh，S.，Lee，S.，Pant，B.，Lee，H.K.，Rojas，C.M.，Senthil Kumar，M.和Mysore，K.S.（2017年）。一般控制不可抑制4降解14-3-3和RIN4复合物以调节气孔开度，从而影响非寄主抗病性和耐旱性。植物细胞29（9）：2233-2248。

5. Rees，D.C.，Johnson，E.和Lewinson，O.（2009年）。ABC运输公司：改变的力量。分子细胞生物学10（3）：218-227。

6. 施国强、高国明、梁文敏、陈立英、陈新立、胡新泰（2006）。XpsE的寡聚作用是由ATP结合而不是水解引起的，导致XpsE与XpsL的结合。EMBO J 25（7）：1426-1435。

7. Snider，J.，Thibault，G.和Houry，W.A.（2008年）。功能多样性蛋白质的AAA+超家族。基因组生物学9（4）：216。

8. 韦伯，M.R.（1992年）。无机磷酸盐的连续分光光度测定法和生物体系中磷酸盐释放动力学的测定。美国科学院学报89（11）：4884-4887。

9. 韦伯，M.R.和亨特，J.L.（1992年）。GTPase激活蛋白与p21ras的相互作用，用无机磷酸盐释放连续测定法测定。生物化学杂志287（第2部分）：555-559。