材料和试剂

1. 13mm圆盖卡瓦（Perfecta，目录号：10210013CE）

2. 24孔板

3. 一级抗体：大鼠抗LAMP1 IgG（1:50，1D4B）或大鼠抗LAMP2 IgG（1:50，ABL-93）（取自发育研究杂交瘤银行-DSHB-爱荷华大学）或任何所需囊泡的标记物

4. Alexa-Fluor-488-共轭等效抗鼠二级抗体（Life Technologies，目录号：A11006）

5. 德州红葡聚糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：D1863）

6. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）

7. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）

8. 皂甙（Sigma-Aldrich，目录号：S4521）

9. 4′，6-二胺-2′-苯吲哚盐酸盐（DAPI）（赛默飞世尔科学公司，目录号：D1306）

10. 多聚甲醛（Vetec，目录号：694）

设备

1. 荧光显微镜或共焦显微镜

软件

1. 图像J（NIH/https://imagej.nih.gov/ij/download.html)或者“斐济只是图像”斐济（NIH/http://fiji.sc/fiji)

程序

单元格标记：

A、溶酶体标记

1. 对于这个测试，我们从亚流式细胞单层开始。本实验采用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。为了在检测前24小时获得亚流动细胞单层，我们将细胞以4×104个细胞/孔的密度在13 mm圆形盖玻片上平板。按以下方法处理每个含有的细胞。

2. 用4%多聚甲醛固定15分钟。

3. 用500µl PBS冲洗3次。

4. 通过在500µl含有2%BSA和0.5%皂甙（PBS/BSA/皂甙）的PBS中培养20分钟来阻断和渗透细胞。

5. 用以下任何一种主要抗体孵育45分钟：大鼠抗LAMP1 IgG（1:50，1D4B）；大鼠抗LAMP2 IgG（1:50，ABL-93）（从发育研究杂交瘤库获得）或任何期望的标记物。

注：抗体必须在PBS/BSA/皂甙溶液中稀释。

6. 用500µl PBS/BSA/皂甙冲洗3次，以去除洗涤原抗体。

7. 用Alexa-Fluor-488-共轭等效次级抗体（Life Technologies）在PBS/BSA/皂甙或任何适当标记的次级抗体中以1:250的稀释度培养30分钟。

8. 用500µl PBS/BSA/皂甙冲洗3次，以洗涤二级抗体。

9. 用DAPI（10µg/ml）染色以显示细胞核。

10. 用500µl PBS冲洗3次。

11. 使用防褪色安装介质在显微镜载玻片上安装盖玻片。让显微镜载玻片干燥一夜。

12. 用荧光显微镜对载玻片进行分析，获得具有代表性的细胞图像。

注：使用60x和/或100x物镜采集整个细胞的图像。更喜欢单个单元，而不是单元组（下面将介绍分析一组单元的另一种方法）。

B、内吞小泡的标记

1. 在分析前24小时，通过在13 mm圆形盖玻片上以4 x 104个细胞/孔的密度在24孔板中电镀细胞来获得亚流单层。

2. 在选定的时间点，用德州红葡聚糖（0.25毫克/毫升）（或任何其他标记的葡聚糖），一种膜不渗透荧光染料培养细胞。

注意：如果你想研究一种治疗方法或其他条件是否能刺激或损害内吞作用，在德克萨斯红葡聚糖存在下进行刺激。

3. 在研究人员确定治疗时间点时，用500µl PBS冲洗至少3次，以消除细胞外德州红葡聚糖。这是避免高背景染色的关键步骤。按以下方法处理每个含有的细胞。

4. 用4%多聚甲醛（500µl）固定15分钟。

5. 用500µl PBS冲洗3次。

6. 遵循步骤A9-A12。

数据分析

A、溶酶体密度和核周区荧光强度的分散

如前所述，通过标记溶酶体，可以区分细胞质中的两个区域，并测量标记小泡在这些区域的荧光强度。第一个区域围绕着细胞核，称为核周区，可以定义为核半径的0.5。由于细胞核通常为不规则大小或椭圆形，因此必须定义短半径（r）和长半径（r）来定义相应的核周区域（改编自Nabavi等人，2008年，如图1所示）。将在整个区域进行测量，该区域由围绕核的周长确定，考虑从核中心到r+0.5r或r+0.5r的起点，去掉DAPI通道。细胞的第二个边缘区是由细胞周围的边缘区决定的。这些测量可以使用ImageJ/FIJI软件或类似软件进行。只需记住校准软件以提供μm而不是像素的测量值。要进行校准，请打开使用相同显微镜（具有相同目标）拍摄的已知尺寸元素的图像，例如比例尺或带有测微计刻度的尺子。使用线选择工具，用已知元素的相同度量绘制一条线，然后按“分析”>“设置比例”。ImageJ/FIJI将以像素为单位提供距离。用已知距离和单位（m）填写空白字段。校准可以应用于打开的图像，也可以通过选中“全局”选项应用于其他图像。μ

图1。核周区的定义，用于定量荧光标记的囊泡在椭圆形细胞核周围的分布。r是原子核的短半径，r是原子核的长半径。从核中心开始计算核周区半径，短半径和大半径分别为r+0.5r和r+0.5r，以确定获得的周长内面积。

1. 使用ImageJ/FIJI，打开DAPI标记的细胞核的图像。确定细胞核的直径（2R和2R）。为此，请使用DAPI通道图像，选择线条选择工具从DAPI染色的一个边框到另一个边框绘制一条线，并测量线的长度（确保在“设置测量值”对话框中设置了参数“长度”，然后按“分析”>“测量”）。

2. 计算原子核的半径（r和r）。

3. 打开Alexa488或德州红色标记的小泡图像。

4. 确定核周区，如图1所示。

注：用DAPI和Alexa488或Texas红色标记小泡的复合图像来确定核周区域的半径。

5. 一旦确定了核周区的大小，测量这个门控区内的荧光强度，排除DAPI通道。将这些值视为积分密度（ID）。

注意：执行的测量可以在“设置测量”对话框（分析>设置测量）中指定。勾选“面积”、“平均灰度值”和“综合密度”框。要根据定义的参数创建统计信息，请按分析>测量。

6. 测量整个细胞图像（ID）的荧光强度。

7. 测量至少4个背景区域的荧光强度（使用区域选择工具），并计算这些区域的平均灰度值（平均背景）。

8. 用下式校正核周区和整个图像的荧光强度（IDcor）减去背景（平均背景）的平均灰度值后的荧光强度（IDcor）：

IDcor=ID–（面积x平均背景）

9. 校正荧光强度后，使用以下公式确定细胞周围区域。

细胞周围区域=idcor整个图像–idcor核周围区域

10. 如果图像包含一个以上的细胞，则使用上述方程中所有同核周区的相加。然后，通过单元格的数量对结果进行规范化。

11. 根据需要绘制值。

12. 当观察到囊泡分布中的特定效应并如上文所述进行量化时，可以显示该效应的典型表现，即选择典型细胞并获得沿从细胞核中部到细胞外围的线的平均荧光强度（图2）。

图2。不同处理条件下成纤维细胞溶酶体的分布。培养MEF细胞，按每张图像所示进行处理，固定并标记如所述。绿色，溶酶体（LAMP1），蓝色，细胞核（DAPI）。A、未经处理的细胞具有典型的核周溶酶体云。用b10M离子霉素或c100ng/ml链球菌溶血素-O（SLO）预处理细胞，诱导Ca2+内流和溶酶体扩散，或D寄生虫亚马逊利什曼原虫（10/MEF）诱导Ca2+依赖性溶酶体向质膜扩散。对于每一个显示的典型细胞，从细胞核中部到细胞边缘画一条线，沿着这条线的荧光显示在每张图像的侧面，以显示囊泡从位于核周区域的核云到细胞外围的再分布。钢筋=20 mm。μ

B、标记的内囊泡沿细胞的分散-计算从核周围区域到细胞周围的囊泡数量

用这种方法，可以评估标记的小泡和细胞核中心之间的距离。因此，它产生了细胞和标记小泡聚集的区域的概况。例如，这种方法是一种有趣的替代方法，可以跟踪随着时间推移新的内吞作用的发生。

1. 在ImageJ/FIJI上，DAPI标记的细胞核的开放图像。

2. 当细胞核形状不规则时，测量平均核半径（R）或半径（R和R），使用前面数据分析步骤A1-A2中描述的方法。

3. 确定原子核的大致中心。

4. 打开Alexa488或德克萨斯州红色标记的小泡的图像。

5. 使用区域选择工具（环）确定细胞核周围的感兴趣区域（ROI），已知平均距离来自近似的核中心（D），如图（图3）所示。

注意：要保存多个ROI并分别操作它们，请选择第一个ROI，按分析>工具>ROI管理器，然后按“添加”。选择第二个ROI并添加到ROI管理器。重复这些步骤继续向图像添加roi。

图3。用于量化荧光标记囊泡分布的细胞核周围区域的定义。测量平均细胞核半径（R）和从细胞核中心开始已知距离（D）的细胞核周围面积。细胞核用DAPI（蓝色）染色，胞内小泡用德州红葡聚糖（红色）标记。

6. 确定D/R比率。接近1的值表示小泡位于靠近核周区域的位置，而高于1的值则表示位于离细胞中心较远且靠近细胞边界的位置。

7. 计数标记小泡的数量（如果可以计数）或测量每个环内的荧光强度。

注：囊泡计数可以手动或自动完成，方法是选择所需的图像和通道（RGB或8位类型），调整阈值（图像>调整>阈值），以定义对黑白图像的更好调整。然后按“处理>二进制>转换为遮罩”（如果接触到粒子，请按“过程>二进制>分水岭”将其分离），最后继续计数：分析>分析粒子。在测量荧光强度的情况下，考虑ID值，校正背景值，如上文所述替代方法第5至8项所示。

8. 将数值绘制为囊泡数（占总数的%）或荧光强度与D/R的关系，如图4所示。

图4。绘图示例。德州红右旋糖酐标记的囊泡在内皮细胞（Eahy.926）24小时内相对于细胞核的分布的定量分析。囊泡与其各自的细胞核中心之间的平均距离用字母D表示，相对于平均细胞核半径（R）的平均囊泡距离定义为D/R比值表示为位于特定D/R处的总囊泡百分比（N/N total）。

致谢

我们感谢米纳斯吉拉斯议会（FAPEMIG）的保障基金会（Fundaço de Aparoço de Aperfeiçoamento de Pessoal de Pessoal Superior（CAPES）），国家科学技术委员会（CNPq）和国家流体复合技术研究所（INCT/FCx）支持这项工作，并为荧光设备提供图像处理中心（CAPI/ICB）。我们也感谢Hissa等人之前的工作。（2012年和2013年）。

相互竞争的利益

手稿没有利益冲突。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

工具书类

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