材料和试剂

方形石英盖玻片1“ x 1” （电子显微镜科学，目录号：72256-02）
石英显微镜载玻片75 x 25 mm〜1 mm（电子显微镜科学，目录号：72250-03）
深孔板（生活小号cience，爱思进，目录号：P-DW-20-CS）
Eppendorf 200 μ升管仪（Eppendorf，目录号：0030124707）
Eppendorf 5 ml管（Eppendorf，目录号：0030119401）
多通道，ClipT的移液器吸头ip 1250，无菌过滤器装填（Thermo Fisher Scientific，目录号：94420818 ）
直放站吸头（Eppendorf，Advanced Combi Tips，5 ml，目录号：0030089456; 25 ml，目录号：0030089472; 50 ml，目录号：0030089480）
带PTFE熔块的PP反应器2毫升（Biotage ，目录号：V020TF051）
惰性气体盖板，48 x 2 ml反应器小瓶（MultiSynTech ，目录号：Z002IC048）
N，N 二甲基甲酰胺（DMF）（认证ACS ）（Fisher，目录号：D119-4）
二氯甲烷（DCM）（GR ACS）（Millipore，目录号：DX0835-3）
甲醇（通过ACS认证）（Fisher，产品目录号：A412-4）
盐酸半胱胺（Sigma公司，BioXtra ，目录号：30078-25G），b ackflush与Ñ itrogen
乙醚将无水（认证的ACS ）（费希尔，目录号：E138-1），b ackflush与Ñ itrogen（爆炸性危害）
Fmoc-N- 羟基琥珀酰亚胺酯（Fmoc-OSU）， ≥ 98％（Sigma，目录号：46920-5G-F），一吨4℃下在干燥器中
无水吡啶，无水99.8％（Sigma，目录号：270970-1L）
N，N- 二异丙基乙胺（DIPEA），特纯99.5％生物技术级（Sigma，目录号：496219-100ML），b ackflush与Ñ itrogen
N，N- “ - Diisoipropylcabodiimide （DIC），特纯≥ 98％（Sigma，目录号：38370-25ML），b ackflush与Ñ itrogen
乙酸酐，试剂加≥ 9 9％（Sigma，目录号：320102-100ML）
4-甲基哌啶（Sigma，目录号：M73206-500ML）
乙酰甘氨酸，试剂加99％（Sigma，目录号：A16300-100G），d esiccator
甘氨酸（将Fmoc- 甘氨酸-OH）（Novabiochem的，目录号：8.52001.0100），d esiccator
HCTU（Anaspec ，目录号：62626-250），4°C
4-甲基吗啉（NMM）（Sigma，目录号：M56557-100ML）
三氟乙酸（TFA）（菲舍尔（Fischer），目录号：O4902-100 100ML），已通过肽和蛋白质分析认证
苯酚（Sigma，目录号：185450-100G）
三异丙基硅烷（TIPS）（Sigma，目录号：233781-50G）
丙氨酸（Fmoc基-ALA-OH）（Novabiochem的，目录号：8.52003.0100），d esiccator
半胱氨酸（Fmoc-Cys（Trt）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52008.0025），-20°C
天门冬氨酸（Fmoc- Asp（OtBu ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52005.0025），-20°C
谷氨酸（Fmoc- Glu（OtBu ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52009.0025），-20°C
苯丙氨酸（Fmoc- Phe -OH）（Novabiochem ，目录号：8.52016.0100），-20°C
组氨酸（Fmoc His（Trt ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52032.0025），-20°C
异亮氨酸（将Fmoc-ILE-OH）（Novabiochem的，目录号：8.52010.0100），d esiccator
赖氨酸（Fmoc- Lys（Boc ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52012.0025），-20°C
亮氨酸（将Fmoc-LEU-OH）（Novabiochem的，目录号：8.52011.0100），d esiccator
天冬酰胺（Fmoc- Asn （Trt ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52044.0025），-20°C
谷氨酰胺（Fmoc- Gln（Trt ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52045.0025），-20°C
甲硫氨酸（将Fmoc-的Met-OH）（Novabiochem的，目录号：8.52002.0100），d esiccator
脯氨酸（Fmoc-Pro）（Novabiochem ，目录号：8.52017.0025），-20°C
精氨酸（Fmoc- Arg （Pbf ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52067.0025），-20°C
丝氨酸（Fmoc-Ser（tBu ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52019.0025），-20°C
苏氨酸（Fmoc- Thr （tBu ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52000.0025），-20°C
缬氨酸（将Fmoc-VAL-OH）（Novabiochem的，目录号：8.52021.0100），d esiccator
酪氨酸（Fmoc-Tyr（tBu ）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52020.0025），-20°C
生物素（Sigma，目录号：B4501-1G），4°C
对苏氨酸（Fmoc- Thr （PO-（OBzl ）-OH）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52070.0001），-
20°C
对丝氨酸（Fmoc- Ser（PO-（OBzl ）-OH）-OH）（Novabiochem ，目录号：8.52069.0001），-
20°C
天然链霉亲和素蛋白（DyLight 650）（Abcam，目录号：Ab134341），4°C
滑溜酰胺（4-[（（2,4- 二甲氧基苯基）（Fmoc-氨基）甲基] 苯氧基乙酸）（Sigma，目录号：38784-5G），4°C
柠檬酸氢铵（DHAC）（Sigma，目录号：C1883-100G），d esiccator
三羟基苯乙酮一水合物（THAP）（Sigma，目录号：91928-1G）
乙腈（Sigma，目录号：271004-1L）
牛血清白蛋白（Sigma，目录号：A3294-50G）
Tris（Sigma，目录号：T3253-500G）
氯化钠（Fisher，目录号：BP358-10）
TWEEN 20（Sigma，目录号：P7949-500ML）
磷酸盐缓冲盐水（Gibco，目录号：10010-023）
CNA绑定缓冲区（请参阅食谱）
PBS-T（请参阅食谱）
试剂B（请参阅配方）

设备

Syro II肽平行肽合成系统（MultiSynTech ，型号：S2PS）
U形块反应器，48位，用于2 ml反应器小瓶（MultiSynTech ，目录号：Z048UB020）
涡流混合器，独立，可容纳2个反应器块（MultiSynTech ，目录号：S006VO002）
空头，48位（MultiSynTech ，目录号：Z048AK000）
安装工具–肽合成（MultiSynTech ，目录号：Z000VW000）
转移头48 pos（MultiSynTech ，目录号：Z048TK048）
转移架48/15（MultiSynTech ，目录号：Z048TR015）
96孔氮气流蒸发器（Glas -Col，型号：099A = Ev96）
热多通道移液器可调间距（Thermo Fischer Scientific，目录号：4672090BT）
Eppendorf中继器（Eppendorf，目录号：4982000322）
水浴超声波仪（深圳Ĵ 即Ť 人工智能ù ltrasonic Ç 贫ING Ë quipment Ç O，LTD，型号：10A）
MSP 96目标抛光钢BC（布鲁克，目录号：8280800）
尼康Ti Eclipse自动倒置显微镜（尼康，型号：TE2000 ）
电动XY平移台（美国应用科学仪器公司，尤金）
SOLA光引擎（Lumencor ，Beaverton或OR ）
氙弧灯和臭氧洗涤塔（Lambda LS，萨特仪器，加利福尼亚州诺瓦托）
紫外线液体光导（萨特仪器，加利福尼亚州诺瓦托）
可编程滤光片Lambda 10-2（萨特仪器，加利福尼亚州诺瓦托）
EM CCD相机，Andor Zyla 4.2（英国牛津仪器公司）
注意：有关用于成像的显微镜的更多信息，请参见Harink 等。，2019。

软件

Micromanager（用于控制用于对MRBLE成像的显微镜，可以根据需要替换）：https ://micro-manager.org/ （Edelstein 等，201 0 ）
MRBLE软件包（用于分析MRBLE图像的开源软件分析软件包），https ://github.com/FordyceLab/MRBLEs（Harink et al。，2019）
GraphPad Prism（用于分析绑定数据，可以根据需要替换）：（https://www.graphpad.com/）
ProteoWizard 参见MS（用于分析MALDI质谱数据）：http : //proteowizard.sourceforge.net/download.html （Chambers 等人，2012）
Microsoft Excel
Syro II肽合成仪软件（MultiSynTech ，肽合成仪随附）

程序

这个完整的协议描述了（图1 ）：（1）PEG-DA水凝胶珠的功能化，准备进行肽合成；（2）PEG-DA珠上的固相Fmoc肽合成；（3）肽验证和肽密度测量，（4）使用与珠子结合的肽文库的多重蛋白-肽结合测定，以及（5）最终数据分析以提取定量结合亲和力信息（K d ）。在该协议中，计算了48个试管的所有含量，每个试管包含一个代码（一个48个代码的肽库），每个代码估计有1 mg MRBLE（约10,000个珠子），负载量为0.32 mmol / g。因此，相当于1〜 50毫克〜0.016毫摩尔。

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图1 。MRBLE功能概述。PEG-DA珠用游离胺基官能化，用于随后通过迈克尔加成的固相肽合成。通过依次浸入水和溶剂中，可以用酸不稳定和酸敏感的接头对外壳和内芯进行不同功能化。因此，在最终的氨基酸侧链脱保护过程中，内核的酸不稳定的R 油墨酰胺连接基被裂解，从而可以收集洗脱的肽，以进行质量控制和通过质谱法进行验证。外壳中的接头保持附着在微珠上，用于MRBLE-pep分析中下游的蛋白质-肽相互作用测量。

第一部分：MRBLE的生产

在开始实验方案之前，请使用多层PDMS“微珠合成”微流控设备（如先前所述[ Gerver et al。，2012 ] ）或使用注射泵和标准微滴发生器生产PEG-DA水凝胶微珠。

珠合成后的制备：

将包含每个光谱代码的MRBLE（此处为48代码库）转移到放置在U型块反应器中的48 x 2 ml反应器容器中，该反应器安装在真空歧管中，易于洗珠而不会损失珠子（图2，请参见注释）。
通过将U形块反应器组件放在歧管上并依次用二氯甲烷（DCM）洗涤3次，用甲醇（MeOH）洗涤3次，用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤3次，来洗涤MRBLE 。对于每个洗涤步骤，使用中继移液器在每个容器中填充1 ml溶剂，并使用氮气流通过气体盖板将其推入反应器容器，以除去溶剂（图3 ）。
洗涤后，向每个容器中加入400 µl DMF，将整个U形块反应器组件移至水浴超声仪中，并声处理30分钟。为了确保进行彻底的超声处理而不会造成污染，超声处理仪中的水位应与试管中的液体水平相匹配。根据水浴超声仪的尺寸，可能需要将反应堆容器转移到其他机架上。
在先前的工作中，我们发现使用该气体盖板将溶剂推入容器比通过使用真空歧管简单地抽取溶剂能更均匀地进行清洗。但是，这可能取决于所使用的精确设置。为确保功能均匀，在此步骤和所有后续步骤中，重要的是要验证珠粒是否均匀分布且不会结块。在超声处理期间，通过观察浮珠经常检查这一点；如有必要，请执行其他超声处理步骤以分解剩余的团块。

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图2 。用于肽合成的U型块反应器，用于在化学功能化之前洗涤珠子。每个U型块反应器可容纳48 x 2 ml反应容器。

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图3 。氮气盖板将液体通过反应容器推入废液瓶。U型块反应器连接到空头，以将所有48个管中的液体收集到一个排入废物的管中（图中的玻璃瓶）。如果有必要将每个试管的内容物分开，可以更换喷头（参见图6）。使用中继器添加洗涤液。来自所有48个管的液体被推入废液瓶。可以用其他配置代替此设置。但是，这使多个洗涤步骤在两次运行之间既方便又可重复。

第二部分：MRBLE的功能化

在肽合成之前，组成MRBLEs水凝胶珠的PEG-DA聚合物必须用游离胺基进行化学官能化，以允许Fmoc保护的氨基酸构件直接偶联。在该协议中，MRBLE的外壳通过耐酸接头选择性功能化（在暴露于Fmoc肽合成过程中最终侧链脱保护所需的TFA时保持完整），而内芯则通过酸不稳定的接头，在暴露于TF A 后会裂解（Kunys 等，2012 ）。通过这种方式，可以在肽合成的最后步骤中洗脱来自内核的肽，以通过质谱法进行直接分析，而偶联至外壳的肽保持附着状态，以进行下游结合测定。该过程分5个主要步骤进行：（A）迈克尔加成；（B）外壳的选择性功能化；（C）内芯的选择性功能化；（D）任何剩余的游离氨基的封端；以及（E）在所有未封端的官能团上添加甘氨酸残基，以允许肽合成中的下游偶联。

迈克尔加成法使用半胱胺和吡啶将胺官能团加到PEG-DA珠的丙烯酸酯基团上（反应1）

反应1 。迈克尔加成反应，使用半胱胺和吡啶将胺基添加到基于PEG-DA的MRBLE 的丙烯酸酯基团上

向每个反应容器中加入400 µl的20 ml DMF / 30％水，其中含有20当量的半胱胺（36 mg）和20当量的吡啶（24 µl）。
将U型块组件放在Vortex混合器上（图4 ），并在室温（1600 rpm，振荡15 s和暂停30 s）下将反应孵育20小时以上。
通过除去液体并添加新鲜试剂并像以前一样孵育珠子来重复反应。
使用惰性气体盖板分别用1 ml DMF，MeOH和DCM洗涤小珠3x，如第一部分：MRBLE的生产中所述。

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图4 。装有2个U型块电抗器的Vortex混合器

用酸稳定的Fmoc保护的外壳的选择性官能hydroxys uccinimide 酯（反应2）
注意：为确保在此步骤中仅功能化外壳，首先将内核用水溶胀，然后在不溶于水的溶剂中以Fmoc-OSU以0.1当量进行反应。

反应2 。MRBLE 在水中溶胀后，在乙醚/ DCM 中用Fmoc-N- 羟基琥珀酰亚胺（Fmoc-OSU）对外表面进行选择性功能化

用1 ml DMF和1 ml ddH 2 O 洗涤所有反应容器。
向每个反应容器中加入400 µl ddH 2 O，并在涡旋混合器上孵育至少20 h（摇动15 s，以1600 rpm暂停30 s）。
注意：此步骤可确保在非水溶剂中进行反应之前，将水珠溶胀。

小心地排水，并确保珠子周围的所有水都没了。珠子内部仍应有水用于下一步反应，因此重要的是不要将珠子排干太久，以防止珠子内部变干。
将400 µl 40 ml的55％DCM和45％乙醚的溶液添加到每个含有以下物质的反应容器中：
0.1 eq Fmoc OSU（2毫克）

1当量DIPEA（2.68 µl）

在涡旋混合器上孵育所有反应容器20分钟（以1600 rpm的速度摇动15 s，暂停30 s）。
娲SH珠3×与每个DMF，MeOH和DCM的使用如先前所描述的惰性气体盖板1毫升第I部分：MRBLEs的生产。
注意：此洗涤步骤对于在下一个功能化步骤之前清除珠粒芯中的所有水至关重要。

用酸不稳定的Fmoc保护的Rink酰胺接头对内核进行功能化（反应3）
注意：在上一步的最后进行彻底清洗，应该已经清除了珠粒芯中的所有水，现在可以使用酸不稳定的Rink酰胺（使用DMF作为溶剂）对内芯进行功能化。

反应3 。使用DIPEA和DIC在DMF中使用Rink酰胺对内核进行功能化

向每个反应容器中，加入400 µl 20 ml的DMF溶液，其中包含：
5当量Rink 酰胺（41毫克）

5 eq DIC（12微升）

10当量DIPEA（28 µl）

摇动所有反应容器至少16 h（以1600 rpm摇动30 s暂停15 s）。
排干反应混合物并添加新鲜试剂，重复上述步骤。再摇至少2个小时。
洗涤珠3×使用作为惰性气体盖板每次1毫升DMF，MeOH和DCM的在前面描述的第一部分：MRBLEs的生产。

封盖剩余的游离氨基
注意：为防止氨基酸在以后的肽合成步骤中与任何剩余的游离氨基偶联，这会导致截短的肽，未与Fmoc-OSU反应的胺基（在过程B中）或Rink酰胺（在过程C中）必须加盖。

通过向每个反应容器中加入400 µl乙酸酐与25％吡啶的混合物（制备25 ml）来封盖其余的NH 2 基团。
在涡旋混合器上孵育所有反应容器15分钟（不要再长时间以避免可能的副反应）（以1600 rpm的速度摇动30 s暂停15 s）。
使用惰性气体盖板将每个反应容器中的小珠分别用1 ml的DMF，MeOH和DCM洗涤3次，如第一部分：MRBLE的生产中所述。

甘氨酸偶联：在制备过程中或下游肽合成中，脱保护所有内部和外部Fmoc保护的胺基并连接Fmoc保护的甘氨酸（反应4和反应5）。

反应4 。外壳胺基与Fmoc-甘氨酸的反应

反应5 。Rink内酰胺与Fmoc-甘氨酸的反应

对于所有反应容器，通过加入400 µl 20％4-甲基哌啶在DMF中的溶液并在涡旋混合器上振摇10分钟（以防止有害的副反应）来脱保护Fmoc保护的胺基（在15秒钟内振摇30秒钟） 1,600 rpm）。
通过用3x DMF，3x MeOH和3x DCM洗涤珠子来停止脱保护反应。
向每个反应容器中，加入400 µl 20 ml的DMF溶液，其中包含：
0.5当量Fmoc甘氨酸（2.38毫克）

4.5当量乙酰基-甘氨酸（8.43毫克）

5 eq DIC（12.4微升）

10当量DIPEA（28 µl）

将所有反应容器在涡旋混合器上孵育至少16小时（以1600 rpm的速度摇动15 s，暂停30 s）。
删除的解决方案，并重复小号TEP 小号E3和E4。
使用惰性气体盖板分别用1 ml的DMF，MeOH和DCM洗涤小珠3x，如第一部分：MRBLE的生产中所述。

第三部分：MRBLEs上的固相肽合成

以下MRBLEs的与游离氨基外壳的官能化，肽可直接在MRBLEs使用标准的固相肽合成技术（合成例如，将Fmoc 肽合成）。在这里，我们提供了使用Syro II高通量肽合成仪进行肽合成的简短协议，该协议包括此处使用的相关U-Block反应器和涡旋混合器。有关仪器设置和使用的其他详细信息，请查阅制造商的说明。此外，我们发现描述肽合成的这些在线资源特别有用：来源1和来源2。

P eptide合成
注意：使用Syro II高通量肽合成机器人（或类似产品）在功能化MRBLE上进行自动化固相肽合成（SPPS ）。

使用400 µl 20％4-甲基哌啶的DMF溶液在每个反应容器中的MRBLE上的所有Fmoc基团脱保护10分钟。
用400 µl DMF 用DMF洗涤每个反应容器3 次。
准备肽合成仪以进行合成。
对于典型的MRBLE-pep运行，我们使用以下综合协议：
氨基酸偶联：在HCTU（9.8 eq）和NMM（20 eq）存在下，每种氨基酸（10 eq）进行2 x 20分钟偶联。
每个反应容器用400 µl DMF 洗涤3 次。
加入200μl40％4-甲基哌啶的DMF溶液，孵育2分钟并沥干。
在DMF中加入200 µl 20％4-甲基胡椒碱，孵育2分钟。
每个反应容器用400 µl DMF 洗涤3 次。
合成程序完成后，向每个反应容器中加入400 µl DMF。该步骤是为了确保运行结束时没有反应容器完全变干。
开始前肽甲醇合成小号，确保有没有气泡在得出解决方案的流体线条。气泡可能导致管中液体量不均匀。如果发现任何空气，请清洗管路以消除气泡。
在肽合成软件中选择48 x 2 ml反应容器（或适当时选择其他容器）。
加载一个文本文件，指定要合成的每种肽的序列，并确保没有空格。用于每个步骤中必要的一套反应（例如，可以考虑不同的耦合条件小号FO ř特定步骤取决于你的氨基酸）。在Syro II程序上，我们确保标记了“氨基酸优先级”和“体积检查”，并且未标记“全部清洗”。
使用0.54 mmol / g树脂负载，2 mg树脂量和15当量，以0.16 mmol的浓度计算量。在准备溶液之前，请保存软件生成的表格以指导所需的每种试剂的量。
保存由软件计算的每种肽的分子量，以备将来在MALDI质谱分析中参考。
根据S yro II软件生成的表格，准备DMF中的氨基酸，HCTU和NMM溶液，必要时进行超声处理。该表显示需要和多少DMF氨基酸，HCTU和NMM的量它们需要被溶解。它还将显示所有洗涤步骤都需要多少DMF以及40％的4-甲基哌啶。我们通常将所有溶液都过量10％以确保有足够的溶液（例如，考虑到长时间肽合成过程中的蒸发）。在50毫升试管中准备氨基酸。根据制造商的说明，将HCTU和NMM装入特殊的玻璃肽合成仪瓶中。装满DMF和连接到肽合成仪的40％4-甲基哌啶玻璃瓶。
启动合成器。在Syro II合成仪上，合成48个具有15个氨基酸的肽大约需要24至48小时，具体取决于偶联时间和文库的复杂性（例如，文库是否包含特定肽序列与馆藏的系统性单个氨基酸变化）序列完全不同的肽段）。

第四部分：P eptide装填密度测试和表征

准确的蛋白质-肽结合亲和力的多重测量要求所有试剂以大约相同的浓度存在。假设在MRBLE-pep分析中将肽展示在珠子上，这意味着来自每个密码的珠子都具有大致相同的大小，将相同数量的珠子添加到每个分析中，并且展示的肽的表面密度大致恒定。尽管微流产生的MRBLE珠比大多数市售的基于珠的树脂具有更高的单分散性，但必须注意确保每个肽序列以大约相同的密度展示。为了直接显示合成的肽密度（并估计每个珠的肽负载量），我们通过以下步骤对肽进行生物素化处理，以便使用荧光标记的抗生蛋白链菌素进行可视化：（1）在合成后将肽生物细化，（2）使用荧光标记法检测生物素化的肽链霉亲和素和（3）解码珠子并测量荧光强度（图5）。重要的是，可以在合成协议中的任何一点上执行此步骤，以允许对单个步骤进行故障排除（例如，在初始MRBLE功能化之后或特别具有挑战性的耦合步骤之后）。在所有情况下，将给定方案后的荧光信号与适当的阴性对照进行比较，可以测试链霉亲和素的结合是否具有特异性。

MRBLE结合肽的生物素化。
从每个代码中取出大约10％的珠子，并将它们合并在新的反应容器中（例如，在剧烈吸液后从400 µl中抽出40 µl）。
用400 µl 20％4-甲基哌啶的DMF溶液脱保护MRBLE结合的肽，以20 rpm 旋转10分钟。
通过向800 µl DMF中添加以下物质来制备脱保护溶液，并将所有溶液都添加到珠子中：
10当量生物素（39毫克）

10 eq DIC（24微升）

20 eq DIPEA（56 µl）

在室温下以20 rpm的转速旋转至少16小时。
排干液体，并用新鲜溶液重复步骤G3-G4 。
按说明解除保护（请参阅第五部分：肽侧链去保护）。

用抗生蛋白链菌素Dyli ght 650进行的结合测定
取出〜5000个珠在PBS-T（存储在DMF时彻底清洗），并用在PBS-T加入100μl5％BSA在室温下1个小时块上旋转器在20rpm 。要估计珠子的数量，请考虑稀释步骤和初始目标数量。例如，如果开始使用〜10 ，000 b 每码EADS和使用10％的每个码的对生物素化，你应该有大约48珠/μl的，并需要100微升，得到4 ，800珠。如果您在分析数据后发现磁珠数量差异很大，则可以调整实验所需的每个代码的磁珠数量。
通过在200离心珠交换缓冲XG 10秒，100链霉亲和incubat：加入2％BSA的PBS-T以1 荷兰国际集团在4 30分钟℃，在旋转的同时在20rpm 。
通过离心珠子（200 xg ，10 s），用100 µl PBS-T洗涤珠子3次，弃去上清液并加入新鲜的PBS-T。
盖玻片上的图像小珠在20 µl PBS-T中使用。有关更多详细信息，请参见图像获取部分。

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图5. 生物素化（红色）和非生物素化（灰色）肽的链霉亲和素-Dylight 650检测。对于此采集，使用SOLA LED光引擎以5 ％的强度在100 ms的曝光时间下在Cy-5荧光通道中对MRBLE成像。如先前所述（Harink 等，2019），使用MRBLE软件包对图像进行处理并且对珠子进行解码。对于每个代码，使用Python Jupyter 笔记本中编写的自定义软件，绘制每个珠子的所有Cy5强度（小标记）以及中值强度和标准偏差（大标记，误差线）。

第五部分：肽侧链去保护和内核肽洗脱，用于序列验证

珠子结合的肽库的一个关键优势是可以从珠子上洗脱肽，并通过质谱分析，以确保任何显示出降低蛋白结合力的肽都反映了真正的相互作用，而不是无法合成正确的肽。在此步骤中，我们描述了从内核洗脱肽的步骤（通过在最终的肽合成步骤中将酸不稳定的接头暴露于强酸，同时去除侧链保护基），然后通过MALDI质谱进行序列分析。

通过n酸不稳定的连接子使与MRBLE核心相连的肽脱保护并同时裂解（图6）
W¯¯ 灰分用3×DMF，3×MeOH和3每个反应容器X DCM。
将400 µl新鲜制备的试剂B（TFA易挥发）添加到U型块上的每个反应容器中。
将所有反应容器在Vortex混合器上孵育1-3小时（以1600 rpm的速度摇动15 s，暂停30 s）。
注意：时间取决于所用氨基酸和侧保护基。

使用氮气将洗脱的肽排入5 ml eppendorf 管中（切掉盖子以确保所有管都适合或使用15 ml管）（请参见图6）。在此步骤中，用珠子编号或预期的肽序列标记所有试管。
向每个容器中再添加500 µl TFA。
再次排入相同的管中。
使用可调间距的多通道移液器将所有溶液转移到96孔深孔板上，并在氮气流下使肽溶液完全蒸发（试管应完全干燥）。
用1 ml DCM洗涤保留在反应容器中3x的肽包被的珠子。
用1 ml 10％DIPEA的DMF溶液洗涤珠子2 x。
用1毫升DMF洗涤小珠4次。
如果珠子结合的肽最终将存储在水性缓冲液中，请继续用1 ml水和1 ml PBS-T 洗涤3 次。否则，珠子结合的肽可以保留在DMF中。肽- 储存在PBS-T或DMF偶联珠已经成功地用于长达一年合成之后。长期保存后，我们建议对小珠进行等分成像，以检查珠是否仍然可以解码。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1398--1902916 Jamin Hein 810651 \ Figs jpg \ Figure6.jpg

图6 。整体性脱保护肽的侧保护基并从单个管的内核中收集肽。将小珠与脱保护剂混合液孵育1至3小时（取决于氨基酸组成）。脱保护和裂解的氨基酸从所述我nner芯然后被压入使用附连到下游质谱转印头的U形座反应器单独的管（该转印头允许从每个单独的反应容器中以个体管转移）。

将珠子转移到96个深孔板中或合并以进行下游分析。在大多数情况下，我们建议在可能的情况下将珠子留在单独的容器中，以允许合成和替换所需的单个其他肽。

第六部分：质谱法检查合成肽的质量

肽的合成可能具有挑战性，并且诸如肽长度，氨基酸重复和偶联试剂的选择等因素会影响成功。另外，当肽直接在随后用于结合实验的珠子上合成时，合成肽的质量控制尤为重要，因为不可能进行色谱纯化步骤。在这里，我们描述了通过质谱分析洗脱的肽的分析。我们使用MA LDI-TOF用于肽分析，因为它具有高的灵敏度，并产生多为单带电ioniz 编肽种类，使下游识别简单（纳德勒等人，2017）。但是，也可以使用其他基于质谱的方法。

MALDI-MS质量控制
如果在第五部分：P 肽侧链去保护验证步骤中尚未干燥肽，请在氮气流下，在96深孔板中充分干燥洗脱的肽。
用冰冷的乙醚洗涤干燥的肽，以除去任何残留的侧链保护基。
向每个孔中加入1 ml乙醚。
在-20°C下孵育平板1小时。
在板兼容的离心机中以3,000 xg 和4°C 旋转30分钟。
除去乙醚，不要干扰沉淀（可能看不见）。
在氮气流下再次干燥。
将肽溶解在可溶解肽的合适溶液中。一个良好的起点是在ddH 2 O中使用70％的乙腈，尽管可能必须根据肽的溶解度进行调整。
将0.5 µl的250 mmol DHAC水溶液添加至基质板，并干燥至不再可见液态水的程度（参见图7）。
注意：Ť 他选择矩阵影响要确定的肽和需要的检测experi 精神上。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1398--1902916 Jamin Hein 810651 \ Figs jpg \ Figure7.jpg

图7. MALDI-TOF的样品制备。将肽与底膜上的基质混合，然后转移到MALDI板上。

准备乙腈中的200 µl 250 mmol THAP溶液。
CRE 吃了1：1的解决方案DHAC：THAP 。
混合1μl的Ò F中的DHAC：THAP 与封口膜将1μl溶解肽的（图7）对每个孔的溶液。
向基质板的每个孔中加入1 µl这种混合物，并使其干燥。
用MALDI-TOF分析。在这里，我们使用布鲁克Microflex 光谱仪（美国马萨诸塞州，Billerica），但该光谱仪很容易适用于其他仪器。确保高质量光谱的一些技巧包括：
始终使用肽标进行校准。
以正离子反射器模式运行仪器，激光设置为1,810V。
对于每次运行，记录100次以上扫描的平均值。
尝试使用不同的激光功率并根据需要在板上点s以获得良好的光谱。
使用SeeMS 软件或其他市售软件分析数据。
理想情况下，所得光谱应在预期分子量下显示为单个峰（图8）。MALDI电离主要通过基因对单电荷离子进行定级，从而简化了对测量光谱的解释。在固相肽合成之前添加的甘氨酸不一定是可见的，您可能会看到盐或其他杂质引起分子量的变化。为了解释更复杂的光谱，请考虑由于消除第一个或最后一个氨基酸（合成效率可能较低）而导致的可能的截短。我们推荐由加州大学戴维斯分校的菲恩实验室（https://fiehnlab.ucdavis.edu/staff/kind/Metabolomics/MS-Adduct-Calculator）发行的有用的质谱质谱加合物计算器（Huang 等，1999）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1398--1902916 Jamin Hein 810651 \ Figs jpg \ Figure8.jpg

图8.使用SeeMS 程序的MALDI-MS光谱

第七部分：MRBLE-pep结合测定

设计用于量化溶液中与珠子结合的肽和蛋白质之间的亲和力的结合测定法分3个主要步骤进行：（1）封闭（减少非特异性结合），（2）结合（测试目标蛋白质之间的特异性结合）（3）成像以鉴定每个珠子显示的肽序列并量化结合蛋白的量。MRBLE-pep仅使用100 µl体积中的4 µM蛋白质即可对48个肽与目标蛋白质之间的结合亲和力进行多重测量，因此每次测定总共需要40 µg 100 kDa 蛋白质。但是，必须仔细考虑几个参数以确保成功进行结合实验。

所述的每个码加入珠数必须在和实验之间保持恒定。凭经验，我们发现每个代码约100个磁珠可确保可用肽的浓度相对于可用蛋白的浓度足够低，同时可减少每个体积中存在的磁珠数量的随机Poisson误差引起的可变性。此外，每个测量具有100个重复，可以通过信号平均对肽之间结合的微小但统计学上显着的差异进行稳健的检测。
甲ccurate曲的结合antification要求结合的蛋白质通过成像来检测。在过去的MRBLE-pep实验中，我们使用抗体检测了表位标记的蛋白质的结合（Nguyen 等，2019）。在这里，我们描述为直接标记有荧光指示剂，蛋白质结合定量例如，YFP。通常，可以使用任何标记策略，只要包括适当的阴性对照即可消除源自非特异性相互作用的假荧光。对于使用荧光蛋白标签的结合测定，适当的阴性对照应仅包括荧光蛋白。当使用荧光标记的抗体时，结合测定应：（1）在与微珠孵育之前将目标蛋白与抗体以1：1孵育，以减少游离的标记抗体与微珠的直接结合；和（2）直接测量标记抗体的结合仅用于肽珠库。
Ť 他添加量应包括是10倍高且比预期相互作用降低的浓度范围蛋白质的ķ d 只要有可能。我们通常使用的蛋白质浓度范围约为30 nM 至2 µM。但是，这可能需要根据预期的亲和力或高浓度下蛋白质聚集的情况进行调整。
要重新获得定量的绝对和相对结合亲和力，需要在热力学平衡下测量相互作用。使用水凝胶珠会导致缓慢的缔合和解离动力学，从而有助于测量甚至很难通过其他方法检测到的微弱和短暂的相互作用。但是，准确的亲和力测量需要初步实验以确保反应达到平衡。这可以通过首先监视作为时间函数的蛋白质缔合和解离速率，然后在所有下游实验中使用这些孵育时间来实现。

以YFP标记的钙调磷酸酶磷酸酶为例，结合测定蛋白-肽亲和力
注意：如（Nguyen et al。，2019 ）中所述，从大肠杆菌表达并纯化了C型神经尿素-YFP 。

对于每个实验，每个代码使用〜100个珠子。在此处描述的方案中，这相当于每个代码中〜1％的珠子（例如，如果将1个代码的珠子重悬于1 ml缓冲液中，则在充分混合后吸取10 µl珠子）。在典型的测定中，这意味着需要对〜4,800个珠子进行测量，以48个编码的总体积为20 µl。
旋转小珠，除去PBS-T，并通过与PBS-T中的100 µl 5％BSA在室温下以20 rpm 旋转孵育1 h 来阻止过量的非特异性结合。
通过将珠子（200 xg ，10 s）离心，用100 µl PBS-T洗涤珠子一次，弃去上清液并加入新鲜的PBS-T。
使用100 µl 含蛋白质的缓冲缓冲液，并在除去PBS-T后加至微珠中。
测量稀释系列时，请确保每种蛋白质在最终结合测定中所有成分的最终浓度保持恒定。在拥挤剂（浓度差异例如，甘油）可以改变扩散动力学; 同样，盐浓度的差异会改变蛋白质与肽之间的静电相互作用。请注意考虑缓冲液中溶解了纯化的蛋白质和/或抗体的所有成分。
在4 °C下以20 rpm 旋转的同时，将指示浓度的蛋白质与指示浓度的蛋白质一起孵育6小时（达到平衡所需的时间，因为每种蛋白质会有所不同，因此需要实验确定）。
如果蛋白质的检测是使用间接标记，进行即，荧光标记的抗体，抗体和蛋白质必须预温育，然后添加到珠子上。例如，将1 µmol 蛋白与1 µmol抗体在4 ℃下 1个小时。请注意，此处未执行此步骤，因为使用了YFP标签的蛋白。
离心珠子（200 xg ，10 s），用100 µl结合缓冲液洗涤珠子1次，弃去上清液并加入新鲜的PBS-T。
将珠重悬于20 µl PBS-T中。

图像采集和数据分析
将样品（20 µl）转移到显微镜石英载玻片上，并盖上石英盖玻片，而不会滞留空气。为此，请使用注射器和针头小心地注油以密封一侧，万一截留了空气，请从另一侧缓慢加入几微升PBS-T。气泡消失后，用油密封。
使用自定义图像珠BUIL 吨倒置显微镜尼康TE2000以允许UV激发使用氙弧灯，二十七分之二百九十二Ñ 米带通滤波器和一个液体光导从顶部照射珠，如以下更详细先前描述（杰弗等等人，2012； Nguyen 等人，2016； Ha rink 等人，2019）。但是，任何具有深紫外线激发力并能够为每个镧系元素通道收集光的显微镜都可以使用。对于镧系元素发射，我们目前使用以下滤光片：435 nm（40 nm带通），473 nm（10 nm带通），536 nm（40 nm带通），546 nm（40 nm带通），572 nm（15 nm带通），620 nm（14 nm带通），630 nm（92 nm带通），650 nm（13 nm带通）和780 nm（25 nm带通）。
使用microManager 和多维采集来拍摄多个图像，以覆盖所有镧系元素通道和曝光时间，明场和化验通道上的珠子的整个区域。在这里，我们使用了一个YFP过滤器立方体（Semrock ，罗切斯特（Rochester））来检测带有YFP标签的钙调神经磷酸酶和一个Cy5过滤器立方体（Semrock ，罗切斯特（Rochester））来检测Dylight 650标记的链霉亲和素。
使用可在Github上下载的Python代码分析图像（Harink 等，2019）。将图像加载到软件分析包中，然后进行处理以解码珠子，并获得每个珠子和每个代码的荧光强度。所述ë Xcel公司表被保存并用于进一步的处理和与Python（图9）绘制的数据。
我们使用Python绘制了指示肽的平均背景扣除荧光强度，并拟合了Langmuir等温线（图10）。
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图9 。MRBLE-pep文库的测得的与珠相关的YFP荧光强度，该文库由16种不同的肽组成，每种肽在3种不同的密码上一式三份合成。A.小标记表示WT钙调神经磷酸酶-YFP（红色），缺乏肽结合的钙调神经磷酸酶突变体（NIR，阴性对照＃1，浅灰色）和仅YFP（阴性对照＃2，黑色）的每珠YFP信号。大的标记和误差线表示每种蛋白质的平均值的中值强度+/-标准误差。B.中值减去背景的钙调神经磷酸酶-YFP 强度（通过从WT信号中减去钙调神经磷酸酶NIR -YFP 结合缺陷信号来计算）。

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图10 。浓度依赖性结合测量和Langmuir等温线拟合钙调神经磷酸酶-YFP与16序列MRBLE-pep文库中的2个肽的结合，如图9所示。显示了所有珠子的中值背景扣除荧光强度，其中每个代码均显示给定的肽序列。如浅红色的点；相关线条显示了用于提取结合亲和力的Langmuir等温线拟合。暗红色的点和线表示在所有3个代码中测得的中值磁珠强度，并且相关的Langmuir等温线适合于这些中值。左图显示了已知钙调神经磷酸酶底物的曲线（PRIIIT，K d = 1.67 +/- 0.86 µM，通过使用全局拟合计算得出的每个代码的返回值的平均+/-标准偏差）。右图显示了阴性对照肽的曲线。

笔记

我们使用48 x 2 ml反应容器和U-Block反应器设备，这些设备与用于高通量肽合成的Syro II肽合成仪直接兼容。但是，该协议可以适用于任何反应容器和安装板。反应容器是带有过滤器的简单柱。U形块固定反应容器，每个容器固定器的底部连接到可清洗容器的管道上。可以通过施加真空或使用惰性气体板将液体推过容器来清洗容器。

菜谱

CNA结合缓冲液
50 mM Tris pH = 7.5

150毫米氯化钠

20％的0.1％

PBS-T
含0.1％吐温20的PBS

试剂B
88％TFA

5％苯酚（如果存在半胱氨酸）

5％ddH 2 O

2％TIPS

致谢

这项工作由NIGMS资助DP2GM123641和R01GM107132资助。JBH由Novo Nordisk Foundation和Stanford Bio-X计划的NNF17OC0025404资助。PMF非常感谢Bio-X种子基金，Alfred P. Sloan基金会的奖学金，并是Chan Zuckerberg Biohub 研究人员。我们感谢Jagoree 罗伊，亚当白色和银年丰与蛋白质和珠生产的帮助。我们感谢冯年年对原稿的认真阅读。

该协议改编自Nguyen 等人以前的工作。（2017 和2019）。

竞争利益

这里描述的工作与美国专利申请61 / 692,618有关，在该专利中PMF被列为共同发明人。

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