材料和试剂

一次性纸巾
小鼠：8-12周大的C57BL / 6J和/或CD1小鼠（法国查尔斯河或提供实验室小鼠的任何公司）
水
70％乙醇

设备

NOR迷宫（请参见图1）
我们在实验室中设计并建造了这种迷宫，用来建造迷宫的材料是黑色或深灰色的亚光有机玻璃。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902471--1424 Giovanni Marsicano 652762 \ Figs jpg \ Fig1.jpg

图1.评估NOR记忆的迷宫尺寸以厘米为单位。

两对对象（有关对象的信息，请参见下文）
Ť HESE对对象都必须在小鼠中（见步骤）首先被验证，以保证没有内在的偏好或厌恶。

可调光实验室（30-50 lux）
实时视频采集系统
休闲秒表或任何计算机应用程序来计算探索时间

软件

任何视频采集Softwar Ë
行为评分面板- （c）2008年，A。DUBREUCQ版本3.0 beta。这是一种家用软件，可以让我们计算探索时间。
注意：如果可能并为了避免造成任何混淆因素，建议不要将实验人员放在鼠标正在执行任务的同一个房间中。

程序

习性会议
执行此步骤以使小鼠熟悉迷宫。习惯化过程持续9分钟。

打开视频记录系统并设置用于数据采集的参数：确保在整个会话过程中（迷宫，训练等）在迷宫（感兴趣的区域，用于鼠标检测的对比度等）和房间中始终存在恒定的均匀闪电条件。和测试会话）。
在起点处（两臂之间的交叉点，图1）将动物放在没有任何物体的迷宫中。
在会议结束时，将动物从迷宫中移出并放回笼中。
然后，用70％的乙醇清洁迷宫和物体，然后移至下一只动物（返回步骤A2）。
注意：为了避免以前的老鼠发出的气味提示改变老鼠的探索，每次使用70％乙醇溶液仔细清洁迷宫和物体的表面至关重要。

培训课程
习惯性训练后24小时进行训练，持续9分钟。

打开视频记录和数据采集系统。
将两个相同的物体放置在迷宫的末端，与墙壁直接接触（见图1 和2 ）。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902471--1424 Giovanni Marsicano 652762 \ Figs jpg \ Fig 2-word.jpg

2.图计划目标识别协议。有三种不同的会话（习惯化，训练和测试），并且每个会话持续9分钟短期或长期记忆可以评估取决于会话间间隔培训和之间测试会话。

将动物放在面向两只手臂边缘的起点（两只手臂之间的交叉点）上。
使用此秒表记录鼠标花费在探索每个物体上的时间（见下文）。在此期间，啮齿动物通常花费每个物体探索总时间的50％左右。
在训练结束时，将鼠标从迷宫中移开，并将其放在笼子中不受干扰。
按照迷宫的“习惯性练习”中的说明清洁迷宫后，开始对以下动物进行训练。

药理治疗

药理学治疗可用于研究NOR的不同记忆阶段所涉及的细胞和分子机制，例如，为了测试特定药理学治疗对记忆获得的影响（图2 ），必须在训练之前使用该药物。必须考虑到该物质的药代动力学来调整给药时间。此外，重要的是要验证该药物是否具有运动作用，因为它可能独立于记忆力而影响工作结果（例如运动能力受损）为了研究药物治疗对记忆巩固的影响，应在训练后服用该药物，最后评估记忆的巩固，将老鼠重新置于相同的训练条件下（9分钟内对象的相同组合）24 在第一个训练课后h，可以在第二个训练课之前或之后给药。

测试阶段
该测试课程可以在训练后3小时进行以评估短期记忆，或在训练后24小时进行以评估长期记忆。该训练持续9分钟。

打开视频记录和数据采集系统。
清洁迷宫。
放置一个熟悉的物体在最后的一个臂和新物体在最后的另一个臂。位置的新物体（即，右Vs的。左臂）必须来平衡在小鼠之间，以避免任何可能的混杂提示在房间中导致偏爱迷宫的一只手臂。
如上所述，将动物放在起点上。
与之前的会议（栖息地和训练会议）一样，观察是通过连接到记录系统的闭路摄像机完成的，以避免对动物造成不必要的压力或不受控制的提示（参见视频1 ）。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902471--1424 Giovanni Marsicano 652762 \ video 1.jpg

V IDEO 1. 代表的视频显示对象的探索迷宫的双臂

使用两个秒表并分配每个秒表来记录每个对象的探索时间，实验人员在不了解实验条件的情况下，测量每个对象的探索时间，以分析闭路摄像机获得的图像。记录目的以及一般活动的视频跟踪（每条手臂所花费的时间，每条手臂中的项数和行进距离）。
测试结束后，将动物从迷宫中移出并放回笼中。用水清洗迷宫后，从另一只动物开始（返回步骤C3）。
会议结束后，导出实验数据并分析结果（请参阅数据分析）。

注意：如果在训练和/或测试期间的总探索时间非常短（<5-10 s），则不考虑将这些小鼠的结果用于实验，这可能是由于：

该物体不足以完成任务（即可能会给动物带来压力或焦虑）。验证该物体是否已正确清洁，因为它可能含有先前动物的气味，并重新评估该物体以了解是否存在内在偏好或厌恶。
该动物不探索迷宫，因为运动赤字或不探索迷宫由于药物治疗和/或遗传manipulation.If有任务的执行过程中明确的运动变化，从排除动物分析。

数据分析

物体探索的量化
在培训和测试期间，实验者不愿对实验设计进行评分，而对探索性时间进行手动评分。由于自动系统目前难以准确区分尾巴和头部并正确计算探索时间，因此首选手动评分。认识到基于深度学习的姿态估计方法（Mathis 等，2018 ; Nath 等，2019）可能会提供一种可靠的方式来在不久的将来自动实现勘探量化。

在以下情况下对物体进行探伤：动物的鼻子正对着物体（< （2 Cm）如Robin所描述。Et Al ，2018 ; Oliveira Da Cruz。Et Al ，2019）。当物体：动物不探伤不会与对象互动，或者它位于对象顶部而没有面向对象。

注意：如果在整个会话过程中动物没有与两个对象至少互动一次，则该会话无效。

对象探索分析
当比较两个或两个以上实验组时，为了评估此探索过程中的差异，可以进行2种类型的一般分析：1）辨别指数（DI）； 2）熟悉的Vs 。。另外，进行了全面的探索还表示了时间，以控制实验组之间总体勘探的可变性.DI的计算公式如下：

DI = [ 时间新颖- 时间熟悉）] / [（时间熟悉）+ （时间新颖）]

可以测量其他变量：每个手臂花费的时间，每个手臂中的项数和行进距离。 ±。SEM 双向小号Tudent'S 牛逼- 测试。和单向ANOVA统计分析是统计测试中使用这些实验的比较差异有统计学意义时，显着性水平低于0.05。

预期成绩
在此协议中报告的实验条件下，在典型的训练过程中，每个对象的一般探索时间约为15-40 s。如果小鼠区分熟悉对象和新颖对象，则测试过程中的探索时间为对于熟悉的物体大约10-35 s，对于新物体大约30-60 s （图3和表1）。如果识别记忆力受损，如我们在注射四氢大麻酚（THC）的小鼠中所述（Puighermanal et al。（2009年），小鼠将在测试期间（20-40 s）探索相同时间的新颖物体和熟悉物体，因此它们不会区分它们（图3和表1）。

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图3的NOR任务一个例子的代表性曲线图。进一步的细节在表1 。

版权所有©20 20 的作者;专用特许生物协议LLC 1

说明：logonew

1，一种实施例的表的预期数据和分析。ř 具有代表性的例子的Ñ 实验使用作为一个方便失忆剂量Delta9四氢大麻酚（THC，10毫克/千克，叶，光色）在CD1和C57BL / 6J小鼠，或其载体（VEH ，暗颜色的探索时间在训练会话（F'）在第二对象上;）作为对照，训练session.The勘探时间（秒）在熟悉的物体（F）之后施用勘探在新对象中的时间（N）；总探索时间（ET = F + F'或ET = F + N）；在训练和测试过程中分配给每个对象的探索时间的百分比（％ET =（ F / ET] x 10 0；％ET = [F'/ ET] x 100；％ET = [N / ET] x 100）；在测试阶段计算歧视指数（DI = [N – F] / [N + F]）。

CD1小鼠

C57BL / 6J

训练

测试

训练

测试

老鼠

F

F'

ET

F

ñ

ET

DI

老鼠

F

F'

ET

F

ñ

ET

DI

1个

42

45

87

35

67

102

0 。31

1个

55

45

100

18岁

49

67

0 。46

2

54

36

90

19

41

60

0 。37

2

27

二十三

五十

二十二

70

92

0 。52

3

39

34

73

12

39

51

0 。53

3

16

18岁

34

12

43

55

0 。56

四个

40

36

76

18岁

52

70

0 。49

四个

二十一

二十四

45

13

40

53

0 。51

五

53

58

111

26

45

71

0 。27

五

二十五

二十四

49

15

47

62

0 。52

6

43

49

92

19

72

91

0 。58

6

29

33

62

二十一

64

85

0 。51

7

61

56

117

十

47

57

0 。65

7

44

42

86

17

37

54

0 。37

意思

47 。4

44 。9

92 。3

19 。9

51 。9

71 。8

0 。46

意思

31

29 。8

60 。8

16 。9

五十

66 。9

0 。49

％ET

51 。4

48 。6

--

27 。7

72 。3

--

--

％ET

51

49

--

25 。2

74 。8

--

--

老鼠

F

F'

ET

F

ñ

ET

DI

老鼠

F

F'

ET

F

ñ

ET

DI

1个

37

32

69

二十五

32

57

0 。12

1个

28

32

60

27

39

66

0 。18

2

39

46

85

二十二

33

55

0 。2

2

34

28

62

26

二十二

48

-0 。10

3

30

38

68

27

二十四

51

-0 。06

3

29

45

74

33

34

67

0 。01

四个

51

52

103

54

59

113

0 。04

四个

35

28

63

二十一

二十三

44

0 。04

五

49

五十

99

37

45

82

0 。1

五

39

46

85

26

31

57

0 。09

6

57

42

99

19

16

35

-0 。09

6

45

51

96

29

31

60

0 。03

7

43

51

94

12

14

26

0 。08

7

29

38

67

41

38

79

-0 。04

意思

43 。7

44 。4

88 。1

28

31 。9

59 。9

0 。06

意思

34 。1

38 。3

72 。4

29

31 。1

60 。1

0 。03

％ET

49 。6

50 。4

--

46 。8

53 。2

--

--

％ET

47 。1

52 。9

--

48 。3

51 。7

--

--

版权所有©20 20 的作者;专用特许生物协议LLC 1

说明：logonew

笔记

在设定行为任务的实验室中放置至少5天的小鼠。通常在锯末环境中将动物集体饲养（每笼3-6只动物），并用嵌套材料（棉立方），水/自由进食和控制温度（21±1℃）和湿度（55±10％）照明是在12小时黑暗/光照MAINTAINED：循环（上。在7 ：00 一个。米。和关闭7 ：00 在p ，中号。）和实验发生在开始的光照阶段（通常为9 ：00 一。中号。-2 ：00 的P- 。中号。）首页笼不应该改变，和动物不应该受到干扰时。住房设施应位于测试室附近，因为压力和运输的新颖性可能会改变勘探的方向。
选择合适的对象是此任务中必不可少的步骤，至少需要两对不同的对象，在选择对象时应仔细考虑诸如纹理（石头，木材，塑料，金属）（图4），颜色色调和形状等特征。要在这项任务中使用，重要的是要验证动物在训练过程中与每个对象互动所花费的时间是否相近。应避免对对象的任何偏爱或厌恶，因为这可能代表解释的重要偏见。为了避免这种可能的偏差，必须对动物同时进行两个对象的初步实验，并分析每个对象的探索时间，探索每个对象的时间应相似（约占总探索时间的50％首次向老鼠展示两个物体时，每个物体的探索时间会受到形状和物理特性的影响但是，对象之间的差异必须足够大（颜色色调，纹理，形状），以便于在测试过程中区分两个对象。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902471--1424 Giovanni Marsicano 652762 \ Figs jpg \ Fig 4.jpg

4.图对象使用在我们的NOR范式。在此图像中，你可以找到不同的例子对象使用在我们的NOR范式。你可以看到，不同的颜色，形状和材料都可以使用。

避免气味提示很重要，因此必须清洁动物之间，尤其是使用不同实验条件的实验之间的迷宫和物体。
对照动物可能不会表现出对新对象的适当区分。这可能是由于对一个对象的特定偏爱，也可能是由于训练和测试之间的不同，不受控制的条件（例如动物）引起的。在训练和测试之间的期间被动物看护者打扰了）或其他小鼠留下的嗅觉提示，并且在动物和/或训练之间没有很好地清洁它们。
极少数情况下，鼠标会跳出迷宫。为防止这些情况，可在迷宫上方放置透明的塑料盖。

致谢

我们感谢德尔菲娜·冈萨雷斯，纳塔莉Aubailly ，和所有的p 的的动物设施的ersonnel NeuroCentre 马让迪鼠标护理以及距离Parc de人员Recerca 生物医药巴塞罗那（PRBB）。我们也想感谢的人谁已经使用该task.This工作进行的实验工作是支持的INSERM（通用汽车），EU-FP7（FP7-PEOPLE-2013-IEF-623638到AB-G。），法国国家/ 法新社国立德拉RECHERCHE（ANR- 10-IDEX-03-02（AB-G），以及MINECO从AEI（RYC-2017-21776）到AB-G。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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