材料和试剂

盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-546）
玻璃培养皿（Corning，目录号：3160100）
Kimwipe（金伯利-克拉克（Kimberly-Clark），目录号：06-666）
对- 叠氮基苯甲酰溴（APB）（Sigma-Aldrich ，目录号：57018-46-9 ，s 残留量：4 °C或（Fisher Scientific，目录号：50-520-767）
二甲基甲酰胺（DMF）（EMD密理博公司，目录号：DX1730-6）
Tris基地（Fisher Scientific，目录号：77-86-1）
冰醋酸（Mallinckrodt Baker，Inc.，目录号：UN 2789）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-3）
氢氧化钠（NaOH）（Mallinckrodt Baker，Inc.，目录号：7708-10）
盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
氯化镁（MgCl 2 ）（Spectrum Chemical，目录号：M1035）
甘油（Fisher Scientific，目录号BP-229-4）
乙酸钠（NaOAc ）（Fisher Scientific，目录号：S210-500）
乙酸钾（KOAc ）（EM Science Industries，目录号：PX1330-1）
醋酸镁（MgOAc ）（Sigma-Aldrich，目录号：M-0631）
醋酸铵（NH 4 OAc）（Mallinckrodt Baker，Inc.，目录号：0596-01）
牛血清白蛋白（BSA）（Fisher Scientific，目录号：BP1600-100）
二硫代糖醇（DTT）（Fisher Scientific，目录号：BP172-5）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：151-2-3）
鲑鱼精子DNA（Invitrogen，货号：15632-011，储存温度：-20 °C ）
乙醇（Fisher Scientific，目录号：A962-4）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich ，目录号：P4832）
橙色G染料（EMD Millipore Corporation ，目录号312-12）
Sso MCM蛋白
Sso MCM蛋白按先前的描述进行纯化（McGeoch 等，2005; Graham 等，2011）。任何具有合适的半胱氨酸残基的DNA结合蛋白均可用于该方法，如果该半胱氨酸残基为溶剂，将有帮助如果没有单个半胱氨酸，则可以使用定点诱变在合适的位置添加一个半胱氨酸进行测试。

荧光（5 ' 或3 ' ）标记的（Cy3或Cy5）DNA（购自IDT（爱荷华州科勒维尔）或Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯））（综合量表– 0.025 微摩尔，纯化：脱盐，形式：干燥）。
注意：可以根据DNA的纯度进行PAGE纯化。

3'长臂叉底物的DNA序列
一个。DNA 165-3（5 ' 的Cy3）

5 ' 3 TCCCACCCAACCCGACCGGCATCTAGTCTGGTAGCGTGAGCGAACGGACC

湾DNA 171

5 ' CTAACTGCGCCGGTCGGGTTGGGTGGGA

1X复杂缓冲液（CB）（见ř ecipes）
退火缓冲液（见ř ecipes）
辐照缓冲液柱（请参阅R Ecipes）
甘油加载缓冲液（请参见食谱）
20％本机PAGE （请参阅食谱）

设备

P ipettes
-80°C冷冻室
台式3UV透照仪（UVP，型号：L MS-20E，目录号：P / N 95-0220-01 ）。
台风FLA 9000成像仪（GE Healthsciences ）
PCR仪器（BioRad 实验室（加利福尼亚州赫尔克里士）
台式微量离心机（Eppendorf ，型号：5424R）
用于微型预制凝胶的PROTEAN Tetra-Mini垂直电泳池（Bio - Rad L Aboratories）
LightSafe 微量离心管（Sigma-Aldrich ，目录号：Z688312）
暗室（推荐）

软件

Image Quant（v.5.0）（GE Healthsciences ，（宾夕法尼亚州匹兹堡）。）

程序

用APB标记Sso MCM 蛋白
在黑暗中，将APB溶解在100％DMF中，浓度为40 mM。
笔记：

a。可以通过使用LightSafe 微型离心管，用箔覆盖Eppendorf管或关闭灯来提供黑暗条件。

制备APB溶液时，请使用LightSafe 微量离心管。
在随后的反应中，请使用覆盖在箔纸中的透明微型离心管，以轻松观察沉淀和/或完全丢弃上清液。
b。在测量APB时，可以在黑暗条件下测量约2 mg的量。

C. 为每个新实验使用新近重悬的APB，并丢弃未使用的APB。

在20 mM Tris pH 7.5、75 mM NaCl，10％甘油和10％DMF中将APB稀释至4 mM。
将稀释的APB加到含有单个还原半胱氨酸的蛋白质（〜10μM单体）样品中（在20 mM M Tris [pH 7.5]，75 mM NaCl，10 ％甘油中），最终浓度为0.4 mM APB和1％DMF。
注意：在与APB结合之前必须还原半胱氨酸，然后进行凝胶过滤或渗析以去除还原剂。可以轻松使用三（2- 羧乙基）膦（TCEP），而无需随后去除。

在室温下贴标签2-3小时。

准备硅烷化的盖玻片
用蒸馏水将聚L-赖氨酸溶液稀释为1:10。
联合广场Verslips（〜15）在一个P ETRI菜。
将溶液（约20 ml）倒在盖玻片上（确保盖玻片下沉）。
将其在溶液中放置15-30分钟。
在室温（RT）下用水冲洗盖玻片三次。
晾干盖玻片，将Kimwipe 放在P Etri盘顶部（避免触摸盖玻片）。
盖玻片可以提前准备，可以在室温下保存数周。

准备退火的叉子DNA
储备溶液准备（100 Myu M ）水中的每个互补DNA链（DNA 165-3 和DNA 171）。
混合DNA在水中或退火缓冲液中的浓度等于1：1（5 Myu M ）。
注意：退火缓冲液中的EDTA（螯合二价金属离子）和盐有助于双链体的稳定性，但是水中DNA的退火也可以形成完整的双链体。

在PCR仪中以95 °C 加热5分钟，然后以1 °C / min 的速度冷却至室温。

制备交联的蛋白质-DNA复合物
将APB标记的Sso MCM与荧光（Cy3）叉子DNA（150 nM ）在1x CB缓冲液中以50 µl体积孵育10-20分钟（保持化学计量〜1：1 MCM 6 ：DNA 比率）。
注意：此处使用了荧光标记的DNA，但也可以使用32 P标记的DNA。

将样品转移到硅烷化的盖玻片中，用移液管吸取50 µl样品到盖玻片的中间。
紫外线照射15 s（302 nm UV-B）。
将样品转移到Eppendorf管中。
加入150 µl辐照后缓冲液。
在室温下涡旋并在70°C下放置20分钟。

分离交联的蛋白质-DNA复合物
接下来，加入1 µl 10 mg / ml鲑鱼精子DNA，30 µl 3.0 M NaOAc ，750 µl冰冷的100％乙醇，涡旋振荡，然后在-80°C的冰上放置1-2 h。
在微量离心机中于4°C，16,000 x g 旋转样品30分钟。
弃去上清液，用冰冷的70 ％乙醇洗涤沉淀两次。
注意：在大多数步骤中，DNA沉淀是不可见的，将其完全丢弃并重悬在随后的缓冲液中。

在微量离心机中于4°C，16,000 xg离心30分钟以旋转样品。
除去乙醇，在工作台上翻转1小时，风干沉淀。
通过涡旋将沉淀重悬于100 µl：20 mM NH 4 OAc，2％SDS，0.1 mM EDTA pH 8.0中。
降速的样品中微量离心在室温下，16000 ×g下FO -R 10分钟。
将印迹转移到新的试管中，并置于90°C的加热块中2分钟。
然后，加入1 µl 2 M NaOH，短暂涡旋，并在90°C下孵育20分钟。
温育后，将样品脉冲旋转，加入101 µl 20 mM Tris-HCl pH 8.0、1 µl 2 M HCl，1 µl 2 M MgCl 2 、、 480 µl 100％乙醇，涡旋，并于-80°C放置1-2小时
将样品在微量离心机中于4°C以16,000 xg沉淀30分钟，用冰冷的70 ％乙醇洗涤两次，然后在工作台上风干1 h。
用5 µl 40 ％含橙色G染料的甘油上样缓冲液重悬DNA沉淀，以进行凝胶上样。
以恒定的30 mA 在1 x TBE（Tris碱，硼酸，EDTA）中的20％TBE- PAGE（天然PAGE）上电泳样品45分钟，然后在Typhoon FLA 9000成像仪（GE Healthsciences ）上观察。

数据分析

通过ImageQuant 软件对凝胶上DNA条带的密度进行定量（图2A）。
足迹百分比的计算（图2B ）是通过量化标记链的相对密度（减去背景）进行的，根据以下公式在ssDNA臂的中点进行划分：

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1903051--1418 Michael Trakselis 856305 \ Figs jpg \ Figure2 .jpg

2图。SSO MCM取向映射到3 “ - （DNA171 / 165-3）长臂叉DNA底物A. APB取向映射的3 ” -Encircled链标记在5 “ 双工结束用Cy3上的3 ” -长臂叉DNA底物具有20个碱基的双链体.Sso MCM在C682处特别用APB标记.B。从5' 端对20-35或36-50碱基的DNA切割相对量的定量表明相对方向分别将N双链（橙色）或C双链（蓝色）放置在更靠近双链结的位置.DNA标记（M）表示18、50个碱基和叉子DNA 。误差线代表3-5个独立实验的标准误差。值是-p定义为* <0.05，** <0.01 *** < 0.001。Ns。不重要。

使用标准两尾相等方差学生的T检验确定C Atto双工与N Atto双工的显着差异。每种实验条件均报告P 值。数据分析的详细说明可以在原始研究论文图中找到1C和1F，2B和2D，3C和2E （Perera和Trakselis，2019）。

笔记

对照实验是在没有紫外线的情况下用APB-MCM-DNA进行的，和/或在没有紫外线和APB 的情况下用单独的DNA进行的。在被紫外线激活后，APB与DNA碱基的连接通常是非特异性的，然而，即使在没有直接紫外线的情况下，我们也检测到了明显的交联和随后的ssDNA裂解。
类似地，1-（对- Bromoacetamidobenzyl ）乙二胺-N，N ，N（FeBABE）（同仁化学中心，Rockville，马里兰）也可以使用的取向作图研究（图1B和1E中佩雷拉和Trakselis ，2019 ）。FeBABE 利用利用FeBABE （Ishihama，2000）的优点是快速反应产生高产率，温和的蛋白质结合和裂解反应条件，非序列特异性DNA裂解是快速的反应（Ishihama，2000）。

菜谱

1个CB（复杂缓冲区）
20毫米TrisOAc

25毫米KOAc

10毫米氧化镁

0.1 mg / ml BSA

1毫米DTT

退火缓冲
10 mM Tris pH 7.5

50毫米氯化钠

1毫米EDTA

照射后缓冲液
20毫米Tris-HCl pH 8.0

0.1 ％SDS

50毫米氯化钠

甘油加载缓冲液
40％甘油

10 mM EDTA（pH 8.0）

7.5 ％橙色G染料

20％原生PAGE
1 x TBE

20％丙烯酰胺

0.05 ％的APS

4 Myu L TEMED

致谢

这项工作得到了美国国家科学基金会分子与细胞生物科学部门的支持[MAT的NSF1613534]并得到了贝勒大学的支持，我们感谢Gregory Bowman向我们介绍了该技术用于定向作图的可行性（Nodelman et al。，2017）。。

利益争夺

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

参考文献

Graham，BW，Schauer，GD ，Leuba ，SH和Trakselis ，M.A ..（2011）。在MCM解旋酶解链核酸过程中，沿着离散的外部结合途径发生的立体排斥和包裹的DNA链分离沿着核酸Res 39：6585-6595 。
Ishihama ，A。（2000）。使用具有核酸酶和蛋白酶活性的蛋白质缀合的金属探针对RNA聚合酶的分子解剖学， Chem Commun 13：1091-1094。
Kassabov ，SR和缪，B.（2004）。对于核小体动力学的分析位点定向组蛋白DNA接触映射。方法酶学375：193-210。
McGeoch ，AT，Trakselis ，MA ，Laskey ，RA和Bell ，S. d 。（2005）组织的古菌MCM复杂的DNA和意义的解旋机制。纳特结构分子生物学12：756-762。
Nodelman ，IM，Bleichert ，F。，帕特尔，A.，仁，R.，Horvath的，KC，伯杰，JM和鲍曼，GD（2017）横跨核小体DNA环流。在染色质CHD1的改造商通信.Interdomain分子。单元格65（3）：447-459 e446。
欧文斯，JT，三宅，R. ，村上，K. ，Chmura，AJ ，藤田，N. ，Ishihama ，A 。和Meares的，CF（1998）.Mapping 所述σ 70 亚基接触部位上的大肠杆菌RNA聚合酶与σ 70 偶联的化学蛋白酶。PNAS 95（11）：6021-6026。
Pendergrast ，PS，Chen，Y.，Ebright ，YW和Ebright ，RH（1992）。通过光交联法测定蛋白质-DNA复合物中DNA结合基序的方向。Proc Natl Acad Sci USA 89（21）：10287- 10291。
Perera ，HM和Trakselis，MA（2019）。在叉子DNA上的多个结合方向中，Saccharolobus MCM解旋酶以N-先进行解链.Elife 8：e46096。