材料和试剂

SnakeSkin 透析管，10K MWCO，22毫米（Thermo Scientific，目录号：68100）
Amicon Ultra-15离心过滤器（Millipore Sigma，目录号：UFC900308）
GST酵母CTD细菌表达载体（亚克隆于Mayfield 等人，2019 ，或类似的结果）
BL21（DE3）感受态细胞（Thermo Scientific，目录号：EC0114）
酵母ë XTRACT（Sigma-Aldrich公司，目录号：Y1625）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
Bacto t ryptone（Gibco，目录号：211699）
细菌培养用一个噶尔（FIS 她的科学，目录号：DF0140010）
卡那霉素单硫酸盐（GoldBio ，目录号：K1205）
IPTG（GoldBio ，目录号：367931）
Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP1525）
盐酸（Fisher Chemical，目录号：A144SI212）
氢氧化钠（Fisher Chemical，目录号：S3201）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
甘油（Fis 她的化学药品，目录号：G334）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：56750）
β - 巯基乙醇（ACROS 有机物，目录号：125472500）
Pierce Coomassie Plus（Bradford）分析试剂（Thermo Scientific，目录号：23238）
Ni-NTA His Bind Resin（EMD密理博，目录号：70666）
六水合氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号M9272）
腺苷5'三磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A26209）
活性Cdk9 / Cyclin T1蛋白（Millipore，目录号：14-685）
活性Cdk7 / Cyclin H / MAT1（CAK复合物）（Millipore，目录号：14476）
c- Abl 激酶（ProQinase ，目录号：0992-0000-1）
pET-28载体（Novagen ，目录号698643）
十二烷基硫酸钠（SDS）（OmniPur ，目录号：7910）
溴酚蓝（Sigma - Aldrich，目录号：B55255G）
30％丙烯酰胺/双解溶液37.5：1（Bio - R ad，目录号：1610158）
过硫酸铵（APS）（Fis 她的Scientific，Research Products International Corp，目录号：A2050010.0）
N，N，N'，N'-四氢甲基乙二胺TEMED（Fis her Scientific，目录号：BP15020）
甘氨酸（适应她的科学，目录号：BP381-5）
PageRuler 加上预染蛋白质梯，10至250 kDa的物（Thermo Scientific，目录号26619），或等同的预染色的蛋白质梯
艳蓝R250（Sigma，目录号：B0149）
乙醇，乙醇200证明（Pharmaco ，目录号：111000200）
冰醋酸（Fis her Chemical，目录号：A38C212）
LB中（1 L）（请参阅食谱）
1,000x卡那霉素原液（50 mg / ml）（请参阅食谱）
1,000x IPTG库存（400 mM）（请参阅食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）
清洗缓冲液（请参阅配方）
洗脱缓冲液（请参见配方）
透析缓冲液（请参见配方）
4x激酶缓冲液（请参阅食谱）
4倍ATP（5毫升）（请参阅食谱）
4x GST- 酵母CTD底物（请参阅食谱）
4x P- TEFb 激酶溶液（请参阅食谱）
4x TFIIH激酶溶液（请参阅食谱）
4x c- Abl 激酶溶液（请参阅食谱）
1 M Tris-HCl pH 6.8（500 ml）（请参阅食谱）
1.5 M Tris-HCl pH 8.8（500 ml）（请参阅食谱）
10％SDS（100 ml）（请参阅食谱）
2 倍Laemmli的样本缓冲区（请参阅食谱）
分离半天然PAGE / SDS- PAGE凝胶（10％丙烯酰胺； 5 ml – 足够用于1凝胶，必要时可缩放）（请参见食谱）
叠加式半天然PAGE / SD S-PAGE凝胶（5％丙烯酰胺，2 ml – 足以用于1凝胶，必要时可缩放）（请参见食谱）
1个Laemmli 运行缓冲液（Tris-甘氨酸）（1 L）（请参阅食谱）
1个本机Laemmli 运行缓冲液（Tris-甘氨酸）（1 L）（请参阅食谱）
考马斯亮蓝色染料（100毫升）（请参阅食谱）
脱色（请参阅食谱）

设备

1升烧瓶
移液器
-80°C冷冻室
细菌培养箱（Thermo Fisher，目录号：SHKE435HP）足以容纳1 L培养体积
可见分光光度计-紫外线（SmartSpec Plus分光光度计（Bio -R Ad，目录号：170-2525或等效产品）
带有适用于1 L和50 ml离心容器的合适转子的高速落地离心机（Thermo Scientific，型号：Sorvall RC 6+，或同等产品）
超声波仪为细菌裂解（Q500 超声波仪）（Qsonica ，目录号：Q500-110，或等同物）
经济柱色谱柱2.5 x 10厘米（Bio - Rad ，目录号：7374251）
FPLC系统的自动级分收集器和UV280监控功能（生物- Rad公司，NGC系统，或等同物）
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg （GE Lifesciences，目录号：28989335或同等产品）
Nano D Rop 一微体积紫外可见分光光度计（Thermo Scientific，目录号：ND.-ONE-W或等效产品）
Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳池（Bio - Rad ，目录号1658004）
Mini-PROTEAN Tetra细胞浇铸支架和夹具（Bio - Rad ，目录号：1658050）
带1.0 mm集成垫片的Mini-PROTEAN垫片（Bio - Rad ，产品目录号：1653311）
Mini-PROTEAN短板（Bio - Rad ，目录号：1653308）
Mini-PROTEAN梳子，15孔，1 mm，26 µl（Bio - Rad ，目录号：1653360）
PowerPac 基本电源（Bio - Rad ，目录号：1645050）
G：BOX成像系统（Syngene ）或同等水平

软件

ImageJ（开源图像处理软件，imagej.net）

程序

GST酵母CTD 底物的表达与纯化
注意：广泛利用了来自不同生物体（包括智人，果蝇和酿酒酵母）的CTD的GST融合体，包含定义数量的七足动物重复序列的合成构建体的易得性大大简化了克隆。此处介绍的EMSA方法适用于所有但是，通用的纯化方法并不适用于所有构建体。由于其历史悠久的历史，主要共有的七肽重复序列的含量以及我们提供的6X-HIS标记的GST和酿酒酵母CTD融合的纯化方案。不论CTD修饰酶的来源如何，均可广泛用作模型底物。替代的CTD构建体的纯化方案可在整个已发表的文献中找到和/或应凭经验确定。

亚克隆GST-CTD的酵母序列（如描述梅菲尔德等人，2019 进入）的pET - 28（+）载体，或等价的，使用任何标准克隆方法。
使用常规方法将经过序列验证的质粒转化为BL21（DE3）感受态大肠杆菌细胞，并通过在含有50μg / ml 卡那霉素的琼脂平板上于37 °C 下生长过夜来选择转化体。
接种单个菌落到含有50 LB培养基10ml的微克/ ml卡那霉素（10毫升LB + 10 微升1,000X卡那霉素母液）和在37℃下生长过夜以产生饱和培养。
含有LB的接种2个1升烧瓶中50 微克/ ml卡那霉素（1L LB + 1000 微升1,000X 卡那霉素母液）用4ml饱和过夜培养各flask.Incubate的在37℃下以180 rpm.Monitor摇动OD 600 使用紫外可见分光光度法，直到培养物达到约0.6-0.8的值。
通过加入1ml的1诱导表达，000 X IPTG库存，并允许培养物以在37℃下生长在180 rpm振摇额外4小时。
通过将培养物转移到合适的1 L离心瓶中收获细胞沉淀，必要时将其平衡，然后在室温下以5,000 xg离心20分钟。细胞沉淀可以立即处理或在-20°C下冷冻长达1年。
合并来自2 L生长培养基的细胞沉淀，并重悬于100 ml的裂解缓冲液中，通过在冰上剧烈搅拌溶液30分钟，使沉淀完全重悬。
通过使用适当调整的仪器进行超声处理来裂解细胞。使用30次连续声处理的10个循环对冰上的悬浮细胞进行超声处理，然后在持续搅拌下恢复1分钟，最后溶液将呈现微黄色，从而可以进行有效的超声处理。
通过将裂解液在50 ml离心管中等分，确认裂解液的质量，并在4 °C下以10,000 xg离心40分钟，以清除细胞碎片的裂解液，合并液滴部分并丢弃含有沉淀的细胞碎片。
将5 ml Ni-NTA His Bind Resin浆液倒入空色谱柱中，使液体流过，用5 ml裂解缓冲液平衡微珠，并将微珠/裂解缓冲液与合并的上清液馏分合并。在冷室中搅拌30分钟以确保蛋白质结合。
将流通液/流通液混合物加到色谱柱上，让流通液通过，收集流通液，然后倒回珠子一次，此时您的蛋白质便与珠粒结合了。
用100毫升洗涤缓冲液洗涤珠子，使其流过。
加入10 ml洗脱缓冲液，使溶液从色谱柱中缓慢滴下，从色谱柱上洗脱GST-酵母CTD ，并将其收集在干净的50 ml锥形管中。
检查蛋白质含量，由混合200个Myueru 皮尔斯考加（布拉德福德）测定试剂用2 Myueru 的溶出。如果蛋白存在，溶液变成一个充满活力的蓝色。检查蛋白质含量和标识采用经典的SDS-PAGE分析洗脱。GST -酵母CTD （如Mayfield 等人所述，2019）具有48.7 kDa 的理论分子量。
将诱导的蛋白质转移到SnakeSkin 透析管中，并在1 °C 的透析缓冲液中于4°C 透析过夜。
使用FPLC，通过用1.5倍柱体积的柱以1 ml / min的流速洗涤柱，用透析缓冲液平衡HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 柱。
通过向设备中加入5-10 ml去离子水并以3500 xg 的转速旋转设备5分钟来制备Amicon Ultra-15离心过滤器，并丢弃分子量截留过滤器两侧的剩余水。
将透析的蛋白质涂到准备好的离心过滤器上，并在3500 xg下于4°C下以10分钟的间隔离心，直到截留分子量的过滤器上方的体积达到1 ml，然后将过滤器上方的体积转移至1.5 ml试管，在4°C下以13,000 xg离心10分钟以去除任何蛋白质聚集体，然后转移至新的1.5 ml试管中。
将浓缩的样品注入FPLC和准备好的色谱柱中，在280nm处监测洗脱吸光度并收集1 ml从空体积开始至1.2柱体积的级分使用吸光度示踪确定含有GST-酵母C TD的级分并制备SDS-PAGE通过混合20份样品微升的馏分用20 微升2的X 的Laemmli的样品缓冲液并在95℃下沸腾样品5分钟。验证蛋白质身份和纯度使用建立的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色的协议，类似于那些呈现下面。
收集包含Ng GST-酵母CTD的馏分，并在Amicon 离心装置中浓缩至约10 mg / Ml（通过在纳米D Rop上在280 Nm处的吸光度确定）。分装至50 Myueru ；分装到1.5 Ml的试管中，并在液氮中速冻-- 80℃。

使用CTD激酶对GST-酵母CTD 底物进行体外磷酸化
激酶反应
合并库存解决方案，如下所示：

5 微升4X激酶缓冲液（配方8）

5 微升4倍GST-CTD酵母底物（配方10）

5 微升4X激酶溶液（如所期望配方11，12，13）

5 微升4x ATP

通过在30℃下加入4倍ATP.Incubate反应在热循环仪用于期望发起反应的时间。反应完成时间量是激酶依赖性和应empirically.In我们手中来确定，TFIIH和P- TEFB 反应接近完成后大约1小时，而c- Abl 反应大约需要4小时才能完成。确切的反应时间取决于激酶，实验目标和生产量，应凭经验确定。完成的反应可立即进行分析或在-80°C储存长达一年。

注意，迄今为止，各种CTD激酶是可商购的或在文献中进行了描述。在此，我们提供了通过三种可商购的人CTD激酶/激酶复合物TFIIH，P - TEFb 和c-Abl 研究CTD磷酸化的反应条件。也可以使用其他激酶，但应针对感兴趣的激酶优化反应条件，应特别注意激酶的批号和商业来源，因为它们的个体活性差异很大且需要优化。

无激酶控制反应
合并库存解决方案，如下所示：

5 微升4X激酶缓冲液（配方8）

5 微升4倍GST-CTD酵母底物（配方10）

5 微升去离子水

5 微升4x ATP

加入4倍ATP来引发反应。在30°C的热循环仪中孵育所需的时间。不应将激酶控制反应与含激酶的反应并行进行。已完成的反应应立即进行分析或保存在-80°C长达一年。

电泳样品的制备
注意：SDS-PAGE和Semi-Native PAGE样品的制备方法完全相同.Laemmli 样品缓冲液中Semi-Native PAGE样品的变性/还原相对于纯天然样品，增加了最终条带的清晰度和分辨率，这往往会增加磷酸迁移率在未磷酸化和磷酸化底物之间的迁移程度超过了在SDS-PAGE中观察到的程度。

加入20骤冷反应微升2×的莱城mmli的样品缓冲液并在95℃下煮沸5个min.This 产率约40微升与最终样品的GST-CTD酵母的大约0.5底物浓度微克/ 微升。

SDS-PAGE（变性/还原）
注意：建议使用10％丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶，因为它们在GST酵母CTD 底物的质量范围内能很好地分辨蛋白质。使用替代底物或不同分辨率时，请考虑替代丙烯酰胺的浓度。

根据与SDS-工厂方向设置的Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN利细胞PAGE凝胶（配方18-19）和1x 的Laemmli的运行缓冲液（Tris-甘氨酸）（配方20）。负载2 微升（1 微克的制备）对每个孔进行电泳，确保同时包含激酶和不进行激酶对照反应，包括分子量阶梯。
在150V（恒定）下运行凝胶约1小时，或直到染料前沿到达凝胶底部。
从电泳室和玻璃铸件中取出凝胶，并立即进行考马斯亮蓝染色或其他下游应用。

半本地PAGE
注意：建议使用10％丙烯酰胺半天然PAGE凝胶，因为它们可以在GST酵母CTD 底物的质量范围内很好地分离蛋白质。使用替代底物或不同分辨率时，请考虑替代丙烯酰胺的浓度。

根据工厂说明，使用半天然PAGE凝胶（配方18-19）和1 x 天然Laemmli的运行缓冲液（Tris-甘氨酸）（配方21）按照出厂说明设置Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell。负载2μl （1μg ）制备的电泳样品到每个孔中，确保同时包含激酶和不进行激酶控制反应。包括预先染色的分子量梯子。梯子质量不能在Semi-native PAGE中直接解释，但有助于Semi的重现性-天然PAGE实验，如果感兴趣的蛋白质在染料前沿离开凝胶之前未得到很好的分离，则可提供凝胶进展信息。
用冰袋在150 V（恒定）下运行凝胶约1-4小时，可能需要长时间运行才能获得分离良好的条带，这次应针对您的特定样品进行优化。
从电泳室和玻璃铸件中取出凝胶，并立即进行考马斯亮蓝染色或其他下游应用。

考马斯亮蓝染色
用去离子水短暂冲洗凝胶，用去离子水倾倒并加入足够的考马斯亮蓝染色剂以覆盖凝胶。在室温下轻轻摇动孵育凝胶至少1小时或过夜。将考马斯亮蓝染色剂倒入合适的容器中。污渍可以重复使用多次。
在去离子水中彻底冲洗凝胶，以去除残留的考马斯亮蓝染料，并用Destain 完全覆盖凝胶。在室温下轻轻摇动孵育凝胶，直到可见染色的蛋白带，并且背景很小，根据需要改变颜色。

数据分析

该脱色凝胶可立即进行视觉和解释。在SDS-PAGE应用，磷酸化降低了流动性的Th é GST-酵母CTD 基板上。这是证明一个更高的表观分子量激酶处理样品相对于没有激酶控制样品。在半天然PAGE中，磷酸化增加了GST酵母CTD 底物的迁移率，这表现为在激酶处理的样品中表观分子量相对于无激酶的对照物的表观分子量较低。系统包括Chemi -Doc（Bio-Rad ）和G：Box（Syngene ）系统，可以在ImageJ中裁剪图像，也可以使用ImageJ在整个图像上均等地调整亮度和对比度，以提高凝胶的可解释性。。应格外小心，以确保在所有考虑的样本上均明智且等效地应用图像修改。

整篇文献均采用了EMSA分析方法，Mayfield 等人（2019）中介绍了该方法的实例，如图1C和图1C所示，将SDS-PAGE EMSA应用于两种GST-CTD底物。 2A。当需要提高分辨率并且要求对已建立的SDS-PAGE协议进行最小改动时，如补充图1D所示，半本地PAGE是一种有用的选择。

菜谱

LB中号（1公升）
将以下物质加入900毫升去离子水中：

10克Bacto 胰蛋白tone

5克酵母提取物

10克氯化钠

12克Bacto 琼脂（仅适用于琼脂平板）

摇动或搅拌溶液以溶解溶质
用去离子水将最终体积调节至1 L
在液体循环中于15 psi高压灭菌20分钟进行灭菌
如果需要，一旦培养基完全冷却（对于液体培养基）或已融化但摸起来舒适（对于琼脂平板），请添加抗生素，然后在无菌条件下将平板倒入
1,000x卡那霉素原液（50 mg / ml）
将500 mg卡那霉素单硫酸盐（MW 。= 582.60）溶于9 ml去离子水中
用去离子水将体积调节至10毫升
通过0.22过滤消毒溶液微米过滤器和分装成无菌试管
储存在-20°C
1,000x IPTG库存（400 mM）
将950 mg异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG，MW 。= 238.30）溶于9 ml去离子水中
用去离子水将体积调节至10毫升
通过0.22过滤消毒溶液微米过滤器和分装成无菌试管
储存在-20°C
裂解缓冲液（1 升）
50 mM Tris-HCl pH 8.0（从1 M Tris-His pH 8.0储备液中稀释50 ml [ 配方14 ] ）

500 mM氯化钠（29.25 g）

15 mM咪唑（从1 M库存中取15 ml ）

10％甘油（100％库存中有10 毫升）

0.1％Triton X-100（从100％库存中取1 ml）

的10mM β - 巯基乙醇（0.7 从14.3库存毫升M）

洗涤缓冲液（1 升）
50 mM Tris-HCl pH 8.0（从1 M Tris-His pH 8.0储备液中稀释50 ml [ 配方14 ] ）

500 mM氯化钠（29.25 g）

15 mM咪唑（从1 M库存中取15 ml ）

的10mM β - 巯基乙醇（0.7 从14.3库存毫升M）

洗脱缓冲液（1 升）
50 mM Tris-HCl pH 8.0（从1 M Tris-His pH 8.0储备液中稀释50 ml [ 配方14 ] ）

500 mM氯化钠（29.25 g）

400 mM咪唑（400万毫升，来自1 M库存）

的10mM β - 巯基乙醇（0.7 从14.3库存毫升M）

透析缓冲液（1 L）
50 mM Tris-HCl pH 8.0（从1 M Tris-His pH 8.0储备液中稀释50 ml [ 配方14 ] ）

50毫米氯化钠（2.9 克）

的10mM β - 巯基乙醇（0.7 从14.3股票毫升M）

对于FPLC应用中，缓冲器应通过一个0.4被过滤微米过滤器以除去任何颗粒。

4x激酶缓冲液（100 毫升）
200 mM Tris-HCl pH 7.5（从1 M Tris-His pH 7.5储备液中稀释20 ml [ 配方14 ] ）

200 mM MgCl 2 （从2 M的储备液中提取10 ml ）

4x ATP（5毫升）
22 mg腺苷5'三磷酸二钠盐水合物

1 M Tris-HCl pH 7.5（可变）

将腺苷5'三磷酸二钠水合物溶于4 ml去离子水。
通过在pH 纸上点少量（1-2μl ）溶液来验证pH 值。初始溶液应为酸性。
通过添加20-100调节pH用1M的Tris-HCl pH为7.5 微升每个addition.Once pH值寄存器7.5，调节溶液至5毫升最终体积之后的时间和检查pH使用去离子water.Adjusting pH值ATP解决方案至关重要。
4x GST- 酵母CTD 底物
4 微克/ 微升GST-CTD酵母基质

Mm Tris-50 HCl p H 8.0

4x P- TEFb 激酶溶液
0.03 微克/ 微升CDK9 /周期蛋白T1蛋白，活性

50 mM的Tris-HCl pH 7.5

4x TFIIH激酶溶液
0.1 微克/ 微升CDK7 /细胞周期蛋白H / MAT1（CAK复合物）蛋白，活性

50 mM的Tris-HCl pH 7.5

4x c- Abl 激酶溶液
0.014 微克/ 微升C- Abl的激酶

50 mM的Tris-HCl pH 7.5

1 M Tris-HCl pH 6.8（或7.5和8.0）（500 ml）
60.6克Tris Base

400毫升去离子水

结合Tris碱和去离子水

调节pH值至6.8 （或7.5和8.0）Ü 唱浓盐酸和使最终体积至500ml瓦特第i个额外的去离子水
室温保存
1.5 M Tris-HCl pH 8.8（500毫升）
90.9克Tris Base

400毫升去离子水

结合Tris碱和去离子水
用浓盐酸将pH调节至8.8，并用去离子水使最终体积达到500 ml
室温保存
10％SDS（100毫升）
10克十二烷基硫酸钠（SDS）

80毫升去离子水

将SDS和去离子水合并，搅拌直至溶解
用额外的去离子水将最终体积调节至100 ml
室温保存
2 倍Laemmli的样本缓冲区
0.125 M Tris-HCl pH 6.8

4％SDS（w / v）

10％β - 巯基乙醇（V / V）

20％甘油（v / v）

0.02％溴酚蓝（w / v）

分离半天然PAGE / SDS -PAGE 凝胶（10％丙烯酰胺； 5 ml – 足够用于1凝胶，必要时可缩放）
1.7毫升30％丙烯酰胺

1.3毫升1.5M Tris-HCl pH 8.8

1.9毫升去离子水

50 微升10％SDS（W / V）（对于SDS-PAGE凝胶只）

50 微升去离子水（为半天然PAGE凝胶上仅）

50 微升10％过硫酸铵（重量/体积）

4 微升TEMED

将30％的丙烯酰胺，1.5 M Tris-HCl pH 8.8，去离子水，SDS（用于SDS-PAGE）或其他去离子水（用于Semi-native PAGE）混合在螺口小瓶中，然后颠倒合并。
加入过硫酸铵和TEMED引发聚合反应，轻轻倒置，然后将溶液转移至准备好的Bio-Rad Mini-PROTEAN凝胶铸模中。
填充铸件，在凝胶顶部留出足够的空间用于堆叠层和梳子。
轻轻地在分辨凝胶的顶部涂上一层100％的乙醇，使其完全聚合并倒出乙醇。
堆叠式半天然PAGE / SD S-PAGE凝胶（5％丙烯酰胺，2 ml – 足以用于1凝胶，必要时可缩放）
330 微升30％的丙烯酰胺

250 微升1M的Tris-HCl pH 6.8的

1.4毫升去离子水

20 微升10％SDS（W / V）（对于SDS-PAGE凝胶只）

20 微升去离子水（为半天然PAGE凝胶上仅）

20 微升10％过硫酸铵（重量/体积）

2 微升TEMED

将30％的丙烯酰胺，1 M Tris-HCl pH 6.8，去离子水和SDS（用于SDS-PAGE）或其他去离子水（用于Semi-native PAGE）合并在螺口小瓶中，然后颠倒合并。
加入过硫酸铵和TEMED引发聚合反应，轻轻倒置，然后将溶液转移至制备的含有聚合型分离凝胶的Bio-Rad Mini-PROTEAN凝胶铸件中。
用堆积的凝胶溶液填充铸件的其余部分，然后插入梳子。
让凝胶完全聚合。
将最终凝胶包裹在湿纸巾和保鲜膜中，在4 °C下保存2周。
1x Laemmli 运行缓冲液（Tris-甘氨酸）（1 L）
将以下物质加入900毫升去离子水中：

3.03克Tris基础

14.2克甘氨酸

1毫升10％SDS（w / v）

让所有试剂溶解，必要时将pH调节至8.3。用额外的去离子水将体积调节至1 L.

1x天然Laemmli 运行缓冲液（Tris-甘氨酸）（1 L）
将以下物质加入900毫升去离子水中：

3.03克Tris基础

14.2克甘氨酸

让所有试剂溶解，必要时将pH调节至8.3。用额外的去离子水将体积调节至1 L.

考马斯亮蓝染色剂（100毫升）
结合以下内容：

0.25克考马斯亮蓝R250

45毫升乙醇

45毫升去离子水

10毫升冰醋酸

不断搅拌直至完全溶解

去污
结合以下内容：

50毫升乙醇

75毫升冰醋酸

875毫升去离子水

搅拌或倒置容器，直到充分混合

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（Y01）的资助（R01 GM104896和125882）和韦尔奇基金会（Y-1Z的F-1778）的资助，此处介绍的方法是根据以前的工作改编的（Mayfield et al。，2019 ）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

参考文献

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Dias，JD，Rito，T.，Torlai Triglia，E.，Kukalev，A.，Ferrai，C.，Chotalia，M.，Brookes，E.，Kimura，H. and Pombo，A.（2015）。的甲基化RNA聚合酶II非共识赖氨酸残基标志着哺乳动物细胞中的早期转录。生命4：11215。
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