材料和试剂

10 ml血清移液管（Krackeler ，目录号229010B）
5 ml血清移液管（Krackeler ，目录号：229005B）
1.5 ml离心管（Axygen ，目录号：MCT-150-C）
15 ml离心管（Krackeler ，货号：229411）
50 ml离心管（Krackeler ，目录号：229421）
100 mm x 20 mm组织培养皿（Krackeler ，目录号：229621）
96孔板黑色，底部透明（Corning，目录号：3603）
好板-96，V型底（格雷纳生物Ø NE，目录号：651201）
FlexStation 移液器吸头（黑色，96）（分子设备，目录号：9000-0911）
Finntip Flex的300 微升无菌枪头（Thermo Scientific的，目录号：94060513）
Channelmate 25 ml插入物（美国科学公司，目录号：1346-2510）
多孔板清洗器/分配器歧管（Sigma，目录号：M2781-1EA）
0.2 Myuemu PES膜˚F ILT 尔真空过滤
表达人NPY2R受体和H188的HEK293 / hNPY2R / H188 c18细胞
表达人胰高血糖素受体和H188的HEK293 / hGCGR / H188 c10细胞
仅表达人CCK 2 R的HEK293 / hCCK 2 R c29 细胞
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：BP358-1）
氢氧化钠（Fisher Scientific，目录号：BP359-500）
氯化钾（Fisher Scientific，目录号：BP366-500）
六水合氯化镁（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
二水合氯化钙（Fisher Scientific，目录号：BP510-100）
D-葡萄糖（Sigma，目录号：G5767-500G）
HEPES 1 M溶液（Sigma，目录号：H0887；在4°C下存储）
牛血清白蛋白（Sigma，目录号：A7030-100G;储存在4°C）
鼠尾胶原蛋白（生命技术公司，目录号：A10483-01；在4°C下储存）
冰醋酸（Thermo Scientific，目录号： A38 S -500）
磷酸盐缓冲盐水，1x（Corning，目录号：21-040-CV）
DMSO（Sigma，目录号：D8418-100ML）
胎牛血清（Sigma，货号：12303C-500ML;储存在-20°C）
Dulbecco的改良Eagle培养基（Sigma，目录号：D6429-500ML ；在4°C下储存）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（Thermo Scientific，目录号：25200072;储存在-20°C）
Pen Strep（Life Technologies，目录号：15140-122;储存在-20°C）
G-418二硫酸盐溶液（Sigma，目录号：G8168-10ML ；在4°C下存储）
Forskolin（Sigma，目录号：F6886-10MG）
胰高血糖素（Sigma，目录号：G1774-.1MG;储存在-20°C）
Demogastrin-2（DG2）（Pichem ，货号M24-061202;在-20°C储存）
PYY（3-36）（Sigma，目录号：P220-500UG;储存在-20°C）
标准细胞外盐水（SES）溶液，pH 7.4（请参阅食谱）
大鼠尾部胶原蛋白（RTC）包被溶液（用于一个96孔板）（请参阅食谱）

设备

生物生物安全柜（LABCONCO ，米Odel等：346001）
FP-Novus公司MCP8 30-300 微升8通道移液器（热科学，目录号：4630040）
水夹套CO 2 培养箱（热电，NAPCO ，米Odel等：8000WJ）
FlexStation 3酶标仪（分子设备）
VAPRO 渗压计（Vescor ，米Odel等：5520）
亮线血细胞计数器（Fisher Scientific，目录号：02-672-5）

软件

SoftMax Pro v.5.4.6（Molecular Devices，http://www.moleculardevices.com）。
Origin 8（OriginLab ，www.originlab.com）
注意：如果使用Softmax Pro 7，则不需要Origin 8来分析数据。

程序

准备仪器：S Ee Video 1 FlexStation 3和SoftMax Pro 7准备详细信息
打开FlexStation 3。
将温度设置为25°C。
将移液器吸头架装入吸头架抽屉。
在与FlexStation 3 连接的计算机上打开SoftMax Pro文件。设置协议。

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视频1. FlexStation 3和SoftMax Pro 7的准备

悬浮细胞的阅读板的制备
从10 cm组织培养皿中吸取培养基，细胞汇合率为80-90％，向培养皿中加入2 ml胰蛋白酶-EDTA溶液，并将培养皿返回组织培养箱2分钟，加入3 ml新鲜培养基中和胰蛋白酶-EDTA，然后将细胞转移到15 ml试管中，并以1 50 x g 离心2分钟。
在单次进样实验中用21 ml SES 吸出轮询和d重悬细胞，或在双次实验中用16 ml SES 吸出d重悬细胞。将细胞悬浮液转移到Channelmate 25 ml插入物中。用8道移液器将悬浮液转移到96孔黑色透明底读数板，200 微升/孔单次注射实验，或150 微升/孔的双色注塑实验。
在FlexStation 3的阅读室抽屉中将单元格装入阅读板。
在执行实验前，将细胞在25°C的阅读室中孵育20分钟，以使其平衡。
如果方案需要使用GPCR拮抗剂进行预处理，请在第4行中提到的上述20分钟孵育步骤之前，用拮抗剂对细胞进行预处理。

带有粘附细胞的阅读板的制备
根据所使用的克隆细胞系，某些克隆在将测试溶液施用于这些细胞的悬浮液后会显示出小的注射伪影。通过在单层贴有大鼠尾巴的读板孔中生长的粘附细胞进行实验可以避免这种伪影胶原蛋白（RTC）。由于需要在RTC上过夜培养细胞，因此该方法需要额外一天的时间。

第一天：

鼠尾胶原蛋白涂布板
在组织培养罩中，将大鼠尾部胶原蛋白包被溶液转移到25毫升Channelmate 插入物中，用8道移液器转移到96孔黑色透明底读数板中，每孔50μl 。
在室温下孵育平板60分钟。
使用多孔板歧管，从板上吸出涂料溶液。
使用8通道移液器，用PBS 100μl /孔洗涤板一次。
注意：板可立即使用，或在组织培养罩中风干，并在2-8°C下在无菌条件下保存长达一周。

将读取单元装入细胞
从带有细胞的10 cm组织培养皿中吸出培养基，加入2 ml胰蛋白酶-EDTA溶液，然后将培养皿放回组织培养箱中2分钟，加入3 ml新鲜培养基中和胰蛋白酶-EDTA，将细胞转移到15 ml试管中，涡旋并采用细胞计数血球。
离心细胞FO 在150转2分钟XG 。
吸出脂质体，将细胞重悬于新鲜培养基中，浓缩至600,000细胞/ ml。
在Channelmate 25 ml 插入物中转移12 ml细胞悬液，使用8通道移液器将细胞转移到大鼠尾部胶原蛋白包被的96孔读数板中，每孔100μl 。
注意：平板上每孔60,000个细胞的计数将在细胞粘附后的第二天早晨允许约80-90％的细胞汇合，这种汇合有助于在实验准备过程中进行培养基或缓冲液交换时最大程度地减少单层细胞的脱落。除了使用HEK293细胞外，必须调整细胞数以在实验当天达到80-90％的融合度。

将板与组织培养培养箱中的细胞一起孵育过夜。

第二天：

使用多井板歧管，从吸出培养基plate.Using 8通道移液器，添加到SES板，200 微升/孔单次注射实验，或150 微升/孔的双色注塑实验。
在FlexStation 3的阅读室抽屉中将单元格装入阅读板。
将细胞在25°C的阅读室中孵育20分钟以达到低平衡。
按照步骤D中所述，用测试溶液准备上样的复合板。
按照程序E中所述进行FRET分析。

用测试溶液加载复合板
在所需浓度下将测试溶液溶解在SES中。在将测试化合物注入包含细胞的孔中后，测试溶液浓度必须比最终所需浓度高五倍（5倍）。
传输测试解决方案，以96-孔复板，300 微升/孔，在实验设置中指定的孔中。
将复合板装入FlexStation 3的复合板抽屉中。

启动FRET分析测量
在包含所需实验方案的SoftMax Pro文件中，单击“读取”图标以开始对包含细胞的板的各个孔进行FRET测量。
Flexstation 3执行测量时，请勿中断测定。
有关SoftMax Pro 7中数据处理过程的详细信息，请参见视频2数据分析。

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视频2.数据分析

代表性数据示例
图1A和1B展示了如何使用Flexstation 3在237中执行FRET分析的示例，其中H188用于确定胰高血糖素238对细胞内[cAMP]的刺激作用的剂量反应关系。图1A说明了如何加载化合物板用测试解决方案，以239溶解在SES以5 X 比最终将最终浓度240输送试验溶液至读取plate.Figure 1B示出了井这些测试241溶液被注入的后较高浓度在包含细胞的阅读板上（请参见图1的图例）。

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图1. 使用人胰高血糖素受体和cAMP传感器H188 来测定胰高血糖素剂量-反应关系的化合物和读数板的设计。A . 含有测试溶液的化合物板。化合物板上AH 行的前四个孔中的每一个都包含300 微升的plate.For例的左侧规定的试验溶液中，孔A1，A2，A3和A4装载有作为车辆控制SES;孔B1，B2，B3和B4负载5 日下午胰高血糖素在SES等高达5000 PM glucagon.For每个浓度，平均％Δ FRET ± SD为N = 12米的孔将被determined.B。读板含有HEK293-hGCG-R-H188 C10细胞悬浮液。对于每个浓度进行胰高血糖素测试，读数板上的三个孔接收50μl 的5x浓缩测试溶液，该溶液从化合物板上的一个孔转移至200μl 细胞悬液中。例如，对于A1，A2和A3； B1，B2和B3，继续到H1，H2和读数板上的H3接受测试溶液A1，B1，继续在复合板上的H1（红色）;接着，孔A4，A5和A6; B4，B5和B继续到H4，H5和H6（绿色）读取板上的A2，B2溶液，直到复合板的H2（绿色），其余的孔（蓝色，黄色）也要进行同样的操作。

说明了在这些FRET分析中获得的数据，这些数据确定了胰高血糖素的剂量反应266关系（请参见图2的图例）。

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图2.使用cAMP传感器H188建立胰高血糖素剂量反应A. 从读数板上的单个孔中获得的原始数据说明了485和535 nm H188相对荧光单位（RFU）发射的时间依赖性倒数的增加和减少。 300 pM 胰高血糖素对HEK293-hGCG-R-H188 c10细胞悬浮液的响应强度。受试物质的施用在此处和后续图中用垂直箭头指示。B。H188单孔百分比变化的测定535分之485nm发射率（％Δ 使用单个井原始数据计算FRET）在面板2A中所示。在五百三十五分之四百八十五纳米FRET比率表示的增加的增加[cAMP的]的。基线减法之后获得的值0时间点0 的FRET比值。值70对应于相对于基线的FRET比值增加70％.C 。胰高血糖素产生48 5/535 nm H188 FRET比值的时间依赖性和剂量依赖性。每次po的数据 int是平均％Δ FRET ± SD为N = 12 wells.D。证明了EC在面板2C中所示的数据的非线性回归分析50 为在该细胞系胰高血糖素作用为8.1 日下午。非-线性回归分析使用Orig 在8个软件中对每个数据点使用最高的∆ FRET 值进行。非线性减少也可以通过GraphPad Prism 8执行。有关如何获取与时间有关，与剂量有关和与剂量无关的值的说明使用SoftMax Pro 7.1进行线性减少，请参见视频2。

说明d是显示器的[Ca在FRET测定法中获得的数据2+ 283] 我使用YC3.60记者，284 CCK 2 R A gonist DG2，和表达细胞的CCK 2 - [R （参见图3说明）。

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图3. 使用YC3.60.A检测到的人胃泌素-2（DG2）在人CCK 2 受体上增加[Ca 2+ ] i的剂量依赖性作用。从读数板上单孔获得的原始数据说明了时间依赖性减少倒数和485，增加535nm处YC3.60相对荧光单位（RFU）的发射强度，响应于CCK的应用2 受体激动剂DG2（300 纳米），以HEK293-hCCK的悬浮液2 - [R C29 细胞腺病毒转导的与YC3.60.B. 使用面板3A中所示的单孔原始数据确定YC3.60 535/485 nm发射比（％∆ FRET）的单孔百分比变化，增加535/485 nm FRET比表示的[Ca的增加2+ ] 我.C 。DG2所产生的485分之535纳米的时间依赖性和剂量依赖性增加YC3.60 FRET ratio.Data 对于每个时间点的平均％Δ FRET ± SD FO r n = 6口井D. 对3C组数据进行的非线性回归分析表明，DG2 a 的EC 50 在此细胞Ction系604 的P- 中号。非线性回归分析进行随着Origi N 8软件使用最高德鲁塔˚F RET值为每个数据点。非线性还原也可以在p- Erformed用GraphPad棱镜8. 对于指令有关如何使用SoftMax Pro 7.1获取与时间有关，与剂量有关和非线性减少的值的信息，请参见视频2。

说明了一种双注射方案，该方案可监视PYY（3-36）降低用福司可林处理并表达NPY2R的细胞中299 [cAMP]水平的能力（请参见图4的说明）。

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4.肽图YY（3-36）水平的降低CAMP在HEK293-NPY2R-H188 C18细胞。A. HEK293 / HNPY2R / H188 C18细胞稳定表达人NP Y2R受体和H188被允许坚持一RTC涂过夜培养的阅读板。在第2天监测了单独的毛喉素提高cAMP水平的能力（红色示踪）。请注意，当NPY2R 激动剂PYY（3-36）（1-36 ）（1- 10 纳米）的125微秒的毛喉素使用“双注射方案”之前施用.PYY （3-36）结合于NPY2R以激活ģ 我蛋白质和降低腺苷酸环化酶活性，毛喉素衍生物直接刺激腺苷酸环化酶。因此，该测定法监测了PYY（3-36）和福司可林对cAM P 水平的控制作用。数据的非线性回归分析表明，该细胞系中PYY（3-36）作用的IC 50 为2.1 nM。非线性回归分析是使用Orig 在8软件中使用高每个数据点的估计Deruta F RET值。请注意，时间标度为1,200 S，因此在该分析中显示了佛司可林和PYY（3-36）的短期和长期作用B. 对比实验与A毛喉素是前施用PYY（使用3-36）HEK293 / hNPY2R / H188 C18细胞和双注入protocol.Note 所述时间尺度是400秒，从而露出快速的动作PYY（3-36）（1 μ 中号），以减少的增加率Δ 的FRET.This NPY2R介导的作用PYY（3-36）表示ģ 我与所得降低cAMP水平的，作为使用H188检测腺苷酸环化酶的蛋白质介导的抑制。

数据分析

使用SoftMax Pro v.5.4.6进行分析。
读取完成后，将SoftMax Pro文件与实验数据一起保存。
使用SoftMax Pro导出过滤器为板的每个孔创建一个包含FRET比率值的.txt文件。
使用Origin 8导入.txt文件以创建“单个ASCII”文件。
使用Origin 8计算每个选定孔组的平均值± SD比值。
使用Origin 8以图形格式绘制平均比率值与时间的关系。
使用非线性回归分析包在原产8至分析本身最高Δ FRET比率值测试物质的各个浓度，使得剂量效应初探关系和EC 50个值可以基于曲线拟合来确定（Chepurny 等人，2018和2019）。
使用Origin 8生成Box和Whisker图，以显示从赋形剂或药物处理细胞中获得的平均比率的测定内变异性（Chepurny 等人，2018和2019）。
将ANOVA测试与Tukey HSD测试结合使用来确定在用赋形剂或测试溶液处理的细胞获得的平均比率值之间是否存在显着差异（P <0.05）（Chepurny 等人，2018和2019）。

使用SoftMax Pro v.7进行分析：请参阅视频2
有关详细信息，请参见视频2 “ FlexStation 3数据分析”。

菜谱

标准细胞外盐溶液（SES），pH 7.4
138毫米氯化钠

5.6 毫米氯化钾

1.2毫米MgCl 2

2.6毫米CaCl 2

10毫米HEPES

11 mM葡萄糖

0.1％牛血清白蛋白

Steriliz 编0.2 微米真空过滤

储存在4°C

大鼠尾部胶原蛋白（RTC）包被溶液（用于一个96孔板）
5.5毫升MilliQ 水

6.3 微升冰醋酸

95 微升鼠尾胶原

注意：使用前请准备新鲜。请勿存放。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）向GGH提供的RO1-DK069575以及纽约州NYSTAR计划通过锡拉丘兹大学（Syracuse University）的CASE中心向RPD提供的支持。

竞争我nterests

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考文献

Chepurny ，OG，Leech，CA，Kelley，GG，Dzhura ，I.，Dzhura ，E.，Li，X.，Rindler ，MJ，Schwede ，F.，Genieser ，HG and Holz ，GG（2009）.Rap1激活增强和的Epac选择性环AMP类似物在大鼠INS-1细胞中的乙酰氧基甲基酯的胰岛素促分泌素的属性：研究使用8 PCPT-2'-O- ME-的cAMP-AM。生物化学杂志284（16）：10728- 10736。
Chepurny ，OG，Bonaccorso，RL，Leech，CA，Wollert，T.，Langford，GM，Schwede ，F。，Roth，CL，Doyle，RP和Holz ，GG（2018）。嵌合肽EP45作为GLP的双重激动剂。 -1和NPY2R受体。Sci Rep 8（1）：3749。
Chepurny ，OG，Matsoukas ，MT，Liapakis ，G.，Leech，CA，Milliken，BT，Doyle，RP和Holz ，GG（2019）。非常规胰高血糖素和GLP-1受体激动剂和拮抗剂在GLP-1受体上的相互作用在针对cAMP的高通量FRET分析中的应用。J Biol Chem 294（10）：3514-3531。
Klarenbeek 。，J，Goedhart 。，J，面包车Batenburg 。，A，Groenewald，D。和Jalink 。，K（2015）第四代基于EPAC-cAMP的FRET传感器具有优异的亮度，耐光性和动态范围：表征FLIM专用传感器，用于比率测量和高亲和力 PLoS One 10（4）：e0122513。
Nagai，T.，Yamada，S.，Tominaga，T.，Ichikawa，M.和Miyawaki，A.（2004）。通过圆形排列的黄色荧光蛋白扩大了Ca 2+ 荧光指示剂的动态范围。ProcNatl Acad Sci 美国101（29）：10554-10559。
Nikolaev，VO，Bunemann ，M.，Hein，L.，Hannawacker ，A。和Lohse，MJ（2004）。用于受体诱导的信号传播的新型单链cAMP传感器， J Biol Chem 279（36）：37215-37218。