材料和试剂

移液器技巧（Sarsted t ，目录号： 70.1130，70.760.002，70.762）
1.5 ml 微量离心管（Sartsted t ，目录号：72.690.001）
15 亩-slide 8 - 良好无涂层，玻璃底部＃1.5聚合物盖玻片（Ibidi GmbH公司目录编号：80827）
高Ç Larity PP Ç Onical Ç Entrifuge 吨UBE15毫升中（Falcon ® ，目录号的：352096）
高Ç Larity PP Ç Onical Ç Entrifuge 吨UBE50毫升中（Falcon ® ，目录号的：352070）
医疗的Millex -GS 小号Yringe ˚F ILTER ü NIT，0.22 亩中号（EDM默克，目录号的：SLGSM33SS）
BD Discardit d 一次性注射器10毫升（Becton Dickinson，目录号：300296）
PYREX ® 媒体乙Ottles，摹Raduated，康宁® 1000毫升（VWR ，PYREX ® ，目录号：1395-10L ）
FluoSpheres TM 羧化物修饰的微球体，0.04 亩中号，暗红色荧光（六百八十○分之六百六十○），5％固体，叠氮化物不含（热飞世尔科技，产品目录号的：F8789）
金珠（GC80，BB International，目录号：EM.GC80 ）
大肠杆菌BL21 Star TM （DE3）符合Invitrogen要求的大肠杆菌菌株（Thermo Fisher，目录号：C601003），存储在-80°C
pET -GFP表达质粒（pET His6 GFP TEV LIC克隆载体，1 GFP）（Addgene ，质粒编号：29663），储存在-20°C
pET-GFP-SiRA 5 表达质粒，储存在-20°C
该协议中使用的pET-GFP-SiRA 5 质粒无法商业购买，选择适体的一般串联重复序列（取决于目标RNA和表达水平）可以直接与ROI融合（在这种情况下为GFP mRNA ）用适当的限制性位点的3 ' 端非编码区（在此：SalI位和XhoI位快速文摘限制酶，热科学TM ，目录号：FD0644而且FD0695，分别）如先前所描述在文献中（Sunbul 。等人，2018）。在在这项研究中，我们根据图3 插入了5个S iRA 适体的重复序列，并带有散布的接头核苷酸。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902664--1308 Murat Sunbul 791973 \图jpg \图3.jpg

3.图摘录的PET-GFP-SIRA 5 细菌表达质粒用于GFP MRNA在这个协议中的可视化。LACO ：lac操纵，RBS ：核糖体结合位点，ROI：RNA的兴趣，P：启动子，T：终结者，SalI 和XhoI ：限制位点，终止：终止用于RNA翻译的密码子。

以下序列显示了克隆表达载体（pET-GFP-SiRA 5 ）以及本研究中使用的pET -GFP的摘录。

pET-GFP-SiRA 5 ：

ShijieijijieieieishishitijitieishititishishieieitishishieiATATTGGAAGTGGATAACGGATCCG ... AATTCG AGCGCC GTCGAC AGGC CCA ShishijijijitititijieieieieishiCTGGCTGCTTCGGCAGTTGTATCCT 牛逼TGG GCCTAAGAGAGA CCA ShishijijijitititijieieieieishishiTGGCTGCTTCGGCAGTTGTATCCTT TGG TCTCAATAACCAG CCA ShishijijijitititijieieieieishiCTGGCTGCTTCGGCAGTTGTATCCT 牛逼TGG GCCTAAGAGAGA CCA ShishijijijitititijieieieieishishiTGGCTGCTTCGGCAGTTGTATCCTT TGG TCTCAATAACCAG ShishieishishijijijitititijieieieieishishiTGGCTGCTTCGGCAGTTGTATCCTT TGG CTGG CTCGAG ShieishishieishishieishishieishishieishishieishitijieijieitishishijijishitijishitieieishieieieijishishishijieieieijijieieijishitijieijititijijishitijishitijishishieishishijishitijieijishieieitieieishitieijishieitieieishishishishititijijijijishishitishitieieieishijijijitishititijieijijijijititititititijishitijieieieijijieijijieieishitieitieitishishijijieititijijishijieieitijijijieishijishijishishishitijitiAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTG ...

pET -GFP：

ShijieijijieieieishishitijitieishititishishieieitishishieiATATTGGAAGTGGATAACGGATCCG ... AATTCG AGCGCC GTCGAC AAGCTTGCGGCCGCA CTCGAG ShieishishieishishieishishieishishieishishieishitijieijieitishishijijishitijishitieieishieieieijishishishijieieieijijieieijishitijieijititijijishitijishitijishishieishishijishitijieijishieieitieieishitieijishieitieieishishishishititijijijijishishitishitieieieishijijijitishititijieijijijijititititititijishitijieieieijijieijijieieishitieitieitishishijijieititijijishijieieitijijijieishijishijishishishitijitiAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTG ...

黑色SiRA （3-nt茎环）

灰色可变茎环或间隔区

蓝色SalI 限制位点

粉色XhoI 限制位点

LB培养基蒸压，伦诺克斯（卡尔·罗斯®，目录号：X964.4）
LB带琼脂的肉汤，伦诺克斯（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
卡那链霉菌（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）中的硫酸卡那霉素，制备1 M水溶液，过滤灭菌并在-20°C储存
-β-异丙d - 硫代- 吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich公司，目录号的：I5502），所述的制备1M的常规水溶液，过滤灭菌，并储存于-20℃下
氧化钾颗粒EMPLURA钾® （Sigma-Aldrich公司，目录编号：1050121000），准备10 2M水溶液
聚D- 赖氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P7886），在DPBS中制备2.5 mg / ml，储存在4°C
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
MilliQ 水
罗丹明硅发荧光染料，100 MYU 中号方案在DMSO
该方案中使用的荧光染料不可商购，因此必须按照文献（Wirth et al。，2019）中所述通过HPLC进行合成和纯化。

注意：HPLC纯化必须非常小心，因为残留杂质的荧光会降低成像实验中的信噪比。

M9汤（Fluka Sigma-Aldrich，目录号：63011）
一水合硫酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：434183），制备1 M水溶液并高压灭菌
D- （+）- 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270），制备40％（w / v）水溶液并过滤除菌
六水合氯化镁（Sigma-Aldrich，目录号M2670），准备1 M水溶液并高压灭菌
二水合氯化钙（Sigma-Aldrich：目录号：1725801000），制备1 M水溶液并高压灭菌
活细胞成像解决方案（Thermo Fisher Scientific，目录号：A14291DJ）
M9成像解决方案（请参阅食谱）

配套设备

RES EARCH ® 加移液器，可变容积200和1000 MYU 大号（Sigma-Aldrich公司，的Eppendorf ® ，目录号小号：Z6 83817和Z683825）
蒸汽灭菌器（例如，Varioklav ® ，型号：155S）
舒适度的24 X Thermomixer中的1.5ml（的Eppendorf ® ）
孵化器和振荡器（Thermo Fisher Scientific，496型）
BioPhotometer生物分光光度计（的Eppendorf ® ，6131型）
高速微量离心机（Neuation Technology Pvt。Ltd.，目录号：iFuge M12）
冷柜
电冰箱
共聚焦显微镜（尼康，型号：A1R）
在对于这个协议中，扫描共聚焦显微镜具有混合扫描器（一个点的Galvano /谐振）中的溶液中所使用的，搭载了尼康Ñ的Apo 60x的NA 1.4 的λ 小号OI（WD0.14毫米，FOV 0.21 X 0.21 MM）的目标。在对于荧光激发，488使用绿色（nm通道）和640 nm（红色通道）激光器。为了进行检测，将高灵敏度的GaAsP 检测器与525/50 nm和700/75 nm（中心波长/带宽）发射滤光片组合在一起，用于绿色和红色通道，分别使用。

STED显微镜
在STED显微镜使用这个协议是自制的，并已进行了详细描述（皋等，2017）。此外，650纳米长通分色镜（ET700SP;色度，波纹管瀑布，VT）和需要时间相关的单光子计数（TCSPC）卡（SPC-150 ，德国柏林Becker＆Hickl GmbH）。

注意：方案中的实验是在640 nm激发和779 nm耗尽的条件下进行的；仅使用了用于普通2D STED成像的涡流相板。

软体类

使用Java 1.6.0_24的ImageJ Fiji版本2.0.0。
共聚焦显微镜软件：NIS-Elements图像采集和分析软件（尼康）
STED显微镜软件：我Mspector （马普创新GmhH ，慕尼黑，德国）
Matlab（MathWorks，马萨诸塞州内蒂克）
OriginPro 2015 32位（OriginLab，Northampton，MA）

程序

大肠杆菌转化（第1天：〜2.5小时，然后过夜孵育）
注意：我们建议在每次成像实验前进行新鲜转化，以确保mRNA-SiRA 正确表达。

将50 ng 质粒（pET -GFP 和pET-GFP-SiRA 5 ）加入每个高压灭菌的微量离心管中，并置于冰上。
在冰上融化化学感受态大肠杆菌BL21 Star TM （DE3）细胞15分钟。
40添加MYU 大号中大肠杆菌BL21 星TM （DE3）细胞到每个管中并孵育另外30分钟冰上。
将试管在42°C下加热45 s，然后在冰上孵育2分钟。
250添加Myueru 预温热（37℃）的LB培养基中向每管摇晃在650rpm下60分钟。
路径选择的细菌携带质粒，条纹20 MYU 大号的细菌在LB琼脂平板含有30中MYU ģ /毫升卡那霉素。
将LB琼脂平板在37 °C下孵育过夜。
注意：早晨，将琼脂平板置于4°C，并整天放置在那里。

诱导细菌中的mRNA表达（第2天：15分钟，然后进行过夜孵育；第3天：〜5 小时）
加入5毫升LB培养基中添加30 MYU 摹/ ml卡那霉素进入15毫升˚F 爱尔康并启动过夜培养使用一个单一的殖民地采摘从每个LB琼脂平板上使用无菌枪头。
所述孵育˚F 爱尔康在37℃下剧烈振荡以170rpm过夜。
第二天早晨，测量每个过夜培养物以1:10稀释的光密度（OD 600 ）。
起始培养物产生来自过夜培养。对于这一点，添加10ml的LB培养基中添加30 MYU ģ / ml卡那霉素在50毫升˚F 爱尔康并添加过夜培养，得到OD 600 为0.05。
在37°C和170 rpm摇动培养物，直到OD 600 达到0.35。
注意：这通常需要1.5-2小时。

通过加入10中诱导GFP MRNA的表达MYU 大号中IPTG（终浓度为1mM）并摇动培养另外3小时，在37℃下
注意：目前SiRA 系统仅用于高表达的GFP mRNA的成像。为了可视化较低的拷贝数，可以设计更多的串联重复序列，并且可能需要进一步优化方案（例如染料浓度）。

制备聚D- 赖氨酸涂层的玻璃室载玻片（第3天：〜3小时，与步骤B 5- B 6 平行）
注意：用于涂层的聚-D-赖氨酸溶液需要在每次将其添加到孔中之前新鲜制备。但是，聚-D-赖氨酸涂层的玻璃室载玻片可以提前24小时制备并保存放入6 °C 的冰箱中。建议在使用前将其加热至室温。

删除8孔Ibidi 玻片从包装并孵育每孔200 MYU 大号的10 1M KOH水溶液5分钟。
KOH溶液取下井很细心，把它们洗干净彻底多次使用400 MYU 大号无菌的MilliQ 水和空气晾干60分钟。
1000混合MYU 大号水与20 MYU 大号的聚- d -赖氨酸库存（〜50 MYU ģ / MYU 大号终浓度），并加入250 MYU 大号的溶液，快速加入每个孔中（食谱4个孔）。
在室温下孵育孔45分钟。
每口井洗两次用300 MYU 大号无菌的MilliQ 水和空气干燥至少30分钟前的固定化细菌。

制备大肠杆菌样品进行成像（第3天：〜1小时）
注意：对于活细胞成像实验，由于短的mRNA半衰期和细菌代谢，我们建议一次最多成像2个孔。

将每种培养物的200μl 等分试样（步骤B6）转移到高压灭菌的微量离心管中，并在室温下以5,600 x g 沉淀细胞2分钟。
除去LB培养基，并将细菌悬浮在1 ml M9成像溶液中（配方1）。
200添加MYU 大号细胞悬浮到每个孔中的经涂覆的8孔Ibidi 幻灯片。
在室温下孵育细菌35分钟，以使其粘附在表面上。
每个孔的洗涤轻轻地用400 Myueru 中M9成像解决方案。
300添加Myueru 中M9的成像解决方案包含500 NM 的硅罗丹明发荧光染料，直接准备用于映像。
注意：染料在37°C时会很快渗透到细菌中（5-10分钟）;因此，显微镜调整的时间足以进行孵育。如果出现渗透问题，则将染料/ M9成像溶液预热至37建议使用℃ 。

使用共聚焦显微镜对GFP-SiRA 5 mRNA 成像（第3天：〜1-2 小时）
打开488 nm（绿色通道）和640 nm（红色通道）激光以进行点扫描共聚焦显微镜的荧光照明，并分别将525/50 nm和700/75 nm发射滤光片用于绿色和红色通道。
将温度培养箱连接至显微镜，预热至37°C，然后将8孔载玻片和附着的大肠杆菌放入培养箱中。
亮使用场照明集中于被固定的大肠杆菌与尼康Ñ的Apo 60X NA 1.4 Ramuda 小号OI（WD为0.14mm，FOV 0.21 X 0.21毫米）目的，开始与PET-GFP-SiRA 5转化细胞。
为GFP和红色通道以及正确的z轴确定合适的曝光时间。选择设置以使像素不饱和但仍可获得最高的荧光信号。
采集所有通道的明场和荧光图像（图4）。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902664--1308 Murat Sunbul 791973 \图jpg \图4.jpg

图4. 使用共聚焦显微镜在活大肠杆菌中进行GFP mRNA成像的实例A. 成像实验中所用质粒的示意图荧光团与SiRA 适体的结合在显微镜的红色检测通道中产生荧光信号。 B. 大肠杆菌活细胞中GFP mRNA的免洗活细胞成像。用GFP质粒或GFP-SiRA 5 质粒转化细胞，并用明场，绿色（蛋白质表达）拍摄图像）和红信道（检测mRNA）。量表酒吧= 5 Myuemu。C.放大描述于图4B中的图像。量表酒吧= 5 Myuemu。

使用相同的显微镜设置，对带有对照质粒pET -GFP的大肠杆菌细胞重复步骤E3-E5 。
为了进行背景校正，我们使用Fiji / Image J图像分析软件，手动选择没有附着大肠杆菌细胞的表面积，并从整个图像中减去其平均荧光信号。

（可选的）调整的STED显微镜ë
通过扫描两个颜色通道中的检测到金珠（GC80），确保640 nm激发光束和779 nm耗尽光束的焦点在空间和时间上重叠。
首先，用6个50-nm长通二向色镜将反射/散射的激发和耗尽光束分成两束，然后通过780/10 nm（中心/宽度）和640的带通滤光片过滤这两束光/ 10 nm，直到被两个雪崩光电二极管（APD）检测到为止。
使用Imspector 软件同步扫描信号和光子检测间隔，从而生成没有光谱串扰的两通道图像。

注意：如有必要，需要稍微调整耗尽光束，以确保STED图像（具有类似甜甜圈轮廓的轮廓）的中心与激发图像（具有高斯轮廓）精确重叠。

检查激发和耗尽脉冲之间的时间重叠，然后使用时间相关的单光子计数（TCSPC）卡收集金珠反射的640 nm和779 nm反射光，并根据常见触发对其进行分类。可以在TCSPC软件的示波器显示模块中监控640 nm激发脉冲与779 nm脉冲之间的延迟。
注意：为了获得最佳的耗尽，可以使用一个延迟盒来调整激发脉冲和耗尽脉冲之间的延迟（在我们的示例中为200 ps左右），该延迟盒会将耗尽激光器的触发输出路由到激发激光器的触发输入。

成像深红色珠（第3天：〜1小时）
注意：暗红色珠子的图像用于确定STED显微镜的分辨率，应在样品制备之前或平行进行。

稀Fluosphere TM 40-NM暗红色珠（六百八分之六百六十零）从原料溶液进入PBS在体积比为1:10 4 。
200添加MYU 大号的溶液，其中的多晶硅- d -赖氨酸涂层成像房和孵育5分钟在室温下，以固定珠的表面。
盖玻片清洗两次，用250 Myueru 的MilliQ 水，最后加250 Myueru 的MilliQ 水成像。
将盖玻片放在显微镜载玻片架上。
调整激励功率向5- MYU W¯¯ 在样品和图片与耗尽激光以不同功率介于0 MW 为150 兆瓦。扫描的矩形区域10的X 10 MYU 中号2 带1 ，024 X 1 ，024像素，覆盖数十单个深红色珠子。
注意：为最大程度减少在同一区域进行多次扫描时的光漂白现象，建议在不同的STED激光强度下使用新鲜区域进行STED成像。

在共焦和STED模式之间生成可比较的图像（图5A）。在那里，通过共焦和STED显微镜对相同区域依次成像。
注意：通过改变耗尽功率，可以改变有效分辨率，如在耗尽束的不同功率下拍摄的珠子图像所示（图5B）。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902664--1308 Murat Sunbul 791973 \无花果jpg \图5.jpg

5.图暗红色的珠子图像A. 共聚焦（上左）和STED（右下）图像的荧光珠在玻璃盖玻片，显示出巨大的决议ENH Ancement由于STED成像。规模酒吧= 3 Myuemu 。B. 以耗尽束的不同功率拍摄的单个珠子的图像。

使用深红色珠子图像评估STED分辨率（第3天：〜1小时）
为了进行数据评估，为每个STED强度选择十个珠子。对于每个珠子，提取一条穿过珠子中心的线（具有单个像素宽度），并与高斯函数拟合。
注意：拟合产生的原始半峰全宽（FWHM r ）包括深红色珠子的尺寸（d 0 = 40 nm），然后可以将实际STED分辨率（FWHM）估算为（FWHM r 2 - d 0 2 ）1/2 。据统计10个珠，符号和误差条来图6A显示，分别为平均值和标准偏差半值宽度在每个STED强度理论曲线，其装配中。示范FWHM随着= FWHM 0 /（1 Tasu 赶马 我STED 2 ）1/2 ，描述了图像分辨率作为功能的STED力。在此，FWHM 0 是分辨率的共聚焦显微镜（枯竭梁关）， I STED 是耗尽束的强度，而γ 是取决于STED甜甜圈的斜率和耗尽束的饱和强度的系数（Harke等，2008）。

比较通过共聚焦（零耗尽功率）和40 nm磁珠的STED成像（150 mW 耗尽功率）获得的横截面强度分布（图6B）（示例图6A：高斯拟合的半峰宽（图6A中的实线）收率FWHM - [R = 339±11nm的共聚焦模式和50±3 Nm，用于STED模式。卸下暗红色小珠的大小，我们获得估计的拆分我们STED显微镜32±5nm以下。]

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902664--1308 Murat Sunbul 791973 \无花果jpg \图6 .jpg

图6. STED分辨率的确定A. 实心正方形：通过单个磁珠的横截面宽度的量化与耗尽激光功率的函数关系（见图5B）。对数据的固有尺寸进行了校正。红线：根据STED 理论与平方根函数拟合B. 在0和150 mW 耗尽激光功率下成像的单个磁珠的横截面（见图5））显示了STED显微镜所提供的巨大分辨率增强效果，高斯拟合以实线显示。

用STED显微镜对活大肠杆菌中的GFP -SiRA 5 mRNA进行成像（第3天：〜1-2 小时）
将温度受控的样品室连接到显微镜，预热至37°C，并添加在步骤E2中使用的8孔成像玻片。
功率设定激发和耗竭梁（实施例图7：励磁5 MYU w ^ ，折耗150 MW 。）扫描反复的正方形区域为10×10 MYU 中号2 ，覆盖一组大肠杆菌细胞，五帧1 ，024 X 1 ，024象素（象素驻留时间。在图7A：30 MYU 小号，主图像图7A对应于插图为t = 126 S）。
拍摄STED图像后，关闭耗尽激光并拍摄共聚焦图像（图7B）。
注意：在STED或共聚焦图像上均未进行反卷积，可将不同的颜色图用于STED和共聚焦图像以最佳地显示细胞结构。

D：\重新格式化\ 2020-2-7 \ 1902664--1308 Murat Sunbul 791973 \图jpg \图7.jpg

7. STED成像图活大肠杆菌细菌中表达GFP-SIRA 5 mRNA的表达。A.时间序列拍摄于31.5秒的间隔，总共126 S的STED图像;顶部：放大图像在126 S; B.正常共焦成像直接在STED时间序列之后拍摄。

资料分析

为了确定STED分辨率，需要使用多个珠子进行统计。在我们的实验中，针对每个STED强度选择十个单个珠子，以计算珠子的横截面强度分布来计算半峰全宽（FWHMr ）。图6A中的数据点和误差线显示了十个磁珠的平均值和标准偏差。
注意：为避免选择一串珠子（而不是单个DR珠子），当它们的横截面强度分布的拟合高斯振幅比平均振幅高1.5倍时，将其排除（并替换为新的选择）。

为了减少样品散焦对STED分辨率测定的影响，对于每个STED强度，均拍摄了两张图像（来自新的样品区域），并且每次都检查了样品的对焦位置，这为微珠提供了最大的亮度通常，从每个图像中选择五个小珠进行STED分辨率统计，但是，对于一个图像具有系统地大于另一个图像的FWHM（由于散焦）的情况，则从聚焦图像将仅用于FWHM分析。

菜谱

M9成像溶液（50毫升）
5x M9盐肉汤的制备：
26.25克添加M9肉汤粉末的[Na 2 HPO 4 （15克），KH 2 PO 4 （7.5克），氯化钠（1.25克），NH 4 氯（2.5克）]到1000ml PYREX ® 玻璃瓶
加入500 ml MilliQ 水，充分摇晃并检查pH值（在37°C时为7.4）
带有标准液体程序的高压灭菌器
注意：此5x M9混合物可以在RT上存储。

填充将10ml 5×M9成一个50毫升˚F 爱尔康和补充用250溶液微升的硫酸镁4 （1M的母液，5mM的终浓度），5 微升的CaCl 2 （1M，股票，100 亩中号终浓度） 500和Myueru 葡萄糖（40 Pasento股票，终浓度0.4 Pasento）
填充˚F 爱尔康到了50毫升的MilliQ 水和过滤，消毒解决方案之前，将其用于成像实验
注意：另外，成像实验也可以在购自赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）的活细胞成像溶液中进行，并如上所述补充镁和葡萄糖。

致谢

而MS AJ 是支持由德国研究联合会（格兰特＃Ja794 / 11-1）和喷枪由亥姆霍兹联合会（计划科技纳米系统）和卡尔斯鲁厄学校光学和光子学（KSOP）。该协议获得通过从我们之前发表的作品（Wirth 等，2019）。

Ç Ompeting兴趣

作者声明没有竞争性的经济利益。

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