材料和试剂

P ipette提示
Cuvettes（Bio-Rad，目录号：1652083）
培养皿（Greinerbio -one，目录号633180）
玻璃巴斯德移液器（Fisher Scientific，目录号：FB50261）
尼龙膜（罗氏（Roche），目录号：11417240001）
X射线胶片（Fujifilm）（Fisher Scientific，目录号：12735325）
50 ml锥形离心管（Corning，目录号：10038980）
菌株（表1）
质粒（表1）
注意：模块化质粒可以从CHAINbiotools （http://clostron.com/pMTL80000.php）获得。

底漆（表2）
PBS片剂（Sigma，目录号：P4417）
氯苯丙泊酚（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）储液10 µg / ml，储存在
-20°C
HindIII 限制性核酸内切酶（NEB，目录号：R0104S）
Wiza rd基因组DNA纯化试剂盒（Promega，目录号：A1120）
DIG High Prime DNA标记和检测入门工具包II（Roche ，目录号：11585614910）
PCR试剂（的Taq 聚合酶试剂盒生物在线，目录号：BIO-21040和的dNTP Promega公司，Ç atalog号：U1240）
磷酸氢二钾，K 2 HPO 4 （Fisher Scientific，目录号：P / 5240/53）
磷酸二氢钾，KH 2 PO 4 （Fisher Scientific，目录号：P / 4800/60）
硫酸铵（NH 4 ）2 SO 4 （Fisher Scientific，目录号：A / 6480/53）
氯化钠，NaCl（Fisher Scientific ，目录号： S / 3160/53）
硫酸镁MgSO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
氯化钙C aCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
醋酸（Fisher Scientific，目录号：A / 10400 / PB17）
丙酸（Sigma-Aldrich，目录号：P1386）
正戊酸（Sigma-Aldrich，目录号：V9759）
异戊酸（Sigma-Aldrich，目录号：I7128）
异丁酸（Sigma-Aldrich，目录号：I1754）
生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501）
钴胺素（Sigma-Aldrich，目录号：V2876）
对氨基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9878）
叶酸（西格玛奥德里奇，产品目录号：F7876）
吡rid胺（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
氢氧化钾，KOH（Sigma-Aldrich，目录号：P5958）
乙醇95％（Fisher Scientific ，目录号：E / 0650DF / 17）
Haemin （Sigma-Aldrich，目录号：H5533）
Bacto 胰蛋白（（BD诊断系统，目录号：211705）
酵母提取物（BD诊断系统，目录号：212750）
氯化钾，KCl （Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
六水合氯化镁，MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma -Aldrich，目录号：M9272 ）
七水硫酸镁，M gSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：230391）
Bacto casitone （BD Diag nostics Systems，目录号：225930）
碳酸氢钠NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S576 1 ）
葡萄糖（Fisher Scientific ，目录号：G / 0500/53）
可溶性淀粉（Sigma-Aldrich，目录号：S2004）
纤维二糖（Sigma-Aldrich，目录号：C7252）
刃天青（Sigma-Aldrich，目录号：R2127）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C1276）
硫胺（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：R9504）
混合气10％二氧化碳，10％氢气平衡氮气（厌氧）气瓶（BOC，货号：290564-L）
琼脂（Oxoid ，目录号LP0011）
刃天青溶液（参见配方）
厌氧磷酸盐缓冲盐水（PBS）（请参阅食谱）
矿物质溶液1（请参阅食谱）
矿物质溶液2（请参阅食谱）
短链脂肪酸溶液（请参阅食谱）
维生素溶液1（请参阅食谱）
维生素溶液2 （请参阅食谱）
海敏解决方案（请参阅食谱）
SOC（请参阅食谱）
LB （请参阅食谱）
洛杉矶（请参阅食谱）
YCFAGSC和AMM （请参阅食谱）

设备

移液器Gilson P1000（Gilson，目录号：F123602）
移液器Gilson P200（Gilson，目录号：F123601）
移液器Gilson P20（Gilson，目录号：F123600）
移液器Gilson P2（Gilson，目录号：F144801）
Ruskin n Technology的Concept Plus厌氧工作站
的Hungate 管（Sciquip ，目录号：2047-00125）
饥饿的盖子丁基橡胶隔垫（Sciquip ，目录号s ：2047-11600和2047-16000）
惠顿瓶（默克（Merck），货号：33110-U）
CO 2 钩（内部制备）和CO 2 p IPED气体供给
摇动大肠杆菌生长培养箱（三洋轨道培养箱）
厌氧菌静态培养箱（Sciquip incu-160S）
基因脉冲发生器（Bio - R ad，型号：1652078）
平台摇臂（Stuart，型号：STR6）
紫外线接头，Bio - R 和GS基因接头紫外线室（UVP CL-1000紫外线交联剂）
杂交仪（UVP实验室产品HB 1000杂交仪）
印迹转移泵（Hybaid Vacu 辅助印迹处理泵，DA7C.VAC / T）
离心机（Jouan MR1822）
透（UVtec BXT-20.L）

程序

将质粒电穿孔到大肠杆菌CA434中
将1毫米电穿孔试管在冰箱中预冷过夜。
在4 µl dH 2 O（终浓度2 µg / ml）中稀释1 µl质粒溶液（10 µg / ml）。
在冰上解冻55 µl具有电感受态的大肠杆菌CA434（按照标准协议在室内制备，https： //www.protocols.io/view/Making-your-own-electrocompetent-cells-imsv6m ），然后加入质粒溶液，轻轻混合。
将混合物转移到比色杯中，并置于Gene Pulser中。
在1.8 kV，200欧姆，25 µF时进行电穿孔。
转移至1 ml SOC介质中，预热至37°C。
在37°C，200 RPM下孵育1小时。
稀的无菌卫生署2 在10倍稀释ø （10 1 ，10 2 和10 3 ）。
将这些稀释液的50 µl 分散在补充有10 µg / ml氯霉素（Cm10）的LA平板上（请参阅R ecipes），并在37°C下孵育24 h或直至出现菌落。
将单个菌落挑入LB Cm10中，并在37°C，200 RPM下孵育24 h 。

受体细菌的厌氧培养
将肉汤中的厌氧培养基YCFAGSC和AMM制成7.5毫升等分试样在Hungate 管中，用丁基橡胶隔垫和2％琼脂溶液密封，在Wheaton瓶中分成100毫升等分试样，所有分配和接种均采用Hungate 技术在CO 2 下进行于1972年由科比（Bryant）所描述（图1）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902849--1348 Karen Scott 810703 \ Figs jpg \ figure 1 .jpg

图1. 使用Hungate方法（管中生长）和厌氧工作站（在Petri板上生长）培养严格厌氧的细菌

厌氧孵育在37℃下YCFAGSC液体培养物，在不搅拌的Hungate 管中。
在使用前大约24小时，将厌氧琼脂培养基倒入厌氧工作站（混合气体CO 2 ：N 2 ：H 2 ，比率7：11：2）内的陪替氏培养皿中（每板20 ml），使琼脂适应厌氧气氛。
在厌氧工作站中于37°C孵育厌氧琼脂培养物。

马丁克供体的E. 大肠杆菌CA434和受体细菌
准备7.5毫升受体的过夜培养。表1描述了供体，受体和质粒。

表1.菌株和质粒

菌株/质粒

相对特征

来源/参考

菌株

真杆菌rectale A1-86

丁酸产生，严格的的厌氧菌毛螺法米尔ÿ 。

（Barcenilla et al。，2000）

真杆菌rectale T1-815

（Barcenilla et al。，2000）

玫瑰蔷薇A2-194

（Duncan et al。，2006）

真杆菌rectale EAM3

E. rectale A1-86 窝藏pMTL83151

（Sheridan et al。，2019）

真杆菌rectale ETM3

E. rectale T1-815 窝藏pMTL83151

（Sheridan et al。，2019）

真杆菌rectale ETBglu

E. rectale T1-815 窝藏pMTL3β- 谷氨酸

（Sheridan et al。，2019）

玫瑰蔷薇（Roseburia inulinivorans）RAM2

R. inulinivorans A2-194 窝藏pMTL82151

（Sheridan et al。，2019）

玫瑰蔷薇（Roseburia inulinivorans）RAM3

R. inulinivorans A2-194 窝藏pMTL83151

（Sheridan et al。，2019）

大肠杆菌CA434

共轭捐献者。基因型：HB101（THI-1 hsdS20（R- 乙，间- 乙）supE44 利甲ARA-14 leuB5proA2 lacY1的的galK rpsL20 （STR - [R ）XYL-5 MTL-1 ）携带R701（茶+，MOB +接合质粒）

（Williams 等，1990）

质粒*

pMTL82151

ColE1，cat P ，tra J ，MCS和pBP1

（Heap 等，2009）

pMTL83151

ColE1，cat P ，tra J ，MCS和pCB102

（Heap 等，2009）

* pBP1，pCB102，pCD6和pIM13（这些质粒的复制子）。ColE1（革兰氏阴性复制子），catP （氯霉素抗性基因），traJ （转移起点）和MCS（多个克隆位点）。

Inoculat Ë施主E. 大肠杆菌CA434在40毫升LB CM10的50 毫升锥形离心管中，并培育在37℃，200 RPM过夜。
离心供体以1200 × g 过夜培养10分钟。
倒出上清液，并将沉淀重悬于20 ml厌氧PBS中。
再次以1200 × g的速度离心供体10分钟。
在厌氧柜中倒出上清液。
将受体细菌的过夜培养物（按步骤B1和B 2 所述生长）转移到厌氧柜中。
将供体沉淀物在厌氧柜中的1 ml受体过夜培养物中重悬。
在AMM琼脂平板的中心点取100 µl该溶液，并在37°C的厌氧箱中孵育48 h。
用无菌环将AMM板中心的混合混合物刮擦掉，并悬浮在500 µl厌氧PBS中。
将50 µl此溶液铺在添加了5或7.5 µg / ml氯霉素的YCFAGSC平板上，并在37°C下厌氧孵育直至出现菌落（通常48至96 h）。
Restreak 唱在补充有5或7.5新鲜YCFAGSC板乐菌落微克/ ml氯霉素和孵化厌氧在37℃至单菌落出现。孵育可能需要3天。
所述的图解表示优化在图2中所示的缀合协议。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902849--1348 Karen Scott 810703 \ Figs jpg \ figure 2 .jpg

图2 详细的的示意图优化用于缀合协议罗斯氏inulinivorans 和真杆菌rectale 。补充5或7.5 µg / ml氯霉素（Cm5或Cm7.5）。

验证推定的共轭物
优良作法是进行各种测试以确认转导结合剂的有效性。一些简单的测试可以轻松消除不是转导结合体的细菌，并且可以节省时间和费用。

在37°C的AMM琼脂上有氧孵育假定的转导结合剂。受体细菌不能有氧生长，而供体大肠杆菌将生长。
使用标准程序进行克染色。球菌是肠道微生物学中的常见污染物，通过革兰氏染色很容易将其与杆状Roseburia 和真细菌区分开来。
PCR扩增直接16S rRNA基因从使用通用细菌16S rRNA基因的引物和FD1 RP2（表2）（退火温度菌落或液体培养。52℃），产生1的扩增子，495 bp的。表3提供了P CR扩增条件。

表2.底漆

底漆

顺序（5'-3'）

目标

参考

PS＃MTL-用于

TATCTATGATACCGTGGTCAAC

pMTL80000系列质粒

（Sheridan et al。，2019）

PS＃MTL-rev

CTGCTGAAGCCAGTTACC

pMTL80000系列质粒

（Sheridan et al。，2019）

FD1

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

完整的16S rRNA基因

（Wood 等，1998）

RP2

ACGGCTACCTTGTTACGACTT

完整的16S rRNA基因

（Wood 等，1998）

519R

GWATTACCGCGGCKGCTG

16S rRNA基因（通用）

（Turner 等，1999）

926F

ACTCAAAGGAATTGACGG

16S rRNA基因（通用）

（Muyzer et al。，1995）

核苷酸代码：鸟嘌呤（G），腺嘌呤（A），胸腺嘧啶（T），胞嘧啶（C），腺嘌呤或胸腺嘧啶（W）和鸟嘌呤或胸腺嘧啶（K）

表3. PCR方案

温度

时间

初始变性

94°摄氏度

5分钟

25个循环

95°摄氏度

30秒

取决于底漆

30秒

72°摄氏度

2分钟

最后扩展

72°摄氏度

8分钟

保持

4 °摄氏度

用引物519R和926F对所得扩增子进行Sanger测序（表2）。
BLASTn 针对NCBI 16S rRNA基因数据库查询每个序列，以确认身份。
通过扩增所有模块化质粒共有但在受体染色体中不存在的核苷酸序列，确认推定的转接合子中质粒的存在。PS＃MTL-for和PS＃MTL-rev引物（表2）（退火温度60°C）可扩增一个514 bp的区域，其中包含cat P 基因和ColE1革兰氏阴性复制子的片段。
预期结果和评论在表4中描述。

表4.假定的超偶联物的验证程序

确认书

预期结果

评论

革兰氏染色

没有污染

粉色或紫色杆菌

革兰氏染色很容易将常见的污染物（例如球菌）与玫瑰菌和真细菌区分开。

16S rRNA基因测序

没有污染

与受体DNA匹配

质粒特异性PCR

质粒的存在

514 bp扩增子

收件人染色体缺少DNA的扩增区域

无氧培养

捐助者缺席

无氧生长

收件人需氧菌不能有氧生长

南方印迹

自主复制

与线性质粒大小相同的单条带

染色体插入会改变探针杂交带的大小

通过Southern印迹验证自主质粒复制
按照制造商的说明，使用向导基因组DNA纯化试剂盒从转导结合物中提取DNA。
在37°C下用HindIII 消化1 µg提取的DNA 3小时，以产生各种大小的限制性片段。
注意：HindIII 仅将质粒切割一次，得到一个线性片段，而对基因组DNA的限制则产生了各种大小的片段。

通过凝胶电泳按大小分离限制性片段（0.8％琼脂糖，TBE）。
用透照器为凝胶图像拍照，以促进最终印迹中的大小推断。
在去纯化溶液（0.25 M HCl）中轻轻摇动凝胶7分钟，并在ddH 2 O（双蒸馏水）中冲洗。
在变性溶液（0.5 M NaOH，1.5 M NaCl）中轻轻摇动凝胶30分钟三遍，并在ddH 2 O中冲洗。
在中和溶液（0.5 M Tris-HCl [ pH 7.4 ] ，3 M NaCl）中轻轻摇动凝胶30分钟，三遍，并在ddH 2 O中冲洗。
使用Hybaid印迹仪（1.5 h）和UV交联将DNA从凝胶转移到尼龙膜上。
通过用HindIII 和ApaLI 消化pMTL83151来创建探针。这将产生两个片段（〜3 ，000 bp和〜1 ，500碱基对），其中较小的特定于区域共用于所有的质粒的，但非p 重新发送在受体染色体。凝胶纯化较小的片段，并用作探针模板DNA。
按照制造商的说明，使用DIG High Prime DNA标记和检测入门工具包II进行Southern印迹分析。
通过将膜暴露于X射线胶片来可视化杂交带。

该协议使得能够自主复制转移到质粒中的建立和验证罗斯氏inulinivorans 和真杆菌rectale ，将在通过遗传操作调查这些重要生物体的生物化学和生理学提供的必要工具。

菜谱

刃天青溶液
将100 mg刃天青粉加入100 ml ddH 2 O中

厌氧磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将PBS片剂溶于1 L的ddH 2 O中，并加入1 ml刃天青溶液
将溶液放入沸水浴中15分钟
100％CO 2的气泡溶液，直到液体从紫色变为澄清
在Wheaton瓶中分装100毫升等分试样
矿物质溶液1
K 2 HPO 4 3.0克

ddH 2 O 至1 L

存放在4 °C

矿物质溶液2
KH 2 PO 4 3.0克

（NH 4 ）2 SO 4 6.0克

氯化钠6.0克

硫酸镁4 0.6克

氯化钙2 2 0.6 g

ddH 2 O 至1 L

储存在4 °C

短链脂肪酸溶液
醋酸17毫升

丙酸6毫升

正戊酸1毫升

异戊酸1毫升

异丁酸1毫升

储存在4 °C

维生素溶液1
生物素1毫克

钴胺素1毫克

对氨基苯甲酸3 mg

叶酸5毫克

吡rid胺15毫克

ddH 2 O 至100 ml

储存在-20 °C

维生素溶液2
硫胺素5.0毫克

核黄素5.0毫克

ddH 2 O 至100 ml

海敏解决方案
KOH 0.28克

乙醇95％25毫升

Haemin 100毫克

ddH 2 O 至100 ml

储存在4 °C

SOC
Bacto 胰蛋白2 2克

酵母提取物0.5克

氯化钠200μ升的5M的

氯化钾250 μ 升1M的

ddH 2 O至100 ml

搅拌溶解，高压灭菌，然后冷却至室温
加入1 ml无菌过滤器2 M Mg储备溶液（1 M MgCl 2· 6H 2 O和1 M MgSO 4 ·7H 2 O ）的最终浓度为20 mM
使用前，每1毫升SOC 添加20微升1 M无菌葡萄糖
磅
Bacto 胰蛋白1 1克

酵母提取物0.5克

氯化钠1克

Deioni ž 编ħ 2 ö 至100毫升

洛杉矶
Bacto 胰蛋白1 1克

酵母提取物0.5克

氯化钠1克

琼脂1.5克

Deioni ž 编ħ 2 ö 吨ö百毫升

YCFAGSC和AMM
细菌培养用酪蛋白胨10.0克

酵母提取物2.5克

NaHCO 3 4.0 克

葡萄糖2.0克

可溶性淀粉2.0克

纤维二糖2.0克

矿物质溶液1 150.0毫升

矿物质溶液2 150.0毫升

海敏溶液10.0毫升

维生素溶液1（高压灭菌前）1.0毫升

维生素溶液2（高压灭菌后）1.0毫升

刃天青1.0毫升

L-半胱氨酸1.0克

用醋酸（0.7 ml）制成AMM或用短链脂肪酸溶液（3.1 ml）制成YCFAGSC

在这些食谱中添加20克琼脂，制成AMM或YCFAGSC琼脂

蒸馏水至1 L

致谢

该Rowett 研究所（阿伯丁大学）接收来自苏格兰政府农村和环境科学和分析服务（RESAS）的资金支持。该协议是由“异源基因表达在人肠道细菌发表在工作衍生真杆菌rectale 和罗斯氏inulinivorans 通过接合质粒的手段”厌氧菌59：131-140（2019）（谢里登等人，2019 ）。

利益争夺

作者指出没有利益冲突

参考文献

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