材料和试剂

P ipette提示
1.5毫升Eppendorf管（Eppendorf Safe-Lock，货号：022363204）
Steritop 0.22 微米过滤装置（Millipore 的Millex -GP，目录号：SLGP033 RB ）
平底聚苯乙烯96 - 孔细胞培养板，0.2毫升公体积（康宁，Costar公司? ，目录号：3599）
玻璃培养管20 mm x 150 mm（通过高压灭菌器灭菌）
50 ml玻璃锥形烧瓶（高压灭菌）（中国牛市）
大肠杆菌XJ141026 （西京医院分离）
注意：也可以使用其他类型的大肠杆菌。

Luria–Bertani（LB）汤汁（BD / Difco ，目录号：244620）
N-苯基-1-萘胺（NPN）（Sigma-Aldrich，目录号：104043）
碘化丙啶（PI （Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
Thanatin（合成和纯化至98％以上）
注意：通过应用如前所述的Fmoc （9-芴基甲氧羰基）活性酯化学方法，通过固相法合成了他纳汀（Fehlbaum et al。，1996）。也可以使用实验者选择的其他AMP代替thanatin。

葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270 ）
1 M HEPES溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
10X PBS股票（Life Technologies公司，GIBCO ? ，目录号：70011-044）
甲cetone （Sigma-Aldrich公司，目录号：650501 ）
的Milli-Q 过滤器ED 水（DDH 2 O）
5 mM HEPES和5 mM葡萄糖缓冲液（pH = 7.2）（请参阅食谱）

设备

移液器
小号克竞保温箱（志成，型号：ZHWY-200D）
小号tatic孵化器（泰斯特仪器，型号：DH4000BII）
中号icroplate分光光度计（BioTek的，型号：PowerWave的HT）
台式离心机（Hanil Science Industrial，型号：Smart R17）
?F luorescence分光光度计（日立，型号：F-2500）
水净化系统（Millipore，型号：Milli-Q Advantage A10）
路径长度为1厘米的Q uartz比色皿（Starna Cells，目录号：3-Q-10）

软件

第五代（美国Biotek ）
FL Solutions 2.0 （日本日立）
Excel 2016（Microsoft，美国）
棱镜8 .0（美国GraphPad ）

程序

膜渗透性测定的样品制备
在玻璃培养管中将大肠杆菌XJ141026 的单个菌落接种到5 ml LB肉汤中，并将其在振荡培养箱中以2 2 0 rpm在37°C 下孵育过夜。
取0.1 ml 大肠杆菌XJ141026培养物的固定生长期，并在50 ml玻璃锥形烧瓶中接种10 ml LB肉汤。使培养物在37°C 和2 2 0 rpm下生长12 h 。
100添加微升的LB肉汤，以8个孔的96孔的微量滴定板。传送1 0 0 微升的培养物以第一井，并在LB进行连续的两倍稀释液（100的最终体积微升每孔）。确定OD 6 0 0 的经由微孔板分光光度计以及每个。
根据上述系列OD 6 0 0 值计算稀释倍数。稀释剩余的培养物的一部分，以OD 6 0 0 = 0.1 （通过使用与样品体积微孔板分光光度计测定1 0 0 微升）在LB肉汤以获得40毫升稀释的细菌悬浮液。
转移稀释细菌悬浮液中，以2个50ml的玻璃锥形瓶中，每组15毫升。
加入12 微升的1 ，000 μM 的泛素（溶解于无菌PBS中）至15毫升细菌悬浮液，其中的最终浓度之一死亡素是0.8 μM 。将等体积的无菌PBS （pH = 7.2）加入另一个烧瓶中，并用作未处理的对照。充分混合并在37 °C 和220 rpm下生长。
分别在0、30、60、120、180和240分钟的不同时间间隔收集经坦那坦处理和未经处理的培养物的样品。对于每个组，2毫升培养物收集和分开添加在到2支1.5毫升的微量试管，加入1ml每管。
P ellet 吨他细胞在8935 X 克1 0 在1.5ml Eppendorf管分钟，并除去上清液。
通过重悬于1 ml 5 mM HEPES和5 mM葡萄糖缓冲液（pH = 7.2）中洗涤细胞，并通过以8,935 xg离心5分钟离心沉淀细胞。除去上清液。
重复步骤A9两次。
在1 ml 5 mM HEPES和5 mM葡萄糖缓冲液（pH = 7.2）中重悬细胞。

外膜通透性
为了确定出的ER膜渗透性死亡素，添加8 微升500 μM NPN（溶解在一cetone ）至1 ml的[R esuspend 编细胞（A11）和涡流井。
在室温下于黑暗中孵育30分钟。
打开荧光光谱仪，让灯预热30分钟。
如下定义光谱仪的工作参数：光电倍增管（PMT）电压：700 V，激发波长：350 nm，发射波长：420 nm。
注意：PMT电压设置取决于机器和样品。为了防止荧光信号值超出测量范围，必须在开始一系列实验之前为实验确定适当的PMT电压。要设置适当的PMT 电压，在实验的最后一个时间点收集和染色经抗菌剂处理的细菌，使用不同的PMT电压s 检测荧光信号，并选择最佳的PMT电压以最大程度地放大检测器中的信号范围。

用水和乙醇小心清洁荧光比色杯。
将1 ml培养的培养物转移到比色杯中，并将其放入光谱仪中。
开始数据采集和记录。

内膜通透性
要确定的内膜渗透性死亡素，添加5 微升1mM的的PI （溶解于无菌DDH 2 O），以1 ml的为r的esuspend ED 细胞（A11）。
我在黑暗中于室温下孵育30分钟。
如下定义光谱仪的操作参数：PMT电压：700 V，激发波长：535 nm，发射波长：617 nm。
用水和乙醇小心清洁荧光比色杯。
将1 ml培养的培养物转移到比色杯中，并将其放入光谱仪中。
开始数据采集和记录。

数据分析

独立地重复实验三遍。
将所有检测到的值导入到GraphPad Prism 8.0中以图形方式对其进行可视化。如图1所示，时间和相对荧光强度分别在x轴和y轴上进行了描述，并对未处理的对照组与经唐宁处理的组进行了比较。
ü 知的双因素ANOVA 吨?分析不同组之间的数据。
OM完整性通过Thanatin基因以时间依赖的方式损坏，并且在荧光强度明显增加的NPN 观察到1个小时后的培养（图URE 1A）。
孵育后约2小时，PI的荧光强度增加表明细菌的IM渗透性增加（图1B ）。
基础荧光（图1中的对照组）也随时间增加，这可能是由于衰老和死亡细菌的数量随培养时间的增加而增加。因此，通过在每个时间点减去相应对照组的荧光值，将唐那汀处理组的最终荧光数据归一化（图2）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902939--1307郑厚821825 \ Figs jpg \图1.jpg

图1. 通过检测NPN（A）和PI（B）的荧光强度来测量thanatin （Tha ）的内外膜通透性。所有数据均显示为三个独立实验的平均值±SEM 。通过双向方差分析确定P 值；*** 与未处理的对照相比，P <0.001 （Ma 等，2019）。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902939--1307郑厚821825 \ Figs jpg \图2.jpg

图2 。通过在归一化后检测NPN（A）和PI（B）的荧光强度来测量坦那汀的外膜和内膜通透性。所有数据均显示为三个独立实验的平均值±SEM 。通过单向方差分析确定P 值；*** P ＜0.001 。

菜谱

5 mM HEPES和5 mM葡萄糖缓冲液（pH = 7.2）
用ddH 2 O （pH = 7.2）将 1 M HEPES溶液稀释至5 mM HEPES

将90.08 mg葡萄糖溶于100 ml 5 mM HEPES（pH = 7.2）

消毒使用0.22 微米过滤器

致谢

该协议改编自以前的工作（Ma 等，2016a；Ma 等，2019）。感谢徐秀丽和周珊为西京医院临床检验医学科提供的临床菌株。这项工作得到了中国国家自然科学基金（No. 81673477、81903671、81471997和81001460）的资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Fehlbaum ，P.，Bulet ，P.，Chernysh ，S.，Briand，JP，Roussel，JP，Letellier ，L.，Hetru ，C.和Hoffmann，JA（1996）。thanatin的结构活性分析，thanatin是一种21残基可诱导的昆虫防御肽，与青蛙皮肤抗菌肽具有序列同源性。PROC国家科科学院科学USA 93（3）：1221至1225年。
克里希纳穆尔蒂，M.，Lemmon的，MM，Falcinelli的，EM，桑迪，RA，Dootz ，JN，莫特，TM，Rajamani ，S.，Schaecher ，KE，Duplantier ，AJ和潘卡尔，RG（2019）。使用非抗生素药物增强多粘菌素的抗菌活性。感染抗药性12：1393-1405。
马斌，方成，陆琳，王明，薛雪，周艳。，李敏，胡彦，罗雪，侯正（ 2019）。抗菌肽thanatin破坏细菌外膜并使NDM-1金属β-内酰胺酶失活。Nat Commun 10（1）：3517。
Ma B.，Niu，C.，Zhou，Y.，Xue，X.，Meng，J.，Luo X. and Hou，Z.（2016a）。肽thanatin的二硫键由于其在体内和体外的抗菌活性是必需的。抗微生物剂Chemother 60（7）：4283-4289。
Ma L.，Wang，Y.，Wang，M.，Tian，Y.，Kang，W.，Liu，H.，Wang，H.，Dou，J. and Zhou，C.（2016b）。源自cathelin样域的Cbf-14对耐青霉素的细菌的有效抗菌活性。生物材料87：32-45。
Yarlagadda，V.，Manjunath，GB，Sarkar，P.，Akkapeddi，P.，Paramanandham，K.，Shome，BR，Ravikumar，R.和Haldar，J.（2016）。糖肽抗生素可以克服革兰氏阴性细菌的内在抗性。ACS 传染病2（2）：132-139。