材料和试剂

对于皮肤移植方案
口罩（Lyreco，目录号：5965655）
棉签（Carl Roth GmbH，目录号：31025060）
Hansaplast手指胶条（Beierdorf AG，目录号：76861）
组织丙烯酸组织胶（Braun，目录号：1050052）
Leukotape classic，2 cm x 10 m（BSN Medical SAS，Ref：02204-00）
无菌纱布，5 x 5厘米，8层（MaiMed GmbH，目录号： 21010）
组织培养皿10 cm，60.1 cm 2 （Huberlab ，目录号：7.633102）
保暖垫（Solis AG，223型）
具有25 G针的1 ml注射器或胰岛素注射器（BD，货号：305501）
加热垫（带有加热块的手术台； MD耗材，目录号：4507-1 /）
棉签（Schaffhauser ，目录号：P0-15117601）
小鼠（H2-bm12 ）（H-2 bm12 ，McKenzie 等，1979）和C57Bl / 6
用于安乐死的CO 2
湿食物（100克干食物在室温下与200毫升饮用水O / N 孵育，将30毫升混合物放在每个笼子的培养皿中）（KLIBA，3436 EXF12 M / R EXTRUDAT）
Betadine标准溶液（Mundipharma ）
达法尔根（UPSA，布里斯托尔·迈尔斯· 斯奎布（Bristol Myers Squibb SA），1340235）
PBS，磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4（Invitrogen，目录号：10010015）
Temgesic，丁丙诺啡，0.3 mg / ml（ESSEX Chemie AG，ATC N02AE01号）
凡士林（Vifor SA）
异氟烷（Attane ，SKU：RXISO-250）
维生素A （Blache ，目录号：1667290 ），5克，博士伦，用于老鼠眼的兽医药膏
100％乙醇，供应商（Sigma，目录号：02890）
胎儿小牛的血清（FCS）（PAA，目录号：A15-101）
含扑热息痛的糖浆（Bristol-Myers Squibb，DAFALGAN Sirup ，30 mg / ml）

用于器官分析
具有25 G针的1 ml注射器或胰岛素注射器（BD，目录号：305501）
网格目（钢/尼龙，Sefar公司AG，目录号：3053-0201-100-00）
纽鲍尔室（品牌，目录号：718605）
培养皿94 x 16毫米（润滑脂，目录号：633102）
15 ml管（Sarstedt ，目录号：62.554.502）
5毫升柱塞（Omnifix ，目录号：4616057V）
5毫升facs 管（Falcon，目录号：352008）
96 - 孔板培养U型底未处理（VWR，351177隼，734-0955）
活/死标记（Invitrogen，目录号：L10119）
2％EDTA（Sigma，EDS-100g）
ACK缓冲液（155毫摩尔NH 4 氯，10mM的KHCO 2 ，1 毫摩尔EDTA，pH 7.4）中以用于在器官RBC裂解
水族DEST 。10X BD FACS裂解溶液（BD Biosciences公司，目录号：349202 ）（稀带水上DEST ）用于RBC血
FACS缓冲液（PBS，2％FCS，5 mM EDTA）
台盼蓝染色（0.4％，Gibco，目录号：15250-061）
FACS抗体列出了可以使用的专家组实例：
CD3（克隆145-2C11，Biolegend ，目录号：100308）

CD4（克隆RM4-5，Biolegend ，目录号：100512）

CD8（克隆53-6.7，Biolegend ，目录号：100738 ）

CD19（克隆6D5，Biolegend ，目录号：115508）

Gr1（克隆RB6-8C5，Biolegend ，目录号：108425）

CD62L（克隆Mel-14，Biolegend ，目录号：104412）

CD44（A20克隆，Biolegend ，目录号：103030）

CD11b（克隆M1 / 70，Biolegend ，目录号：101236）

CD80（Clone 16-10A1，Biolegend ，目录号：104702）

CD86（克隆GL-1，Biolegend ，目录号：105010）

设备

皮肤移植方案的手术器械
窄型钳（FST，货号：11003-12 ）
精细虹膜剪弯曲（FST，目录号：14095-11 ）
精细虹膜剪刀（FST，货号：14094-11 ）
梅奥剪刀（FST，货号：14010-15 ）
动脉剪刀球头11.5厘米（FST，货号：14080-11 ）
组织钳（FST，货号：11021-14 ）
碳钢，20号外科手术刀片（Swann-Morton LTD，目录号：3006）
手术刀片手柄（Swann-Morton LTD 20，Milian ，目录号：132620SW）

对于皮肤移植方案
电动剃须刀（Moser Classic A，Barthaar ，目录号：1040.0460）
耳钳（FST，货号：24212-01）

用于器官分析
BD FACS Canto II细胞计数器，IC / NO：0000031701
真空泵（KNF Neuberger，货号：N816.3KN.18）
软件

FlowJo 软件（LLC，BD（Becton，Dickinson＆Company，https：//www.flowjo.com/）
BD FACSDiva 软件（版本8.0.1，固件版本1.49 BD FACSCanto II）

程序

注意：对于所有程序，应从适当的动物使用委员会获得批准。

第一部分：尾巴皮肤移植

Ñ ø TE ：执行所有步骤S作为无菌越好。参考文献：Schmaler等。（2014年）; Jayachandran 等。（2019 ）。

手术准备
所有器械和材料（手术设备，棉签，纱布）均应高压灭菌。

制备并且如所提到组织器械和材料材料和试剂部A1- 甲22 和设备部分A1- 甲8，B1- B2 以及转弯麻醉上美孚单元（图1A）和预热加热垫（图1B ）。
打开指带绷带，在伤口垫上涂凡士林（使用棉签确保纱布被遮盖）（图1C）。
准备每只小鼠10-15厘米白带（图1D）。
辖镇痛：丁丙诺啡0.05毫克/千克体重腹膜内施用在100的体积使用胰岛素注射器柱在PBS中稀释μ 升（！称量小鼠），以确保镇痛手术后立即。

图1. 手术材料的准备。为皮肤移植手术准备的手术装置：麻醉移动装置（A）和保暖垫（B）。所述Hansaplast 膏药涂有凡士林在用棉签（C）非粘结区域。准备10-15厘米的白带条（D）。

移植尾皮的制备
供体小鼠[ 例如，H2-BM12（H2 BM12 ）（McKenzie的等人，1979 ）] 通过CO安乐死2 窒息。
用70％乙醇消毒尾巴。
将动物放在尾端黑色条纹朝下的手术板上。沿中线纵向解剖尾巴（此处标记有一个标记，以便于查看图2A）。
在尾巴的近端做一个圆形切口，从近端到远端只做一个涉及皮肤层的浅表切口。
使用组织钳从近端部位（见圆形切口（图2B）到远端（图2C））剥离尾巴皮肤，然后将尾巴皮肤转移到10毫升培养皿中，并加入10毫升PBS （图2D）。
使用手术刀，使一个移植以匹配完成的切口的尺寸在接收者的背侧部分（见Figure3），使使用解剖刀（图圆/圆小号2E- 2 G）。

图2 。供体尾部皮肤移植准备。A. 用手术刀从近端到远端解剖尾巴供体。尾巴的皮肤从近端（B）拉到远端（C）。D.施主尾部皮肤移植物被储存在无菌PBS中。使用手术刀（E）解剖一块移植物，并在拐角（F）上重新塑形，然后将其放置在手术刀刀片上，以放置在接受者背侧皮肤（G）上准备好的移植床上。

苏尔gical程序
通过在封闭室内吸入3％异氟烷溶液（需要3-5分钟才能达到手术平面麻醉）来麻醉受体小鼠（例如C57BL / 6，H-2 b ）。麻醉后，将维生素A软膏涂在眼睛上，以防止麻醉下角膜干燥。
转印鼠标保持在37软垫暖垫°C并通过口罩涂抹1.5％异氟烷（通过捏捏脚趾检查反射，以确保鼠标被正确麻醉）。
剃除耳线下方约2 cm处的受体小鼠皮肤（例如C57BL / 6）的背部部位（3 cm 2 区域），并用干燥的纱布拭子去除任何毛发（图3A）。
使用甜菜碱溶液用棉签对移植部位进行消毒（图3B）。
使用镊子在背部中央/右侧部位向上提起皮肤，并使用弯曲的剪刀（〜1 cm x 0.6 cm）进行圆形切口（图3C）。
出现出血时立即清洁伤口（使用无菌棉签）。
使用无菌棉签擦干多余的PBS，然后将移植物放到受体小鼠上（用手术刀）（图3E）。
使用组织粘合剂（Histoacryl ）将移植物（仅在接触区域）固定到受体皮肤上，避免供体和宿主皮肤重叠（图3F）。

图3.准备用于供体尾部皮肤手术植入的受体小鼠背侧部分。将接受小鼠置于麻醉面罩下，将其背部皮肤剃掉（A），然后用Betadine清洁（B）。用钝头镊子夹住背部皮肤，并用弯曲的剪刀（C）剪去约1 cm 2 的小面积皮肤。所述接枝床被制备来承载收件人的背部皮肤（d）。将供体尾巴移植物轻轻放置（E）在接受者背侧表面上形成的手术开口内，并使用Histoacryl 胶粘在周围的背面皮肤上，而接受者皮肤上没有任何重叠（F）。

术后移植物的保护
一旦Histoacryl 小腿升起（1-2分钟），就用石膏覆盖手术部位。仔细包裹膏药（Hansaplast 手指条，无折痕）不要蜘蛛d是鼠标腰部（参照FIGUR 上课4A- 4 B）。
使用粘性非弹性绷带将灰泥固定在鼠标上（相对于Hansaplast 灰泥的前缘向后偏移3 mm ）（图s 4C- 4 D）。
为防止鼠标在恢复阶段被牙齿卡住，请在绷带的上腹部位切一个约3 mm的切口（图4E）。
完全恢复后，将移植的小鼠转移到笼子中并评估其活动性（图4F）（绷带不应太紧；如果绷带太松或太紧，请移开旧的绷带（在麻醉下）并重新应用绷带）。在这一点上，动物接受湿的食物直到绷带除去。
在进行后续手术之前，请对所有器械进行消毒（70％乙醇）。

图4.术后移植物的保护。对于灰泥施用，将已在非粘性区域上大量涂有凡士林的Hansaplast 灰泥轻轻地铺在移植物的顶部，并沿腹部的周长（AB）取整。随后，使用另一层白细胞带（图中为白色）绷带将移植物牢固地固定在适当位置（CD）。在绷带的上腹部位切一个3毫米的切口（E）。将鼠标放回红色灯下的过渡笼中进行热身并使其唤醒（F）。

术后护理
通过在饮用水（4 mg / ml）中使用含扑热息痛的糖浆7天来提供镇痛作用。
根据机敏性和活动性判断，一旦完全康复，便可以将鼠标放回动物室。通常大约需要30分钟；外壳可以放在单个或成组的笼子中。
移植的小鼠应行为改变（吃或不动），外观异常（缺乏疏导）或姿势（被监控PILO -erection或弯腰驼背的姿势）的绷带已到位（1周）的时间。如果动物无法移动（例如，被绑扎的绷带），请在麻醉下重新应用绷带。

去除绷带（移植后6-7天）
通过吸入3％的异氟烷溶液开始麻醉小鼠。
用动脉剪刀仔细解剖绷带和灰泥，避免破坏跨植物部位。
监测小鼠的不适迹象（蹲下，动静，警觉，眼部放电和皮毛变化），并对移植的皮肤排斥反应进行评分（图5 ）。如果出现不适或感染，可以使用抗生素。

图5 。皮肤移植评分。图像代表直径约为1厘米的一块皮肤。

第二部分：淋巴器官ANALY SIS （郎等人。，2017）

细胞悬液的制备
淋巴器官的分离
用CO 2 对小鼠进行安乐死，用针（25 G）将小鼠的每只脚钉在聚苯乙烯泡沫塑料板上（图6A），打开腹部中间的皮肤（图6B，箭头）以通过切口全身（双Y型：图6C），并从腹膜分离皮肤。使用针头（25 G）将皮肤固定在泡沫聚苯乙烯板上（图6D）

图6 。打开老鼠的皮肤。答：将小鼠钉在托盘上后，在其上喷洒70％的乙醇。B.在小鼠下部1/3处做一个小的皮肤切口。C.切开皮肤，将其扔到身体的上部，然后左右两只手臂翼。然后到左右两腿。双Y形。D.从腹膜分离皮肤并将其两边固定。

取腹股沟和腋窝淋巴结第一（图小号7A- 7 B），再切腹膜腔取脾脏（图7C）。打开左侧和右侧的胸腔，将其向上露出心脏。将胸腺放在心脏顶部（图7D）。
将脾脏，胸腺，淋巴结放入装有冰冷PBS的单独试管中。

图7 。淋巴器官收获。全部由细镊子的尖端指出。答：删除腹股沟淋巴结在三个静脉相交处（此处显示在左侧）。B.去除肘部下方的腋窝淋巴结。C.去除脾脏D.胸腺去除，在肝脏顶部的白色2个裂片。例如。收获三种淋巴器官，并在培养皿中与PBS放在网格上。

室温下实体组织的细胞悬液
把1毫升的PBS在一个网格化网格的Petri 皿中，然后将脾脏，胸腺，淋巴结从节点部分II 阿1 在其上（图7E-G）
取一个5毫升注射器的柱塞，将器官砸向网片，直到看不到固体结构为止（直到脾脏胶囊变透明）
取1 ml新鲜的冷PBS洗涤网孔和培养皿，将含有细胞的上清液转移到15 ml管中。
快速旋转（70 xg ，5 s）除去细胞碎片。将上清液放入新的15 ml管中。以450 xg沉淀细胞，旋转5分钟。
将细胞重悬至所需体积的PBS中进行计数（脾脏或胸腺为7 ml，淋巴结为1 ml）。

红细胞裂解脾细胞
除去细胞碎片后，以450 xg 沉淀细胞，旋转5 分钟，然后将其重悬于1 ml ACK缓冲液中，让细胞悬浮液在室温下孵育1分钟以裂解RBC 。
加入5倍体积的ACK（5 ml）PBS，然后以450 xg的速度离心细胞5 分钟。
将沉淀重悬于所需体积的PBS中进行计数。

数数
用锥虫蓝（1/1）稀释样品。
添加10 μ 升至纽鲍尔室载玻片。
确定中间象限中的可行（非蓝色）细胞。
细胞数＝ n × 2（稀释因子）＝ 2n × 10 4 细胞/ ml 。

细胞表面染色和流式细胞仪
准备FACS抗体混合物，每个FACS小组需要一个（应滴定抗体以获得最佳结果）
板中的细胞在96 - 孔板（U型底的非对培养物处理），1 ×10 6 -2×10个6 细胞每孔。
使用装有板架的转子将板中的细胞离心450 xg ，5 分钟。
重悬沉淀，用50 微升FACS抗体通过上下抽吸混合。
在4°C下孵育平板15分钟。
离心平板中的细胞：450 xg ，5 分钟。
清洗细胞于200 微升FACS缓冲液中。
使用450 xg ，5分钟，4°C 离心细胞。
重悬200细胞沉淀微升FACS缓冲液中，并将它们传送在5ml FACS管用于FACS采集。

FACS染色的血液评估和治疗
血液评估
用1 ml注射器和25 G的针头对准心室尖端，并抽吸200μl 的血液（图8 ），将其转移到装有40μl2 ％EDTA的管中。

图8.血液评估。A.在心室尖端上打一个25 G的针头。B.慢慢拉出注射器的柱塞以采血。

FACS 标记
将100μl 血液/ EDTA混合物转移至5 ml FACS管中。
加入50μl 含正确量抗体的FACS缓冲液（表1）。
短暂涡旋（速度8）。
在4°C下孵育20分钟（在黑暗中避免光漂白）。
加入3 ml FACS缓冲液。
在450 xg ，4°C下将细胞离心5分钟。
吸使用黄色尖端（P200）上清液连接到真空泵

表1. FACS面板示例

抗原

荧光团

CD3

AF488

CD4

太平洋橙

CD8

太平洋蓝

CD62L

聚乙烯

1号

装甲运兵车

CD11b

PE / Cy7

B220

PerCP

活/死标记

APC / Cy7

红细胞裂解
向血液中加入1 ml 1x FACS裂解液（在此阶段会混浊，请参见图9A），短暂涡旋（速度8）。
等到所以lution变得清晰（透明的;大约需要1 分钟）（图9B）。
加入3 ml FACS缓冲液。
在450 xg ，4°C下离心5分钟。
倒出上清液。
重悬粒料250 微升FACS缓冲液用于FACS采集。

图9.血液裂解。A.红细胞溶解前的血液。B.红细胞溶解后的血液。

FACS采集和分析
我们做FACS acqu isitio 在BD FACS坎托或BD LSRñ Fortessa 与女神的软件和分析使用的FlowJo 软件。FACS 保护胸腺的示例（图10）。

图10.胸腺细胞染色的T细胞

致谢

在Pieters的实验室工作是由瑞士国家科学基金会，瑞士中号支持UL tiple硬化症协会，诺华基金会的医学-生物研究中，格伯特RUEF基金会和巴塞尔的广州。Max Cloetta教授基金会为Rajesh Jayachandran提供了支持。Rossi实验室得到了瑞士国家基金会和巴塞尔的Freiwillige Akademische Gesellschaft（FAG）的支持。此处使用的程序已根据Siegmund 等人的文章进行了修改。，2011 ; Schmaler 等。，2014 ; 郎等人。，2017 ; Jayachandran 等。，2019 。

在竞争terests

作者宣称没有利益冲突。

伦理

在这个协议中，根据由州管理局巴塞尔城市，瑞士批准的动物协议进行的所有动物程序，动物许可证1893（01.01.2017-01.01.2020 ）。

参考文献

格林（2013）。简介：实体器官移植中的感染。Am J移植13增刊4：3-8。
Jayachandran，R.，Gumienny ，A.，Bolinger ，B.，Ruehl ，S.，Lang，MJ，Fucile ，G.，Mazumder ，S.，Tchang ，V.，Woischnig ，AK，Stiess ，M.，Kunz， G.，Claudi ，B.，Schmaler ，M.，Siegmund ，K.，Li，J.，Dertschnig ，S.，Hollander，G.，Medina，E.，Karrer，U.，Moshous ，D.，Bumann ， D.，Khanna，N.，Rossi，SW和Pieters，J.（2019）。T细胞中冠状蛋白1信号的破坏促进同种异体移植耐受性，同时保持抗病原体免疫力。免疫50（1）：152-165 。e158。
Lang，MJ，Mori，M.，Ruer-Laventie ，J.和Pieters，J.（2017年）。甲在幼年小鼠冠蛋白1依赖性决定开关确定外围幼稚T细胞区室的人口。免疫学杂志199（7）：2421-2431。
洛佩兹（Lopez，MM），瓦伦苏埃拉（Valenzuela），JE，阿尔瓦雷斯（Alvarez），FC，洛佩兹-阿尔瓦雷斯（Lopez-Alvarez），MR，塞西莉亚（Cecilia），GS和帕里西奥（Paricio），PP（2006）。与免疫抑制有关的长期问题。Transpl Immunol 17（1）：31-35。
McKenzie，IF，Morgan，GM，Sandrin，MS，Michaelides，MM，Melvold，RW和Kohn，HI（1979）。B6.CH-2bm12。小鼠I区的新H-2突变。J Exp Med 150（6）：1323-1338。
Rodriguez- Peralvarez ，M.，De la Mata，M.和AK.Burroughs （2014）。肝移植：免疫抑制和肿瘤学。Curr Opin 器官移植19（3）：253-260。
Schmaler ，M.，布罗吉特，MA和罗西，SW（2014）。尾巴皮肤移植以研究小鼠的同种异体CD4 T细胞反应。Ĵ显示精通（89）：e51724。
Siegmund，K.，T.Zeis，G.Kunz，T.Rolink，N.Schaeren-Wiemers和J.Pieters（2011）。Coronin 1介导的幼稚T细胞存活对于自身免疫性脑脊髓炎的发展至关重要。免疫学杂志186 （6）：3452-3461。