材料与试剂小号

Sf9细胞中AAV-2 VLP表达
一次性标准移液器，3 m 升（Fisher Scientific，目录号：13-680-50）
一次性细尖吨转让（BOT）的移液管，3 米升（费舍尔科学，目录号码：02-708-018）
一次性血清移液管，1，10，25，50 米升（热费舍尔，目录号码：13-678-11B，-11E，-11，-11F）
一次性聚碳酸酯锥形瓶中，250 米升（费舍尔科学，目录号码：07-200-668）
无菌陪替氏培养皿（热费舍尔，目录号码：FB0875712）
500 m l 离心瓶（Nalgene，目录号：05-564-3）
6孔组织培养板（Sarstedt ，目录号：83.1839）
康宁TM 细胞培养瓶中，25 厘米2 表面面积（Sigma-Aldrich公司，目录号：CLS430639）
康宁TM 细胞培养瓶中，75 厘米2 表面面积（Sigma-Aldrich公司，目录号：CLS430641）
pFBDVPm11 供体的质粒（ROB的捐款Kotin的）用于生成杆状病毒质粒穿梭载体（浦边，丁等人2002）
化学感受态DH10Bac感受态细胞（热费舍尔，目录号：10361-012）
Bluo -Gal （金生物技术，目录编号：B-673-1）
IPTG （黄金生物技术，目录号：I2481C25）
四环素（黄金生物技术，目录号：T-101-25）
庆大霉素（Gold Biotechnology，目录号：G-400-5）
的Luria 肉汤（LB）基（热费舍尔，目录号：12795027）
琼脂粉（Thermo Fisher，目录号BP1423-500）
M13F 和M13R 引物（分别为CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG和AGCGGATAACAATTTCACACAGG）
Qiagen 大型构造套件（Qiagen，目录号：12462）
异丙醇（Thermo Fisher，产品目录号：A520-4）
Gibco TM Sf9 细胞在Sf-900 TM II SFM中（Thermo Fisher，目录号：11496015，储存在-80 °C ）
恩“ 小号昆虫培养基，补充（热费舍尔，目录号：11605094，存储在4 ℃下）
恩“ 小号昆虫培养基，未补充的（热费舍尔，目录号：11595030，存储在4 ℃下）
Cellfectin TM II 试剂（Thermo Fisher，目录号：10362100，在4 °C下储存）
HyClone公司TM 胎儿牛血清（费舍尔科学，目录号码：SH3007102，存储在-20 ℃下）
SF-900 TM II SFM 细胞培养基（热费舍尔，目录号：10902187，存储在4 °C）
台盼蓝，0.4％（Gibco，目录号：15250-0601）
BaculoQUANT 多合一病毒提取和滴定试剂盒（Genway Biotech，Inc.，目录号GWB-100602）

AAV-2 VLP PURIF ication
13 x 51毫米超速离心管（Beckman Coulter，目录号：344057）
派热克斯存储瓶，250，500，千米升（Fisher Scientific公司，产品目录号：06-414-1B，-1C，-1D）
微量离心管中，1.5M 升（赛默飞世，目录号：02-681-331）
0.45 微米的注射器式过滤器单元（Millipore公司Sigma，目录号：SLHV033RS）
透析管（MWCO 50kDa的），例如，Repligen 光谱/ POR ® 6标准再生纤维素（RC）透析管，预润湿的，目录号：888-11389 ）
Slide-A- Lyzer 透析盒，10 kDa MWCO（赛默飞世尔，目录号：66380）
的HiTrap 肝素HP柱，1米升（GE，目录号：17-0406-01）
氯化铯（Sigma-Aldrich，目录号：C4036）
HEPES（Sigm a-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钠（NAC 升）（Sigma-Aldrich公司，目录号：S9888）
氯化镁六角ahydrate（的MgCl 2 ·6H 2 O）（Millipore公司Sigma，目录号：1374248）
乙醇（赛默飞世尔，目录号：S25307B）
Benzonase（Millipore Sigma，目录号：E1014-25kU）
漂白粉（订书钉，货号：KIK8635042）
CsCl 梯度溶液（请参阅配方）
肝素色谱柱运行缓冲液（缓冲液A）（请参见配方）
肝素柱洗脱缓冲液（缓冲液B）（请参见配方）
HM缓冲区（请参见食谱）
HN缓冲区（请参阅食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（请参阅食谱）

AAVR 构建体表达在大肠杆菌大肠杆菌
细胞培养管（Thermo Fisher，目录号：14-956-6D）
BL21（DE3）大肠杆菌大肠杆菌（NEB，目录号码：C2527I）
pET11a 载体（Novagen ，目录号：69436-3）
的pMAL TM 蛋白融合和纯化系统（新英格兰生物实验室，目录号码：E8200S），组成的的pMAL-C5X，的pMAL-P5X，直链淀粉树脂，因子XA ，抗MBP 单克隆抗体，MBP5 蛋白，MBP5-副肌球蛋白Δ萨尔和Ë 。大肠杆菌ER2523
NEB 快速主管E. 大肠杆菌（NEB，目录号码：C2523I）
IPTG （黄金生物技术，目录号：I2481C25）
氨苄青霉素（黄金生物技术，目录号：A-301-5）
卡那霉素（黄金生物技术，目录号：K-120-5）
Ť RIS 基（（CH 2 OH）3 CNH 2 ）（Fisher Scientific公司，目录号：BP152-1）
LB-氨苄青霉素培养基（请参阅食谱）
LB-氨苄青霉素琼脂平板（请参阅食谱）

AAVR 构建体纯化
MBPTrap HP 柱，5 米升（GE，目录号：28-9187-79）
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg SE 色谱柱（GE Healthcare，目录号：28989335）
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg SE 色谱柱（GE Healthcare，目录号：28989333）
Amicon Ultra-0.5 离心过滤器单元，3 kDa MWCO （Millipore Sigma，目录号：UFC500324）
Amicon Ultra-0.5 离心过滤器单元，30 kDa MWCO （Millipore Sigma，目录号：UFC503024）
10 米升鲁尔锁注射器（例如，费舍尔科学，目录号码：14-955-459 ）
0.45 微米的注射器过滤器单元（Millipore公司Sigma公司，目录编号：SLHV033RS）
HALT 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（100x）（Thermo Fisher，目录号：78429 ）
的HiTrap 螯合HP （IMAC）柱（GE，目录号：17-0409-01）被控与合作2+ ）
凝胶过滤标准品（Bio- R ad，目录号：151-1901）
咪唑（Acros ，目录编号：12202-5000）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Thermo Fisher，目录号：S374-500）
磷酸氢二钾（KH 2 PO 4 ）（Thermo Fisher，目录号：P285-500）
MBPTrap 列运行缓冲区（缓冲区A）（请参见配方）
MBPTrap 柱洗脱缓冲液（缓冲液B）（请参见配方）
IMAC 列运行缓冲区（缓冲区A）（请参阅食谱）
IMAC 柱洗脱缓冲液（缓冲液B）（请参阅配方）

设备

水浴能的42 ℃下（例如，热电费舍尔，型号：ISOTEMP ）
摇动培养箱，27 °C （例如，Thermo Fisher，型号：MaxQ 6000 ）
摇动培养箱，37 °C （例如，New Brunswick Scientific，型号：Excella E25 ）
qPCR 机（例如，Applied Biosystems，型号：StepOne ）
法国新闻界的细胞裂解（例如，SLM AMINCO ，型号：FA-078）
台式微量能够16000 X 克（例如，热电费舍尔，型号：的Accuspin 微）
FPLC （例如，GE 医疗保健，型号：AKTA 色谱系统）
FPLC 系统样品循环：2 米升（GE 医疗保健，目录号：18111402）; 10 米升（超环路）（18-1113-81）（或50 米升，18-1113-82）
SDS-PAGE 设备（例如，Bio-Rad，型号：Mini Protean 3 Cell）
热循环仪（例如，MJ 研究模型：PTC-200）
制备离心机（例如，Sorvall ，型号：RC5C）
离心机转子，固定角，配合50 米升管（例如，贝克曼库尔特JA-20 或FiberLite F13-14x50cy ）
离心机转子，固定角，配合500 米升瓶（例如，贝克曼库尔特J-LITE ® JLA-10.500）
超速离心机（例如，贝克曼模型：L7-55）
吊桶式转子为氯化铯，能够的135000 ×g下（例如，贝克曼SW50.1）
反驳站和钳用于对控股超速管
pH 计（例如，Thermo Fisher，型号：Acumet AB15）
吸管（例如，吉尔森移液器® ，型号：P1000，P200，P20）
搅拌板（例如，Fisher Scientific，目录号：SP88854200）
磁力搅拌棒（Nalgene，目录号：93-5521-5）
天平精确至0.01 g （例如，Ohaus，型号：Scout Pro SP402）
UV-分光光度计（例如，岛津制作所，型号：UV-1800 ）
定制的透析按钮（份购自麦克马斯特-卡尔，目录号码：8546K15 ，和加工在所述大学学报的密苏里州，哥伦比亚; 图URE 1 和表1 为装配和测量）。一个替代的可能是在幻灯片-A- Lyzer MINI 透析装置，20K MWCO （热费舍尔，目录号：69590 或69555），见下面步骤d ：“ 脱盐通过透析”
折光仪（例如，阿贝，型号：C10）
血细胞计数器（例如，Thermo Fisher，目录号：02-671-6）
倒置显微镜（用于细胞计数）（例如，尼康，型号：Eclipse Ts2）

图1.自定义透析按钮。零件由带螺纹盖和腔的PTFE（McMaster-Carr）加工而成。单独研磨后，将内腔粘合到外腔中。孔具有50的容量μ 升（左）或60 μ 升（右）。在底部螺帽和圆柱体之间夹有一个透析膜，在顶端是一个显微镜盖玻片，提供了一个窗口。组装完底部之后，在添加盖玻片和顶部密封之前，先从顶部装载样品。将按钮从烧杯的一面朝下悬挂在交换缓冲液中。必须清除残留在底盖下方口袋中的空气，以确保膜和缓冲液之间接触。

表1 尺寸的透析按钮

透析按钮部分

外直径（毫米）

内孔直径（毫米）

高度（毫米）

顶帽

19

3

8.5

外室

19

13

18岁

内室

13

3

6.5

底帽

19

7.5

9.5

程序

杆状病毒表达的AAV-2 的VLP 中的Sf9 细胞
这包括的5个步骤：（1）开始的d保持的Sf9细胞的培养物;（2）构建和纯化含有AAV-2衣壳基因的杆粒DNA的，（3）所制备的杆粒DNA的Sf9细胞的转染，（4）收集和扩增杆状病毒原种，以及（5）杆状病毒感染Sf9细胞以产生VLP。

Sf9细胞的生长
将冷冻的Sf9储备液在37 °C 加热至几乎融化。
无菌地将细胞转移到一个250 ml的锥形瓶中，该烧瓶中装有25 ml 的预热（25-30 °C ）Sf-900 TM II SFM。
在避光的条件下，于28 °C 孵育，同时以135 rpm 摇动（制造商建议）。
注：从冷冻培养可以采取一对夫妇的周增长到合适的密度。

当培养物显示出生长迹象时，每天对细胞计数。要计数，请将1 ml 培养物与100 µl 台盼蓝混合，然后轻拂试管轻轻混合。等待2分钟，然后重新混合并用血细胞计数器计数。（通常也可以假定细胞已经充分繁殖，并且可以在48小时内计数并立即分裂，如下一节所述。）
当细胞达到4的密度×10 6 -6×10 6 个细胞/米升，通道至0.5 ×10 6 -1.0×10 6 个细胞/米升50米的最终体积升。健康文化在约24小时内翻倍，应每2-4天进行一次传代。根据需要继续传代以维持适当的细胞密度。在第30代传代后，培养物的活力可能会降低，可能需要开始新的培养物。
注：在开始培养的密度<0.5×10 6 个细胞/米升或允许培养至超过8 ×10 6 个细胞/米升高度气馁，因为它导致了较长的生长滞后和降低的存活力。

杆状病毒质粒DNA的产生和纯化
从pFBDVPm11供体质粒中，按照Bac-to- Bac TM 协议（Thermo Fisher，出版号MAN0000414）在DH10Bac细胞中生成杆状病毒穿梭载体。
使用Qiagen的无内毒素的大型构建试剂盒纯化杆粒。
根据Bac-to- Bac TM 协议（见上文）将杆粒DNA转染到Sf9细胞中。
根据Bac-to- Bac TM 协议分离P1 杆状病毒原种。对Bac-to- Bac TM 程序的修改包括：
使用BaculoQUANT 多合一提取和滴定试剂盒通过qPCR定量病毒滴度，以评估病毒收获的准备情况。
可选地，代替收获时的Sf9细胞为20-30％存活，收获时的杆状病毒滴度为至少10个6 个病毒基因组（VG）/米升。
注意：转染后大约需要4-5天。

杆状病毒原种的扩增（P2原种的产生）
这继续遵循Bac-to- Bac TM ，其修改如下：

通过qPCR定量P2病毒滴度。

注意：感染后大约需要3-4天。

VL P产生的Sf9感染
扩展了的Sf9培养到600-800米升和2的密度×10 6 -4×10 6 个细胞/米升，如在步骤A1，以上。
用P2 杆状病毒原种感染培养物。将P2加到5到10之间的MOI。
像以前一样孵育培养物，每天检查细胞密度和活力。当生存力开始下降时（40-60小时），请更频繁地检查培养物，并在生存力介于80-60％（通常为55-80小时）之间收获。
将培养物转移到两个500 ml的离心瓶中，平衡并在20 °C下以5,500 x g的速度离心30分钟。
将每个沉淀重悬于10 ml HM缓冲液中，并汇集到50 ml 离心管中。用5 ml 额外的HM缓冲液的等分试样收集所有其他细胞。
将〜25 ml重悬浮的细胞沉淀物储存在-80 °C下，直到准备进行VLP纯化为止。

AAV-2 VLP纯化
AAV-2 VLP纯化包括四个步骤：（1）通过冻融循环裂解细胞沉淀；（2）从剩余的可溶性成分中澄清VLP产物；（3）亲和柱纯化；（4）通过脱盐透析。首先是从细胞中提取VLP的初始裂解。第二步依赖于使用氯化铯梯度对样品进行超速离心，以使用差示密度离心法将VLP与其他可溶性组分分离。经过三轮CsCl 梯度离心后，样品的纯度为50-70％。为了获得更高的纯度，将样品通过肝素亲和柱，然后再进行一次CsCl 离心以浓缩样品。[ 对于对肝素不具有高亲和力的血清型，可以用离子交换代替亲和色谱（Kaludov 等，2002），或者可以更高的严格度进行Cs梯度超速离心，进一步重复或仅接受更窄的级分在该频带的峰值附近（Xie 等，2004）。在100 µl 中，VLP制剂的产量通常为2-4 mg / ml 。最后，由于样品中含有高浓度的CsCl ，这会干扰电子显微镜的可视化，因此使用设计用于40-60 µl 体积的定制透析设备（透析按钮）对样品进行透析。由于VLP样品在3.3 M CsCl中的相对稳定性以及在低盐溶液中的不稳定性，最后的透析步骤是在将要在1-2天之内使用的少量纯化样品上进行的。（与其他血清型相比，AAV-2在低盐下更易于聚集，其中许多血清型在4°C下稳定长达4周。）

Sf9细胞的裂解和可溶性蛋白的收集
在37°C水浴中解冻VLP-conta 细胞悬浮液30分钟。
将细胞悬液在-80°C下重新冷冻至少2 h 。
重复步骤B1a 和B1b 4次（解冻和冻结5个循环）。
解冻37℃将细胞悬浮液水浴20分钟，加入0.25μ 升benzonase核酸每m 升的细胞悬浮液，混合并继续在37℃水浴中孵育20分钟。
注意：核酸消化会降低粘度。

添加5 M氯化钠溶液使细胞悬浮液中的氯化钠增加100 mM（例如，将0.6 ml 加入30 ml 悬浮液中），并在-80°C冷冻至少2小时。
注意：添加氯化钠会使苯甲酸酶失活。

最后一次将悬浮液在37°C的浴中解冻，然后将2- ml 等分试样分配到15个2- ml 试管中，并以16,000 x g的转速旋转10分钟。
收集所有试管中的上清液，并通过0.45 µm过滤器过滤。
AAV-2 VLP的CsCl 梯度纯化
将CsCl 添加到合并的上清液中（上方），直到折射率（RI）为1.3690（±0.0005）。
注意：这将是每平方米大约0.5克升样品的和它带给〜的3.3M 氯化铯。

为相同的RI 额外增加50 ml 的HM缓冲液和CsCl ，以进行平衡（配方11）。
转印-5 M 升样品到每个6支超速离心管和0.05g内每对平衡到，使用上述（步骤C2b中）所作的溶液根据需要顶部关闭管。将每个试管加至顶部1毫米以内，以免在离心过程中塌陷。
在20°C的超速离心机中，用SW50.1转子（或类似装置）以135,000 x g 的速度离心样品20至24小时。
轻轻将试管运送到您的工作区域，以保持梯度分离。用乙醇擦拭每个试管的外部，并使用明亮的卤素灯观察AAV谱带（参见图2 ）。作为指导，在AAV-2波段的上方和下方大约2毫米处标记试管的侧面（例如，用Sharpie笔）。

图 2.通过CsCl 梯度离心分离AAV-2后离心管的侧面照明。中间的白色混浊带是AAV-2 VLP。

使用标准的一次性移液管将液体去除到AAV-2带上方2 mm处的标记，并将其丢弃到10％的漂白剂溶液中。
用细小的一次性移液管轻轻地收集含有AAV-2的样品（从带子上方2毫米移至带子下方2毫米），然后将其转移到新的超速离心管中。同样从所有六个试管中收集AAV-2谱带，并汇集到一个超速离心管中。检查并记录折射率（RI）。
像以前一样平衡并离心装有合并的AAV-2样品的试管（上述步骤C2c-C2e）（第二次旋转）。
再重复一次AAV-2谱带收集和超速离心步骤（第三次旋转）。
收集第三超速离心和注入后的样品放入一个滑动-A- Lyzer 与1米透析盒升注射器和18号需要升E中提供，按照产品说明书。
将透析盒漂浮在2 L磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并在4°C下搅拌2 h。替换为2 L的新鲜PBS，并在4°C过夜透析。
将透析的样品从Slide-A- Lyzer 盒中转移至低蛋白结合微量离心管中；储存在4°C直到装载到肝素亲和柱上。

肝素AAV-2 VLP亲和柱的纯化
准备AKTA系统和肝素亲和柱
验证2米升样品环被连接到FPLC系统。
用超纯去离子水冲洗FPLC系统管线A和B。
用肝素亲和缓冲液清洗FPLC系统管路：用运行缓冲液A清洗管路A，用洗脱缓冲液B清洗管路B（配方6）。
缓冲液A以0.5 ml / min的流速连接肝素HiTrap 色谱柱。
用20 ml 的100％缓冲液A以1 ml / min的体积平衡色谱柱。
用10 ml 100％缓冲液B以1 ml / min的速度洗涤色谱柱。
用至少10 ml 的100％缓冲液A 洗涤色谱柱。
一旦紫外线和电导率稳定下来，就终止缓冲液A的流动。
在肝素亲和柱上运行样品
以16,000 x g 旋转渗析样品10分钟以去除聚集体。
将系统设置为“装载”和冲洗用10微米的环升使用PBS的鲁尔锁注射器。
将系统设置为“ Inject”，然后取出注射器。
加载1米升注射器与VLP样品，并将其连接到环。
将系统重新设置为“ Load”，然后将样品注入定量环，注意不要注入空气。
将流量设置为1 m l / min，然后通过将系统设置为“ Inject”并用3 ml 100％的缓冲液A 冲洗定量环，将样品引入色谱柱。
重新设置为“加载”并继续以1 ml / min的速度运行100％缓冲液A 5分钟。
在25分钟内从0-85％的缓冲液B进行线性梯度洗脱，收集0.5 ml 馏分。
检查UV色谱图，并保留含有AAV-2峰的洗脱液馏分，以通过SDS-PAGE进行评估。
按照标准方案，在SDS-PAGE凝胶上从每个含AAV-2峰的馏分中运行样品，以验证VLP的存在。
合并含AAV-2的馏分，并像以前一样进行最终的CsCl 梯度超速离心（请参阅上面的步骤C2c-C2e）。该梯度用于集中VLP。
将收集的样品储存在低蛋白结合的微量离心管中。
依次运行10倍柱体积的洗脱缓冲液B，超纯去离子水和20％乙醇，以清洁柱。将色谱柱储存在20％的乙醇中。

透析脱盐
我们的协议继续使用定制的微型透析设备，该设备在为类似的设备提供商业用途之前为实现小体积和高回收率而设计。按照制造商的指示，可以替换Slide-A- Lyzer MINI透析设备（参见材料），重新加入下面的步骤D 3i中的“测量吸光度……”方案。我们将根据惯例继续执行方案设备：

根据制造商的说明准备透析膜，然后：
以12 mm圆形玻璃盖面为模板，从透析膜上切出小圆圈；使用前，将其在4°C的HM缓冲液中加0.02％叠氮化钠保存。

准备透析按钮
按照图1组装自定义透析按钮，以确保隔膜在底部内腔和底盖内的塑料垫圈之间的平滑配合。

如果已完全组装，请拆下顶盖，盖玻片和橡胶垫圈
将纯化的VLP（来自过程D）的样品（30-60 µl ）分装到内腔的内孔中，注意避免将气泡引入透析膜的表面。
将玻璃盖玻片，橡胶垫圈和顶盖放在外室中，并小心拧紧以密封。
使用捻结，以部分地暂停在一个50μm的透析按钮升与玻璃盖玻片朝上烧杯中。
添加HN缓冲液，使透析按钮的下部浸入水中，而顶部在表面上方。
使用已融化的巴斯德移液器（形成180 °发夹）去除透析按钮底盖中透析膜底表面上的气泡。
注意：Ť 气泡他存在将从允许的盐透析从样品闭塞的液体部分，并可能损害蛋白质结构。

在4°C搅拌下透析过夜。
从烧杯上取下透析按钮，并用芯吸滤纸条轻轻擦干透析膜附近的区域。
用10 µl 吸头小心地刺穿透析膜，然后将样品吸移到无菌的，低蛋白结合的微量离心管中。
测量样品在280 nm处的吸光度，并使用17.3 （g / 100 ml ）-1 / cm 的消光系数确定蛋白质的浓度，或称为E1％。

MBP-PKD1-5和His 6 PKD1-2 AAVR构建体在大肠杆菌中的表达
从KIAA0319L cDNA克隆亚克隆所需的PKD1-5片段（克隆ID 3843301; GE Dharmacon ; Pillay 等人，2016）。PKD1-5 与MBP融合后被亚克隆到pMAL-c5X 载体中，而PKD1-2被亚克隆到具有N端His-tag的pET-11a载体中（图3 ）。
使用标准技术将pMAL-c5x质粒（1 pg ）转化为NEB Express细胞，将pET-11a质粒（1 pg ）转化为BL21（DE3）细胞，并在LB-氨苄青霉素琼脂平板（100 µg / ml ）上平板接种。
注意：可以使用下面描述的过程（步骤E 3- E 5 ）来表达两种构造。转换效率与NEB Express 的广告宣传值8 x 10 8 CFU / µg和BL21（DE3）的宣传广告值3 x 10 7 CFU / µg 并无明显差异。

从新鲜条纹的LB-琼脂平板上接种单个转化的BL21（DE3）菌落到LB-氨苄青霉素（100 µg / ml ）培养基中，该培养基为最终所需培养总体积的5％（例如50 ml 过夜培养成1 ，000米升最终体积）。将发酵剂培养物在37°C下以210 rpm的转速培养过夜。
第二天，将发酵剂转移到最终培养基中，并在37°C下以210 rpm摇动孵育，直到OD 600 为〜1.0。删除1米升等分试样（诱导前的样品）并放入1.5米升管。在6自旋这等份1分钟，000 X 克并弃去上清液入10％的漂白剂溶液。如果需要，将细菌沉淀保存在-20°C以便通过SDS-PAGE进行表达后分析。
加入IPTG至1 mM的浓度，并在37°C下以210 rpm摇动培养4-5 h。甲压脚提升温育后，除去1米升等分试样（诱导后的样品）和如上述沉淀这些细胞步骤E 的诱导前样品4。将该pell 等存放在-20°C以便进行后表达分析。离心机在6000剩余培养X 克，弃去上清液成一个10％的漂白剂溶液，并存储所述粒料在-20 ℃下，直到裂解和纯化步骤。

图 3 。MBP-PKD1-5和His 6 PKD1-2的亚克隆。A.使用KIAA0319L cDNA克隆作为模板，使用引物1和2进行PCR扩增。用SbfI 切割PCR产物，然后使用T4多核苷酸激酶将其磷酸化。用XmnI 和SbfI 切割pMAL-c5x 。将切割/磷酸化的PCR产物和切割的pMAL-c5x载体连接在一起，制成MBP-PKD1-5。B.使用相同的DNA作为模板使用引物3和4进行PCR 。用NheI 和BamHI 切割PCR片段。切割的pET-11AW¯¯ 第i 的NheI 和BamHI位。将切割的PCR产物和切割的pET-11a载体连接在一起，形成His 6 PKD1-2。

AAVR构建体的纯化
MBP-PKD1-5纯化
细胞裂解（在冰上进行）
将冰冻的沉淀重悬于25 ml 的MBPTrap 运行缓冲液中，该缓冲液含有100 µl HALT蛋白酶抑制剂混合物100 x 。
负载细胞浆成1法式压滤细胞和穿过裂解的两个完整的轮，000磅使用缓慢的流速收集裂解物成50米升离心管中。
在F13-14x50cy转子（或类似转子）中，将裂解液在4°C，16,000 xg下离心45分钟。旋转时，准备AKTA系统。
AKTA系统上的MBP亲和色谱
洗涤并平衡MBPTrap 柱
1）在连接色谱柱之前，将AKTA的A行放入MBPTrap 运行缓冲液中，并将B行放入MBPTrap 洗脱缓冲液中。

2）将10 ml 的MBPTrap 运行缓冲液注入超级回路（阀设置=负载）。

3）绕过超级回路（阀设置=负载），以5 ml / min和50％B的流量开始流动。运行约5分钟。

4）切换到缓冲区A（0％B），然后再运行5分钟。

5）将流量降低至2 ml l / min，并流经超级回路（阀设置=注入）10分钟或直到完全清除超级回路。

6）将流量降低至1 m l / min，将阀切换回“负载”，并连接MBPTrap HP 色谱柱，避免引入空气。

7）用1 升/分钟的5倍柱体积的洗脱缓冲液B平衡柱，直到UV和电导率基线稳定为止。

8）切换至运行缓冲液A并洗涤，直到基线稳定，至少10倍柱体积。

将样品上样至MBPTrap 色谱柱
1）从离心机中取出装有细胞裂解液的试管，并将上清液转移至新的50 ml 离心管中。

2）通过使用10微米的0.45μm的过滤器过滤升鲁尔锁注射器。如果膜变脏，可能需要多个过滤器。

3）随着阀的设定值设定为“装载”，喷出10米升溶胞产物的进入超环路。

4）将流量设置为0.5 m l / min，馏分大小为10 ml ，阀设置为“ Inject” 。

5）通过超循环进入色谱柱，直到超循环几乎为空。

6）此时，暂停FPLC，阀切换到“装载”，注入另一个10米升成超环路，切换回“注入”，并恢复流动。重复此过程直到整个裂解物v olume被加载到柱上（瓦特第i个高容量超环路，整个样品可以在单个加载步骤）。

MBP-PKD1-5的洗脱
1）加载后，通过将阀切换到“加载”并将运行缓冲液的流量增加到1 ml / min 来清洗色谱柱。

2）一旦基线稳定-至少10倍柱体积，减小流动到0.5米升/分钟，级分大小为2 米升。

3）流动100％洗脱缓冲液B 45分钟以洗脱MBP-PKD-1-5 。

处理MBPTrap 柱馏分
1）在SDS-PAGE上运行峰级分（图4）以验证MBP-PKD-1-5的存在并合并适当的级分。

2）使用30 kDa Amicon Ultra离心过滤器将收集的样品浓缩至〜1 ml 。

图4 。从MBPTrap HP柱洗脱MBP-PKD1-5 。将流量从100％A切换到100％洗脱缓冲液B的洗脱体积为0。

AKTA系统上的Superdex 200 SEC
注意：MBP-PKD1-5缓慢低聚（在4°C下约30天的时间内）（Meyer 等，2019）。此SEC步骤允许在使用前不久在较高阶的低聚物上选择二聚体，如果需要这种分离，则必须在样品于4°C长时间存储后重复进行二聚体选择。

洗涤和平衡Superdex 200
1）在连接色谱柱之前，将AKTA的管线A放入HN缓冲液中，并以5 ml / min的速度运行0％B 5 分钟以冲洗管线A。

2）将10 ml 的HN 缓冲液注入超级回路（确保阀设置=负载）。

3）将流量设置为2 m l / min，并通过超级回路（阀设置=注入）持续10分钟，或者直到超级回路完全被吹扫为止。

4）将流速降低至1 m l / min，并连接预先校准的Superdex 200尺寸排阻色谱柱，避免引入空气。为了平衡，使HN缓冲液以1-1.5 ml / min的速度流过色谱柱，直到基线稳定为止。

将样品加载到Superdex 200上
1）暂停AKTA，然后将不超过色谱柱体积1％的样品体积注入到超级环路中（阀设置=负载）。

2）将流量设置为1 m l / min，然后恢复流量（阀设置=注入）。

3）根据校准结果和Meyer 等人（2019年）收集与MBP-PKD1-5二聚体分子量（190 kDa ）相对应的馏分（图6）。图5 提供了一个示例，说明了标准校准可能看起来像。

图 5 。使用BioRad 凝胶过滤标准品对Superdex 200进行校准。蓝线跟踪标准品的洗脱（从左至右）：牛甲状腺球蛋白（670 kDa ），牛γ-球蛋白（158 kDa ），鸡卵清蛋白（44 kDa ），马肌红蛋白（17 kDa ）和维生素B12（1.35 kDa ）。标准品的色谱应在与样品相同的条件下（流速等）进行（参见步骤F 1c和图7 ）。

图 6 。从Superdex 200 SEC 洗脱MBP-PKD1-5 。洗脱时间与图5的比较表明，较大的左峰对应于> 380 kDa的高阶低聚物。较小的右峰，对应于MBP-PKD1-5的二聚体（190 kDa的），被收集。

他的6 PKD1-2的纯化
细胞裂解（在冰上进行）
将冰冻的沉淀重悬于25 ml 的IMAC运行缓冲液中，该缓冲液含有100 µl HALT蛋白酶抑制剂混合物100 x 。
加载细胞浆成法式压滤细胞，并以1通过裂解2个完整轮次，使用的流速足够慢000 psi至避免起泡，收集裂解物成50米升离心管中。
在F13-14x50cy转子（或类似转子）中于4°C，16,000 x g 离心裂解液45分钟。旋转时，准备AKTA系统。
AKTA系统上的IMAC亲和色谱
洗涤并平衡IMAC色谱柱
1）将AKTA的A行放在IMAC运行缓冲区中，将B行放在IMAC洗脱缓冲区中。除非将阀设置为旁路模式，否则此时不得将色谱柱连接到AKTA。

2）将10 ml IMAC运行缓冲液注入超级回路（确保阀设置=负载）。

3）绕过超级回路（阀设置=负载），以5 ml / min和50％B 的流量开始流动。运行约5分钟。

4）将缓冲区切换到A（即0％B），然后再运行5分钟。

5）将流量降低至2 ml l / min，并流经超级回路（阀设置=注入）10分钟或直到完全清除超级回路。

6）将流量降低至1 m l / min，将阀切换回“负载”，并连接HiTrap HP（IMAC）色谱柱，避免引入空气。

7）通过使洗脱缓冲液以1 ml / min的速度流入5个柱体积来平衡柱，直到UV和电导率基线稳定为止。

8）切换至运行缓冲液并流动，直到基线稳定，至少10倍柱体积。

将样品上样到IMAC色谱柱
1）从离心机中取出装有细胞裂解液的试管，并将上清液转移至新的50 ml 离心管中。

2）通过0.45 µm过滤器过滤。如果膜变脏，可能需要多个过滤器。

3）随着FPLC阀设置集到负载，注入10米升溶胞产物的进入超环路。

4）将流量设置为0.5 m l / min，馏分大小为10 ml ，然后注入阀门。

5）通过超循环进入色谱柱，直到超循环几乎为空。

6）此时，暂停FPLC，将阀切换到负载状态，再向超级回路中注入10 ml ，再将阀切换到注入状态，然后继续运行FPLC。重复此过程，直到将整个裂解液上样。

他的6 PKD1-2的洗脱
1）通过将进样阀切换到“负载”并将流量增加到1 m l / min 来清洗色谱柱。

2）一旦基线稳定下来（至少10个色谱柱体积），流速就降低到0.5 m l / min，馏分尺寸降低到2 ml 。

3）在45分钟内从0％-100％洗脱缓冲液运行线性梯度。

处理IMAC色谱柱馏分
1）在SDS-PAGE上运行峰级分（图7）并合并适当的级分。

2）使用3 kDa MWCO Amicon Ultra离心过滤器将收集的样品浓缩至〜1 ml 。

图7 。从IMAC色谱柱洗脱His 6 PKD1-2。蓝线表示的带His标签的蛋白质的峰化在第一洗脱3米升在大的背景。通过减去与％B 成正比的值，大约在灰色线中消除了来自缓冲液B中咪唑吸收的背景（橙色线）。

AKTA系统上的Superdex 75 SEC
注意：与MBP-PKD1-5一样，他的6 PKD-1-2在4°C时缓慢低聚（Meyer 等，2019）。此SEC步骤允许在使用前不久在较高阶的低聚物上选择二聚体，如果需要这种分离，则必须在样品于4°C长时间存储后重复进行二聚体选择。

洗涤和平衡Superdex 75
完全按照对Superdex 200的描述，用HN缓冲液洗涤和平衡Superdex 75色谱柱（上述步骤F 1c）。

将样品加载到Superdex 75上
1）平衡后，暂停AKTA，并与Superdex 200一样，注入不超过色谱柱体积1％的样品体积（将阀设置为“ Load”）。

2）将流量设置为1 m l / min，然后恢复流量（阀设置=注入）。

3）根据您的凝胶过滤标准品校准结果和Meyer 等人，2019，收集与His 6 PKD1-2 二聚体（44 kDa ）分子量相对应的馏分。

注意：加载和洗脱过程，包括流率，为所述的Superdex 75 SEC 是在相同的用于所述的Superdex 200 SEC（步骤˚F 1C ），但样品具有不同的保留时间。的预期保留时间的对他6 PKD-1-2 二聚体可以被估计通过凝胶过滤标准校准结果S（参照图8为为例E）和迈耶等人。，2019。

图 8. 使用BioRad 凝胶过滤标准液校准Superdex 75 。蓝线跟踪标准溶液的洗脱过程（从左到右）：（a）第一个主要峰具有肩峰，表明它是未分离的牛甲状腺球蛋白（670 kDa ）和牛γ-球蛋白（158 kDa ）；（b）鸡卵清蛋白（44 kDa ），（c）马肌红蛋白（17 kDa ）；（d）维生素B12（1.35 kDa ）。标准品的色谱应在与样品相同的条件下（流速等）进行（参见步骤F 2ci和图9）。他的单体6 PKD1-2（22 kDa的）将在约70m预期升和二聚体在约60μm 升中，相同的洗脱时间如卵清蛋白。

图 9 。他从Superdex 75 SEC 洗脱的6 PKD1-2 。洗脱时间与图8的比较表明，较大的左侧复合峰对应于超过> 75 kDa 且大约为6 70 kDa的高阶低聚物。使用了与His 6 PKD1-2的二聚体相对应的最大峰，并且只有最微弱的暗示，即近似于稍后洗脱的单体。

菜谱

LB氨苄西林培养基
20 g / L LB汤底

在121°C，2.6巴下高压灭菌30分钟以进行灭菌

在水浴中冷却至〜60°C，然后将氨苄西林添加至100 µ g / ml

LB-氨苄青霉素琼脂平板
20 g / L LB汤底

15克/升琼脂粉

在121°C，2.6巴下高压灭菌30分钟以进行灭菌

在水浴中冷却至约60 °C，然后将氨苄西林添加至100μg / ml ，倒入无菌培养皿中

可以在2-8°C下保存2-3周

CsCl 梯度溶液（用于平衡超速离心管）
HM缓冲器（请参见配方11）

大约 0.5克/毫升l 氯化铯

注意：将CsCl 加入50 ml HM缓冲液中，直到RI为1.3690（±0.0005）；得到约3.3 M CsCl 的溶液。

肝素亲和柱运行缓冲液（缓冲液A）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（请参阅食谱1 2 ）

过滤除菌

肝素亲和柱洗脱缓冲液（缓冲液B）
PBS（请参阅食谱1 2 ）

1 M氯化钠

过滤除菌

MBPTrap 列运行缓冲区（缓冲区A）
20 mM Tris

200毫米氯化钠

pH值至7.4

MBPTrap 柱洗脱缓冲液（缓冲液B）
20 mM Tris

200毫米氯化钠

10 mM麦芽糖

pH值至7.4

IMAC列运行缓冲区（缓冲区A）
20 mM Na 2 HPO 4

500毫米氯化钠

40毫米咪唑

pH值至7.4

IMAC柱洗脱缓冲液（缓冲液B）
20mM Na 2 HP O 4

500毫米氯化钠

500 mM咪唑

pH值至7.4

HM缓冲器
25毫米HEPES

150毫米氯化钠

50毫米MgCl 2

pH值至7.4

HN缓冲区
25毫米HEPES

150毫米氯化钠

pH值至7.4

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
137毫米氯化钠

2.7 毫米氯化钾

10 mM Na 2 HPO 4 （二元）

2 mM KH 2 PO 4 （一元）

pH值至7.4

致谢

该研究被资助的国家研究院的健康：R01-GM066875 （MSC）和R35-GM122564 （MSC）。该协议为在AAVR Ç onstructs总结在迈耶等人。（2019），其修改了Lerch 等人的AAV VLP制备方案。（2012）和Xie 等人的AAV纯化。（2004），所有清单均编在下面。

竞争利益

该作者声明没有冲突的利益。

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