材料和试剂

低结合蛋白管：LoBind 管，Protein LoBind ，2 。0 ml ，PCR clean （Eppendorf，目录号：0030108132）
镍琼脂糖® 高性能，25米的包升（GE Healthcare公司，目录号：17-5268-01），小号撕在4℃下
PVDF注射器过滤器（Euroclone ，普里莫® 注射式过滤器，0 。22 微米倾小号IZE，目录号：EPSPV2230）
50毫升管
15毫升猎鹰管
1.5 ml离心管
水中制备通过超滤，反渗透，去离子和无菌过滤（例如，龙沙® ，目录号：17-724Q）
磷酸盐缓冲盐水（PBS 1 X ，pH 7.4）中（热费舍尔® ，目录号：10010023）
硫酸镍粉，的NiSO 4 （Sigma公司® ，目录号：656895）
氯化钠粉末（Sigma公司® ，目录号：450006）
EDTA [0.5] M（热费希尔® ，超纯pH为8.0，目录号：15575020）
柠檬酸（Sigma公司® ，目录号：251275）
的TRIzol TM 试剂（热费希尔® ，目录号：15596026）
Agilent RNA 6000 Pico试剂盒（Agilent ，目录号：5067-1513）
氯仿（Sigma公司® ，目录号：C7559 ）
异丙醇分子生物学试剂（Sigma公司® ，目录号：I9516）
乙醇（Sigma公司® ，目录号：51976）
超纯TM DNA酶/ RNA酶的蒸馏水（赛默飞世® ，目录号：10977035）
糖原，RNA级（赛默飞世® ，目录号：R0551）
缓冲区S（剥离缓冲区）（请参见配方1）
缓冲区N（请参见配方2 ）
解决方案A 5 x （请参阅配方3）
解决方案B 5x（请参阅配方4）

设备

层流罩
柏克室（VWR，MARI0640230）
的Eppendorf ® 离心机5702，非冷藏，与Swing桶转子（A-4-38）包括为15/50毫升锥形管适配器（的Eppendorf，目录号：5702 000.32）（以段使用ABC的程序）
的Eppendorf ® Thermomixer中舒适（的Eppendorf，目录号：5355.000.011）
VWR ® 试管旋转器（VWR，目录号：10136-084）与旋转式烤架可互换组件，用于：10 X 10/15和16 X 5/7毫升管（VWR，目录号：444-0504），6 X 50ml试管（VWR，目录号：444-0505），36 x 1 。5/2 。0 ml管（VWR，目录号444-0503）
的Eppendorf ® 离心机5415 [R 仪（Eppendorf，型号：离心机5415 R，目录号： 22 62 140-8），冷藏，含转子（Eppendorf，目录号：F-45-24-11）（在程序D中使用）
2100生物分析仪（Agilent Technologies ，目录号：G2939BA）
-80°C冷冻室

程序

琼脂糖珠的剥离和功能化
注意：步骤A1-A3通常是制造商销售的镍功能化基质充分描述的标准“剥离/再充电”协议的一部分。我们仍然包括这些细节，因为它们是我们遵循的过程的一部分。

将珠子转移到50 ml 试管中，在室温（RT）下以600-800 xg离心2分钟，并丢弃上清液而不会干扰珠子颗粒。
加入1：1的珠子体积的纯水，并通过轻轻旋转和颠倒试管进行混合，直到珠子均匀地重新悬浮。然后通过以600-800 xg离心2分钟回收珠子，并弃去上清液。
添加1：1的B 缓冲液S（剥离缓冲液，R ecipe 1 ）的珠子体积，并通过将试管翻转几次来重悬珠子。在室温下孵育5分钟，并通过离心（在600-800 ×g 下2分钟）再次回收珠。丢弃上清液。
注意：此步骤从珠粒中去除镍离子，镍离子变成白色，表明镍从基质中剥离。请记住要注意对含镍溶液进行适当的废物处理，尤其是在步骤A4之后。

添加1：缓冲液N（1个珠体积ř ecipe 2 ）。轻轻旋转试管以获得均匀的珠粒溶液。在室温下孵育5分钟，然后通过以600-800 xg离心2分钟回收珠子。
注意：Ť 他硫酸镍（0.4 M）的u浓度sed的官能珠赋予正电荷到能够捕捉到相当于由得到的数至少囊泡的矩阵相同的生物样品的超速离心（Notarangelo 等人。， 2019）。在此步骤中，珠子显示为浅蓝色。

用1：1的珠子体积的纯水洗涤珠子。离心（600-800 xg ，2分钟）后再次回收它们，并丢弃上清液。
注意：我们通常在层流罩下执行步骤A 5-A7，以减少生物污染的机会。

洗涤珠以1：图1b PBS 1的EAD体积X 。轻轻旋转试管以使溶液中的珠粒均匀。始终通过600-800 xg离心2分钟来回收它们。重复此步骤两次，并使用血清移液器小心缓慢地吸出上清液，并缓慢，恒定地吸取体积，以免干扰微珠沉淀。
注意：去除未结合的镍残留物对于避免污染生物样品至关重要。

用PBS 1 x 重悬珠，以获得20 mg / m x 最终浓度，对应于0.7 x 10 10 -1.8 x 10 10 颗粒/ ml的范围。储存在4℃。
注意：图1 表示：我）的珠的浓度，使用计算出的BURKER 室（MARI0640230，VWR）Ü 的nDer用10倒置显微镜X ，20 X ，40 X 目标; 我我）的珠的尺寸分布，具有30的平均直径± 6.2 微米; 计算为20 x 和40 x 采集中珠子相对于参考比例尺的平均直径; i ii）通过X射线光电子能谱（XPS）测定的氧，碳，氮和镍元素的组成；iiii ）通过电泳光散射（ELS）测定，与剥离的磁珠相比，差分zeta电位（ZP）为+6 mV。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902734--1275 Vito D'Agostino 793135 \ Figs jpg \图2.jpg

图1 。从不同生物液中对EV和EV-RNA进行质量控制和并行回收。A. 用显微镜Leica DM IL LED和LAS X软件在步骤A7中以PBS稀释1：500制备的珠子的代表性图像。比例尺为50 µm 。B. 珠参数中制备小号TEP A7。通过ImageJ软件评估分布，通过X射线光电子能谱（XPS）评估元素组成，通过电泳光散射（ELS）对差异化的ZP 进行剥离（步骤A3），并在PBS中按1:50稀释的功能化（S tep A7）磁珠1 x （标准误< 8％）。C. 从与原代小鼠星形胶质细胞，2 ml 血浆，30 ml 尿液和3 ml 唾液孵育的培养基中回收的EV的分布，这些均从同一名健康志愿者那里收集并并行处理。的Luria-BERTANI媒体孵育纯培养的大肠杆菌的细胞。使用NP250纳米孔（A58835，A5 9044）通过TRPS评估代表性EV分布。D. 在安捷伦Pico RNA芯片中，相对RNA谱加载量为1.5μl （十分之十）的生物分析仪谱。

附件1：

XPS分析：将一滴滴的小珠（已剥离（S tep A3）或用硫酸镍官能化）（步骤A7）在室温下在硅基板上干燥，并在0°起飞角下测量。尽管样品的氧含量（35.3％对37.4％），碳含量（64.3％对59.8％）和氮含量（在EDTA中； 0.4％对0.5％）相似，但镍含量却与剥离的珠粒不同（未检测到））和功能化的磁珠（2.3％）。标准误差不超过图1 B中所报告值的1-2％。

图的样本细节小号1 C和1个D. 初级星形细胞从新生小鼠（P0-1）的皮质衍生的和在6孔板中的标准条件（在DMEM 10％FBS）下生长两周（巴索等人（2013年）。收集前48小时，将36 ml无血清培养基与大约4 x 10 6个接种的细胞（每孔2 ml）一起孵育。如果是OMV，我们加工了50毫升的LB，将一夜之间喂入已经表征OMV分泌的BL21菌株（由Grandi 教授实验室提供）（Fantappiè 等人，2017）。

NBI：EV捕捉
在含有EV /外泌体样脂质体/ OMV的生物液表面上逐滴添加至少1:40体积的步骤A7中制备的珠子，并在室温下轻轻摇动孵育30分钟（使用VWR Tube Rotator）），以避免珠子沉淀。
注意：生物液体包括：细胞培养基，血浆，脑脊液（CFS），尿液，唾液以及从大肠杆菌菌株中回收OMV的LB培养基。我们通常使用25 μ升的每米珠升的：

Ç ELL培养基（培养基中超过2个％FBS的存在将导致在孵育期间珠的聚集，影响电动车的产量;在例如5个％FBS的存在下，我们通常稀释1：5的PBS中，以有效地恢复电动汽车）。重要的是，请参考FBS表征（Wei等人，2016），因为它通常包含非人类来源的小囊泡；
ħ UMAN血浆稀释1：在PBS中的1 3 X （图1 C ^ ）;
ħ UMAN尿的，未稀释的（图1 C ^ ）;
ħ 在PBS中1 3：UMAN唾液稀释1 X （图1 Ç ）。
所有的生物流体以2进行离心分离，800×g下在室温下10分钟，珠开始培养之前除去潜在细胞污染物（即，血小板在尿血浆或白细胞）。

在室温下将混合物以600-800 xg离心2分钟。
注意：为避免干扰珠子沉淀，建议在将细胞上清液//生物液与珠子一起孵育时使用15 ml F alcon管。此外，建议在离心步骤中使用摆桶式转子，以更好地将珠粒放置在试管底部，并使珠粒轻度沉降。

小心地去除（转移或丢弃）上清液。
注意：我们通常将此上清液称为“ EV耗尽培养基”，并在内部对照实验中将其用于EV枚举或下游RNA分析，尤其是在我们比较特定EV转录物的潜在富集的情况下。

NBI：EV洗脱
制备所述洗脱缓冲液1 X 通过稀释溶液A浓缩5 X （- [R ecipe 3）和溶液B浓缩5 X （- [R ECIP 4 e）在0.2微米过滤的PBS 1 X 。轻轻混合获得的溶液。
注意：此缓冲液必须在室温下新鲜制备，然后再使用，并且应在15-20分钟内使用，以从珠粒中有效释放多分散EV。

将0.5到2体积的洗脱缓冲液1 x 加入到珠粒中，并转移到低结合量的试管中。将试管在Thermomixer中孵育15分钟，在600 rpm和28°C的轨道振动条件下进行，以使珠保持悬浮状态，并有利于结合的囊泡解离。孵育期间，每2-3分钟轻拂试管一次，以免沉淀珠子。
注意：低结合管专为蛋白质设计，但可用于最大程度减少与囊泡的相互作用。洗脱缓冲液1 x 的体积决定了获得的EV浓度。

以600-800 xg的速度离心30秒，然后将含EV的上清液小心地转移到新的1.5 ml离心管中。
注意：可选地，我们执行额外的离心步骤以沉淀任何残留的珠子。

可选：重复小号TEP C2恢复的情况下，电动车已使用少于洗脱两珠体积的缓冲液1 X 。
注意：除了步骤C2之外，它还可以确保洗脱珠子的EV的高效洗脱。图1 C 显示了从原代小鼠星形胶质细胞的培养基，2 ml血浆，30 ml尿液和3 ml唾液中回收的EV分布，这些都是从同一位健康志愿者那里收集并并行处理的，以及从E.大肠杆菌细胞。

NBI程序的示意图如图2所示。

D：\ Reformatting \ 2019-12-23 \ 1902734--1275 Vito D'Agostino 793135 \ Figs jpg \图1.jpg

图2.步骤B和C中描述的NBI方法的示意图。除步骤C2之外，NBI方法完全在室温下进行。在步骤A中制备的功能化琼脂糖珠粒在4°C下稳定至少四个月。常规执行步骤B和C中所述的步骤以隔离EV，并持续大约45分钟，具体取决于要处理的样品数量。

从电动汽车中提取RNA
以提取核酸保留了大部分封闭在电动汽车RNA类，我们通常使用的TRIzol TM 试剂原山口（里约热内卢等人，2010）与在程序中次要修饰和以下，以避免/最小化RN的一般准则一个本身污染。

添加0.5米升的的TRIzol TM 每1m试剂升样品的（在洗脱缓冲液1中的悬浮液电动车辆的X ），并简要涡旋均化。在室温下孵育2-3分钟。
添加0.2米升氯仿的每1毫升的TRIzol TM 通过颠倒试管几次并孵育2-3分钟使用试剂，然后均化。
将样品在4°C下以13,000 xg离心10分钟，以获得较低的红色酚-氯仿，中间相和无色的较高水相。
注：我ñ电动车的情况下，界面显示为轻微可见环。

小心地将水相转移到新的试管中，避免从相间或有机层进入移液管的任何污染。
添加0.6米升异丙醇中，以水相，每1m 升的的TRIzol TM 在步骤D1中使用的试剂。短暂涡旋并在冰上孵育5分钟。
在13,000 xg 和4 °C下离心15分钟以沉淀核酸。
注意：衍生自电动汽车的核酸沉淀几乎不可见。可选地，借助糖原，您可以方便地在试管底部观察凝胶状沉淀。

用70％乙醇洗涤沉淀，风干5-10分钟。
注意：我们可以选择跳过70％乙醇的步骤，以免在回收的EVs < 10 7 颗粒/毫升的情况下可能浪费沉淀物质。

重悬7-15粒料μ 升无RNase水的，吹打几次，并保持它在冰上直到储存在-80℃。
注意：传输1.5 μ 升的溶液的在一个新的0.2米升管温育于70℃下和冰-杀来分析由生物分析仪微微芯片的核酸片段的分布。图1 d示出的核酸片段的大小分布从不同的生物流体中回收如图所示1 C.

数据分析

图1A的图像分析是使用ImageJ软件进行的。通过Izon Control Suite软件v3 分析了图1 C中显示的TRPS数据，并使用GraphPad Prism软件v5.1绘制了CSV数据。使用Agilent 2100 Expert软件检查了图1 D 中样品的核酸谱。

菜谱

缓冲区S（剥离缓冲区）
PBS 1 x

下的生物罩，过滤接R 2与0.22 微米的处置部

室温保存

PBS 1 x + 0.5 M NaCl + 50 mM EDTA pH 8.0

过滤器处理0.2 µm

室温保存

缓冲区N
纯水中0.4 M的NiSO 4

用0.2微米过滤器的处置小号

储存在4℃。

解决方案A 5 x
PBS 1 x + 16毫米EDTA

过滤器处理0.2 µm

储存在4°C

注意：此存储可确保数月的稳定性。pH值为7.8是一种质量控制。

解决方案B 5 x
PBS 1 X + 10mM的NaCl的+ 225  μ 1M柠檬酸

用0.2微米的过滤器存款保险计划posals

注意：此存储可确保数月的稳定性。pH值为7.2是一种质量控制。

致谢

我们承认先前的工作（Notarangelo et al 。，2019）描述了NBI程序的新颖性和应用。我们感谢G. Grandi 教授的实验室（特伦托大学，CIBIO）向我们提供了我们用于分离OMV和OMV核酸的大肠杆菌菌株。

该项目得到了VGD和AQ 的Fondazione Cassa di Risparmio Trento e Rovereto （CARITRO）的支持，以及由Marie Sklodowska -Curie（n。752470）授予MB的Horizon 2020研究与创新计划的支持。

利益争夺

MN，AP，AQ和VGD声明了有关NBI方法（P019950WO）的专利申请存在潜在的利益冲突。

伦理

参与本研究的人体标本来自健康受试者，在特伦托大学地方伦理委员会批准的研究框架内，在进行血液和尿液采样之前已获得知情同意。在意大利卫生部批准的一项研究（项目编号603 / 2017-PR）的框架内，将小鼠用于获取星形胶质细胞。

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