材料和试剂

铬圆形笔筒（频谱多样化，目录Ñ 棕土：31570，10.2厘米直径的，为0.64cm杆之间的距离，的10.8厘米初始高度）
400毫升塑料烧杯
任何品系的青春期后雄性或雌性测试小鼠
2只刺激小鼠（例如，切除卵巢的成年雌性小鼠）
注意：对于此过程，至少需要两只刺激小鼠。确保两只刺激小鼠的性别和年龄相同，并且都没有与任何测试小鼠接触（即没有同窝仔）。刺激小鼠可以是雄性或雌性，因为它们在用杯子进行测试的过程中被物理隔离。通常，女性卵巢切除用于提供中性stimul 我来量化不会引发攻击性或性反应社会利益。如有必要，请咨询当地动物保健委员会有关卵巢切除手术的指南。

乙醇70％
去离子水

设备

MiliporeSigma Synergy超纯水净化系统（MiliporeSigma ，型号：SYNSOHFUS）
Windows PC电脑
摄像机（Logitech Webcam C930e，90 ° 视野，1920 x 1080像素）
注意：任何具有类似规格的摄像机都可以可视化整个笼子用于该协议。

测试室（可以使用标准鼠标笼的底部和过滤器顶部，底部的尺寸为29.3 cm x 17.1 cm x 12.7 cm，盖的顶部总高度为20.3 cm）
玉米芯床上用品（使用与家用笼子相同的床上用品）

软件

iSpy（可从www.ispyconnect.com获得的免费开源视频监视平台）
Microsoft Excel
统计软件，例如SAS

程序

设置干净的测试室和线杯
将干净的慕斯笼底部和新的床上用品衬成1-2厘米的深度。使用的笼子应与通常用于住房的笼子相同。试验箱中不应有食物和水。
先用70％的乙醇，然后用去离子水清洗金属杯，确保将其完全清洗并干燥，然后再放入测试室中。线杯的直径和高度应足够容纳一只鼠标。
注意：如果金属丝杯不够高，无法防止鼠标爬到顶部，请用胶水或胶带将400 ml塑料烧杯的底部固定在金属丝杯的底部，以延长金属丝杯的高度，如图的图1的总体高度杯> 14厘米应PREV ë 从栖息在杯的顶部NT最小鼠。

自动生成包含墙壁，网球，室内描述的图片

图1.扩展刺激杯示例。为了防止小鼠攀爬上顶端，杯子的高度可通过附接400米的底部延伸升塑料烧杯中。该杯子延长了3.75厘米，总高度为14.6厘米。至少14厘米的高度通常足以防止鼠标栖息在顶部。

测试区域应与其他实验室活动隔离。如果一个单独的房间不可用，隔离试验区被挂在不透明的床单它，并保持室内安静，尽量减少干扰。
在测试区域内，灯光应昏暗，正上方不应有任何强光，因为光线水平会影响小鼠的探索行为（Morato 和Castrechini ，1989 ）。使用光电平（pproximately 3 - 6勒克司）足以以显现整个保持架和测试小鼠通过视频摄像机。这种照明可以通过间接光来实现。

设置摄像机和计算机以进行视频录制
放置摄像机以确保其捕获测试室的整个区域。摄像机应垂直于笼子的长端放置。摄像机应足够靠近以进行详细定量，但又要足够远以使整个笼子都可视化（图2）。
将相机连接到视频软件iSpy 。
编辑相机设置，将记录时间设置为610 s（10分钟加10 s），最大帧速率设置为10 FPS，缓冲时间设置为2 s。每个试用期为10分钟；另外的10 s用于将刺激鼠标放置在杯子中。

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图2.测试区域设置，包括测试室，照相机，刺激杯和用于光控制的不透明薄片。在此设置中，灯光直接在笼被关断，因此在测试的光是一个来自于不透明片材的另一侧。将实验室胶带放在工作台上，以指示笼子的放置位置一致。

使小鼠适应测试室和房间
将刺激物和测试小鼠带到各自笼中的测试室。运输过程中，笼子应分别用不透明的布或深色塑料袋覆盖。将小鼠关在笼子里，直到准备好让它们适应测试室。放置刺激小鼠和试验小鼠的笼子应至少保持1.5 m的距离，以防止试验前发生任何相互作用。
将一只测试鼠标放在新鲜的测试室中，并将其放在封闭的测试区域内30分钟。（将不会分析此适应期，因此在此期间的视频录制是可选的。）
将刺激小鼠分开放置在封闭区域之外的单独清洁笼中30分钟。
在将测试老鼠适应测试室30分钟之后，将倒置的金属丝杯放在测试室右半部分的中间（图3）。刺激鼠标应该能够探索整个杯子周边。
让鼠标探索杯子10分钟。
注意：将不会分析此探索期，因此在此期间的视频录制是可选的。

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图3.刺激杯与测试仪器的放置

生化测试试验（试验1-8）
开始录像
提起杯子的一侧，然后将刺激鼠标1轻轻放在下面（图4 ）。在10秒钟内将其完全放置在杯子下方。

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图4 。将刺激鼠标放在有线杯下

立即启动秒表或使用时钟计时1分钟。在实验室笔记本中记下一天中的时间。提供了一个可用于此目的的示例工作表，如下所示：补充文件1。
1 分钟后，快速从电线杯中取出刺激鼠标，然后放回其单独的笼子中。
在剩下的9分钟内，让测试鼠标探查测试室并排空电线杯。这标志着第一次审判的结束。
重复步骤D 1- D 5，直到完成8个试验为止，每个试验都使用刺激鼠标＃1。

适应性测试试验（试验9）
在完成第8 个试验后，使用2号刺激鼠标重复图D2-D 4 （图5 ）。这标志着第9 次审判的结束和测试的结束。
注意：如果要立即测试另一只鼠标，请先用70％的乙醇和去离子水清洁电线杯和笼子的侧面，再用纸巾擦干，然后更换被褥。在给定的一天完成测试后，如果在测试之前将刺激小鼠圈养在一起，则可以将它们一起放回笼子中。

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图5 。协议时间表

盲分析视频编码
每个90分钟的测试时间记录为9个单独的10分钟视频记录。
创建一个Excel电子表格（图6A）
在第一列（例如，列A）中，键入文件的原始名称（例如，CageId -Trial＃），以使每一行代表一个试验。
在第二列（例如，列B）中，在Excel单元上方的功能选项卡中键入以下代码：= CHAR（RANDBETWEEN（65,90））和CHAR（RANDBETWEEN（65,90））和RANDBETWEEN（10,99）
使用单元格右下方的角并将其向下拖动以将该功能分配给所有行以创建键。
突出显示代码并复制它们。右键单击右侧列的第一个单元格（例如C列），选择“ Paste Special”，然后选择“ Paste Values”（图6B）。（如果未使用“粘贴值”，则每次在电子表格中进行更改时，由代码生成的值将继续更改。）
根据相应的代码重命名文件。按文件名的字母顺序对文件排序，以乱序乱序排列文件（图6C）。在分析过程中，遵循编码文件名的字母顺序。
注意：重命名文件以进行盲法分析时，请确保使用其他方法来识别视频。例如，以iSpy 录制的视频的时间在图像的一角，可以用作备份标识。运行行为测试时，请记下笔记本中每次试用的时间，以防文件名错误。

一旦盲法分析完成，请参考在Excel工作表中创建的键，以将代号为文件的代码与相应的鼠标和试用版匹配。
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图6 。在Excel和示例盲文件上随机文件命名/编码的示例。答：“密钥”是通过在列A中列出原始文件名在Excel中创建的。该函数被添加到相邻列中以产生随机的“盲”名。B.复制名称并选择“特殊粘贴：值”后，密钥已完成并且不会更改。从那里开始，各个文件名都用这个随机的4位数字名重命名。C.最后，文件按4位数字字母顺序排序。对视频评分时，请按照字母顺序对视频进行混洗以进行盲目分析。

数据分析

社交互动的量化

可以使用秒表来量化社交互动。交互作用的定义是测试老鼠的鼻子与刺激杯或刺激鼠标的直接接触，或测试老鼠的鼻子在金属杯附近1厘米内的位置，鼻子面向刺激老鼠（图7）。从将笼顶放到笼子上到1分钟后的这段时间进行社会互动分析。每次试验用秒表评估并打分1分。绘制数据，如图8A所示。

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图7.鼠标参与“社交互动” 。在左图中，测试鼠标远离杯子，并且其鼻子不在杯子的1厘米之内。此行为将不被视为嗅探时间。在右图中，测试鼠标的鼻子直接与杯子接触，并面向杯子；因此，该行为包括在嗅探时间中。

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图8.来自适应/适应测试的示例数据。答：在引入新小鼠时，测试小鼠（n = 1）的社会兴趣（嗅觉时间）在前8次试验中降低，而在第9 次试验中增加。B.在第一次，第四次和第八次试验中重复自我修饰的时间。此示例说明了代表性的Dbi + / + 和Dbi -/- 小鼠（每个n = 1）。这些基因型之间的全面比较在Ujjainwala et al 。，2018中进行了介绍。

重复自我修饰

重复的自我修饰也可以使用秒表对每次试验中至少2-10分钟的视频部分进行评分。重复自我修饰被定义为至少10秒的修饰时间，两次连续修饰之间的间隔不超过5秒（Silverman 等，2010）。为了进行初步分析，请记录试验1，试验4和试验8的2-10分钟的自我修饰时间，以评估测试开始，中期和结束时的修饰情况。绘制数据，如图8B所示。将R emaining试验，如果能更全面的量化需要进行分析梳理重复一次。如果对于每个试验而言，从测试笼子中取出刺激性老鼠的操作均不能始终如一地迅速进行，则可以使用不同的间隔，例如最小3-10分钟。

统计分析

将数据输入SAS 或其他统计软件。
使用重复测量方差分析（ANOVA）分析嗅探时间和重复修饰时间（以s 为单位）。
输入试验作为受试者内部因素，并输入性别和基因型作为受试者之间因素。
要测试社会兴趣方面的差异，请比较试验1-9 中的嗅探时间（s ），以检验其重要性。此外，比较试验1-8中汇总的总嗅探时间，以测试向第一只刺激小鼠显示的总关注水平的显着差异。
要测试社会认可度的差异，请比较试验8和9 中的嗅探时间（s ），以检验其重要性。
要测试重复自我修饰的差异，请在量化修饰的整个间隔内比较重复修饰时间（以秒为单位）。

笔记

除非明确研究社交隔离的影响，否则所有测试小鼠都应分组饲养直到进行测试，因为社交隔离会导致社交行为发生变化（Lander 等，2017 ）。
测试应在一天中的一致时间进行。例如，我们的实验室通常在9:00 AM和1:00 PM之间执行这些测试（相对于7:00 PM熄灭）。
如果可能，应将刺激小鼠和试验小鼠安置在不同的动物设施室中。如果该选项不可用，则将装有刺激物的笼子和笼子之间的至少一排的试验小鼠物理分开。如果动物设施使用完全封闭的单独通风的笼子（IVC），从而将嗅觉和信息素的信号降至最低，则建议进行隔离，以免产生视觉干扰。
在实验期间，不应将刺激鼠标第一次放置在杯子下方。刺激小鼠倾向于表现出反映焦虑的行为，例如响应于最初暴露于杯子而粘在杯子的电线上或咬笼。在运行实验小鼠之前，通过使用非测试小鼠来训练刺激小鼠。
当在笼子之间运输小鼠（测试或刺激）时，应尽量减少移动鼠标的时间，而无需与下方的支撑表面接触，因为将鼠标悬吊大量时间是鼠标的压力源（Deacon，2006）。可以通过将鼠标放在干净的实验室外套覆盖的研究者前臂的袖子上，或者将其放在尾部带有光约束的笼子盖的顶部上，来提供这种支撑。
在我们的研究中，在前8次试验中，大多数小鼠继续表现出习惯性（如嗅觉时间持续减少所表明的）。但是，如果测试小鼠较早地表现出更强的适应性，则有可能减少“适应性阶段”之前的试验次数。
如果测试鼠标要花费大量时间在被铁丝罩遮盖的部分笼子中，请考虑放置摄像头，以便从上至下查看。
跨多种行为分析对表型进行交叉验证可以帮助巩固有关基因突变或其他操作效果的结论。因此，除了此处介绍的社交习惯/适应能力测试外，建议对小鼠进行另一项具有社会意义的检测方法，例如三室测试（Yang 等，2011）。

致谢

我们感谢埃米莉· 里斯曼（Emilie Rissman）博士对社交习惯/适应测试程序的有用建议。这项工作得到了脑与行为研究基金会（NARSAD Young Investigator Grant 24086，CAC）的支持。NIH / NINDS赠款R01 NS105825和R03 NS103029也支持CAC。该协议改编自Ujjainwala 等人，2018。

利益竞争

该作者声明没有竞争利益。

伦理

所有动物方案都认可由该机构的动物护理和使用委员会的该大学的伊利诺伊州的在厄巴纳-香槟分校（17237）。

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