材料和试剂

用料

1. 移液器提示：0.5-10 微升，10-200 微升，200-1,000 微升（格雷纳生物一，产品目录号：771291，739290，740290）

2. Eppendorf管（Greiner Bio-One，目录号：616201）

3. 的Amicon ® 超4离心过滤器

试剂种类

GSK-3肽底物YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQ（pS ）EDEEE（HQ），1 mg（ Biaffin GmbH＆Co KG，proteinkinase.de，目录号：PEP-GSK-001，储存温度：-20 °C）
激酶-Glo ® 发光激酶测定法，10个ml的（Promega公司，目录号：V6711，存储温度：-20 ℃下）
激酶格洛® 底物，1小瓶（冻干）（Promega公司，目录号：V378A）
激酶格洛® 缓冲液，10 ml的（Promega公司，目录号：V379A）
5'-三磷酸腺苷（ATP）水合二钠盐，1 mg（Sigma-Aldrich，目录号：FLAAS，储存温度：-20 °C ）
Tb GSK-3在杆状病毒表达系统中表达，如先前所述（Efstathiou 等，2019）（储存温度：表达后立即使用或在-80°C 甘油储备）。
笔记：

TbGSK-3s不能从市场上买到。为了使用它，必须按照参考书目（Efstathiou et al。，2019）中描述的协议在实验室中表达它。简而言之，如Efstathiou等人所述。，2019中，pTriEx-1.1-TbGSK3s质粒cotranfected 与的BaculoGold DNA导入草地贪夜蛾（的Sf9）昆虫细胞中和制造时的TbGSK3s，激酶是在Ni纯化2+ -nitrilotriacetate（的Ni-NTA）树脂根据制造商的说明（Qiagen）。
激酶级分应立即使用以确保最大活性。如果它们在-80°C下作为甘油原液存储，则应在分离后最多3-5天使用，以避免完全丧失激酶活性。
32靛玉红模拟小号THA 吨合成如先前所描述（梅杰等人，2003 ; Polychronopoulos 等人，2004 ; Ferandin 等人，2006 ; Vougogiannopoulou 等人，2008年），（储存温度：4 ℃，远来自阳光）
MOPS（3-（N-吗啉代）丙烷磺酸）（Applichem ，目录号：A2947，储存温度：RT）
MgCl 2 （六水合氯化镁）（Applichem ，目录号：A1036，储存温度：RT）
EGTA（乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N 'N ' - 四乙酸）（Sigma-Aldrich公司，目录号：E4378，贮存温度：RT）
Pierce TM DTT（二硫苏糖醇）（ThermoFisher Scientific，目录号：20290，储存温度：4 °C ）
Ni-NTA琼脂糖（25毫升）（QIAGEN，目录号：30210，储存温度：4 °C ）
的Amicon ® 超4离心过滤单元（默克-Millipore公司，目录号：UFC801008，贮存温度：RT）
咪唑用于分子生物学（Applichem ，目录号：A1378,0050，储存温度：RT）
激酶测定溶液（10x）（请参阅食谱）

设备

水浴（Julabo ，ED-13开放式加热浴循环器/停产产品）
GloMax ® 20/20光度计（Promega公司，型号/目录号：2030-100 / E5311）
Eppendorf 5417R冷冻离心机（Marshall Scientific，产品代码：EP-5417R）

软件

微软® Office Excel中2013
GraphPad Prism v6软件

程序

的制备激酶-Glo ® 试剂
混合至10毫升激酶格洛® 与冻干激酶格洛缓冲® 底物。
确保底物粉末稀释完全，溶液澄清。
等分试样中的激酶-Glo ® 试剂，并将其存储在-20 ℃下直到使用。

P 的赔偿激酶测定溶液10倍
按照食谱中的说明准备10倍激酶测定溶液，等分并保存在-20 °C 直至使用。

测定具有最高酶促活性的Tb GSK-3s馏分
对激酶的不同分离部分（Tb GSK-3s）进行激酶测定。将分离的级分已对Ni纯化2 -nitrilotriacetate（镍- NTA）根据制造商的说明书（Qiagen）用琼脂糖洗脱不同的咪唑浓度（的馏分小号A，B，C和d使用50,150，250和400 纳米分别咪唑）如先前所述（Efstathiou 等人，2019）。
注：隔离的TbGSK-3的级分使用随后浓缩的Amicon ® 超4离心过滤器和再稀释在激酶测定溶液1 X ，以从样品中除去过量的咪唑。高浓度的咪唑可能会干扰激酶测定，从而提供错误的结果。

将水浴温度调节至30 °C。
解冻激酶-Glo ® -20试剂℃下于4 ℃。
从-20 °C 到4 °C 解冻激酶测定溶液10倍。
制备主混合物溶液（含有1x终浓度激酶测定溶液，10 μΜ ATP，10 μΜ GSK-3的肽底物），如下（最终体积40描述μ 每个样品1）：
4 微升* [样本数]的10×激酶测定溶液

1 微升* [样本数]的400 μΜ ATP

1.2 微升* [样本数]的333 μΜ GSK-3的肽底物

23.8 微升* [样本数]的的DDH 2 ö

上下移液均匀混合主混合物。
在每个Eppendorf中添加30μl 的预混液。
在每个试管中添加10μl 每个Tb GSK-3s分离的级分（A，B，C和D 级分s ）。
为每个分数重复或三份。
通过上下移液将样品充分混合。
旋转样品。
将样品在30 °C的水浴中孵育30分钟。
通过添加40停止反应微升冷的激酶-Glo ® 试剂（4 ℃下）。
旋转样品。
测量在发光GloMax ® 20/20光度计1秒。
注意：使用名为“ Kinase-Glo”的“即用型” Promega协议阅读发光。

确定具有最佳酶促活性的Tb GSK-3 的洗脱比例（请参阅数据分析A）。
立即将激酶用于激酶测定，或将其储存在-80 °C 的50％（v / v）甘油中。
笔记：

在我们的分析中，TbGSK-3s的纯化洗脱级分C（最初用250 mM咪唑洗脱）确定为具有较高酶促活性的级分（请参阅数据分析A）。
建议洗脱后立即使用激酶TbGSK-3s馏分，以确保最大活性。激酶的50％（v / v）甘油储备根据其在-80°C下储存的时间段而降低了活性，分离后应使用长达3-5天，以避免激酶完全损失活动。

确定最佳蛋白激酶（Tb GSK-3s）浓度
用Tb GSK-3s 的适当洗脱级分（洗脱级分C）进行激酶测定，以上确定为具有较高酶促活性的Tb GSK-3s。
遵循步骤C2-C4。
制备主混合物溶液（含有1x终浓度激酶测定溶液，10 μΜ ATP，10 μΜ GSK-3的肽底物），如下（最终体积40描述μ 每个样品1）：
4 微升* [样本数]的10×激酶测定溶液

1 微升* [样本数]的400 μΜ ATP

1.2 微升* [样本数]的333 μΜ GSK-3的肽底物

23.8 微升* [样本数]的的DDH 2 ö

遵循步骤C6-C7。
加入10 微升的铽在不同浓度（含0，2，5，10，15，20，40，100和200纳克分离馏分C GSK-3 Tb的GSK-3，用双蒸水稀释2 O）。
注意：可以根据需要，可以使用不同浓度的激酶依赖于参数的实验。

遵循步骤C9-C15。
确定用于激酶测定的Tb GSK-3s 的最佳浓度（请参阅数据分析B）
注意：在我们的分析中，确定40 ng TbGSK-3s（组分C）为激酶测定的最佳TbGSK-3s浓度（请参阅数据分析B）。馏分C含有20纳克/ μ 升TbGSK-3脂肪酸（参见数据分析B）的。

ATP浓度的测定
用Tb GSK-3s分离的级分C 进行激酶测定。
遵循步骤C2-C4。
制备主混合物溶胶ution（含有1X激酶测定溶液的最终浓度，40纳克的Tb的GSK-3分离馏分C，10 μΜ GSK-3的肽底物），如下（最终体积40描述μ 每个样品1）：
4 微升* [样本数]的10×激酶测定溶液

2 微升* [样本数]的Tb的GSK-3中分离馏分C

1.2 微升* [样本数]的333 μΜ GSK-3的肽底物

23.8 微升* [样本数]的的DDH 2 ö

遵循步骤C6-C7。
加入10 微升的ATP在不同浓度的（0，0.5％，1，2，5，7.5，第10和50 μΜ ）。
注意：如果需要，可以根据实验参数使用不同浓度的ATP。然而，对于ATP浓度高达10 μΜ ，您可以用激酶-Glo ® 试验（Promega），0-100为μM的ATP，您可以用激酶-Glo ® 加试验（Promega）和0-500 μM，您可以用激酶-Glo ® 最大试验（Promega）。

遵循步骤C9-C15。
绘制反应速率DY / DX与ATP浓度的关系图，并确定ATP的Vmax和Km（请参见数据分析C）
注意小号：

DY = [ （RLU×10 ^ 6 在30 反应的分钟）- （RLU×10 ^ 6 时REAC的0分钟和灰）]
DX =反应时间= 30分钟
Vmax是最大反应速率，代表当酶被底物饱和时的反应速率。
Michaelis-Menten常数（Km）的值在数值上等于反应速度为Vmax一半时的底物浓度。
使用40ng TbGSK-3s级分C 确定ATP的Km等于6.3μM （参见数据分析C）。
使用在用TbGSK-3s进行的所有激酶测定中相同的标准ATP浓度，其等于ATP的Km（6.3μM ）。

GSK-3肽底物浓度的测定
用Tb GSK-3s分离的级分C 进行激酶测定。
遵循步骤C2-C4。
制备主混合物溶液（含有1x终浓度激酶测定溶液，40 纳克的Tb的分离馏分C，10 GSK-3 μΜ ATP）如下（最终体积40描述μ 每个样品1）：
4 微升* [数量的样本] 10X激酶测定的

2 微升* [样本数]的Tb的GSK-3中分离馏分C

1.2 微升* [样本数]的400 μΜ ATP

23.8 微升* [样本数]的的DDH 2 ö

遵循步骤C6-C7。
添加10 微升GSK-3底物的不同浓度的（0，1，2，5，10和50 μΜ ）。
注意：根据实验参数，可以根据需要使用不同浓度的底物。

遵循步骤C9-C15。
绘制反应速率DY / DX与GSK-3 c 浓度的关系图，并确定GSK-3底物的Vmax和Km（请参见数据分析C）
注意小号：

GSK-3底物的公里被确定等于5.8 μΜ 使用40纳克TbGSK-3的（级分C）（见数据分析C）。
使用在用TbGSK-3s进行的所有激酶测定中相同的标准GSK-3底物浓度，其等于GSK-3底物的Km（5.8μM ）。

Tb GSK-3s抑制剂的鉴定
用Tb GSK-3s分离的级分C 进行激酶测定。
遵循步骤C2-C4。
制备主混合物溶液（含有1x终浓度激酶测定溶液，40的纳克Tb的GSK-3分离馏分C）以下（终体积40如所描述的μ 每个样品1）：
4 微升* [样本数]的10×激酶测定溶液

2 微升* [样本数]的Tb的GSK-3中分离馏分C

22.7 微升* [样本数]的ddH 2 O

遵循步骤C6-C7。
加入10μl 不同浓度的抑制剂（0、0.01、0.03、0.1、0.33、1 和3.33μM ）。
注意：如果需要，可以根据实验参数使用不同浓度的抑制剂。

添加5.8 μΜ 各样品（0.7中GSK-3的肽底物微升的333 μΜ GSK-3的肽底物）。
添加6.3 μΜ ATP每个样品（0.6 微升的400 μΜ ATP）。
遵循步骤C9-C15。
绘制Tb GSK-3s活性抑制百分率与抑制剂浓度的关系图，并确定抑制剂的IC 50 （数据分析D）
注意：没有抑制剂的样品用作阳性对照。此外，使用包含没有ATP，作为阴性对照（4样品微升激酶测定溶液10倍，2 微升含TbGSK-3分离馏分C 40 纳克Ò ˚F激酶，0.7 微升GSK-3肽底333 μΜ 为了获得5.8 μΜ 终浓度，33.3 μ 升的DDH 2 O）。

数据分析

具有酶活性的Tb GSK-3s馏分的测定：
包含活性激酶的部分将利用ATP磷酸化GSK-3底物，因此样品中ATP的浓度将降低。结果，荧光素将不再具有与之相互作用的相同量的ATP，并且该反应将产生较少的光。因此，样品的发光（RLU）测量值将低于阴性对照（不含激酶的样品）之一。
收集Tb GSK-3s 洗脱级分的发光读数。
计算每个部分的发光平均值和标准偏差。
绘制发光值图（图2）。
发光值最低的部分是具有最佳酶活性的部分，可用于激酶测定的进一步实验。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-1-20 \ 3493--1902945--1257 Antonia Efstathiou 810565 \图JPG \图2-updated.jpg

图2.分离的发光值Tb的GSK-3级分A，B，C和D 的Tb的GSK-3级分A，B，C和d在Ni纯化2 -nitrilotriacetate（镍- NTA）树脂根据制造商的说明（马歇雷-Nagel）与洗脱不同的咪唑浓度（FR 动作小号A，B，C和d使用50,150，250和400 nM的分别咪唑）如先前所述（Efstathiou 等人，2019），并且随后它们使用浓缩的Amicon ® 超0.5 ml的离心过滤器并重新在激酶测定溶液1X为了从样品除去过量的咪唑稀释。激酶测定溶液1x（无激酶）用作阴性对照。

确定最佳蛋白激酶（Tb GSK-3s）浓度
使用Bradford蛋白测定法（He ，2011年），并基于W 酯印迹法中信号的强度，并与标记条带中已知蛋白的量进行比较，通过半定量方法确定每个馏分中存在的激酶量。鉴于激酶级分放入的体积W¯¯ 西部时代印迹是恒定的并且是已知的。
笔记：

W 酯印迹的方案和分析程序，包括所用的试剂和材料，可在参考书目中找到（Mahmood 和Yang，2012 ；Heiber 等人，2014 ）。
Bradford蛋白测定用于定量每个洗脱级分中的总蛋白量，而W 酯图用于说明每个级分中TbGSK-3的存在。
（泳道5分离的馏分C 在图3 - 铽ģ 其从洗脱的SK-3级分的Ni 2 -nitrilotriacetate（镍- NTA）树脂的Ni 2+ 使用珠250 mM咪唑）估计为含有20 纳克/ μ 升的铽GSK-3（图3）。
收集包含不同浓度的Tb GSK-3 的样品的发光读数。

图3.分离的蛋白质印迹Tb的GSK-3级分A，B，C和D 30 μ 的升Tb的GSK-3级分A 。（第3道），B 。（第4泳道），C 。（泳道5）和d 。（泳道6），将其在Ni纯化2 -nitrilotriacetate（镍- NTA）树脂与洗脱不同咪唑浓度（50，150，250和400的纳米分别咪唑），而其余的Ni 2 -nitrilotriacetate（镍- 使用针对L GSK-3 的亲和纯化多克隆抗体，在W 酯印迹中鉴定洗脱时的NTA）树脂（泳道2）。该w ^ 西部时代印迹在的理论分子量表现出独特的带Tb的GSK-3（40 kDa的）。在泳道1中，30 μ 的激酶测定溶液升1 X 也被用作阴性对照。

表1. 当使用不同体积的分离级分C 时，激酶测定中使用的Tb GSK-3s以ng表示。在列标题为“组分C”，将洗脱的激酶的量Tb的GSK-3（在表示μ 升），将其在每个样品中加入，给出。在标题为“ Tb GSK-3s” 的栏中，计算了与每个样品中添加的馏分C的体积相对应的激酶的相应浓度。相应激酶浓度的计算基于数据分析部分第B1段所述的Bradford蛋白质测定法提供的蛋白质浓度。

分数C （μl）

TB GSK-3s（ng）

0

0

0.1

2

0.25

5

0.5

10

0.75

15

1个

20

2

40

5

100

10

200

计算发光的每个平均值Tb的GSK-3脂肪酸浓度（浓度Tb的GSK-3在每个样品中根据馏分C（的加入体积上μ 升）示于钽BLE 1）。
绘制发光值与样品中Tb GSK-3含量的关系图（图4）。
在尚未饱和的最高位置减小发光值的样品在图中用红色圈出，它是包含2μl 馏分C（40 ng Tb GSK-3s）的样品（图4）。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-1-20 \ 3493--1902945--1257 Antonia Efstathiou 810565 \图JPG \图4-updated.jpg

图4.发光值与Tb GSK-3s 数量的关系图。在测量时，发光（RLU）在Y轴表示每个样品的值GloMax ® 20/20光度计，它是在RLU * 10表示6 。X轴代表所述激酶的体积（铽在GSK-3）μ ，其在每个样品中加入升。

ATP和GSK-3底物Km的测定
收集包含不同浓度的GSK-3底物或ATP的样品的发光读数。
计算每个样品的发光平均值（RLU）和标准偏差。
计算每个样品的DY / DX反应速率（如表2所示为ATP，表3所示为GSK-3底物），
其中DY = [（（反应30分钟时RLU x 10 6 ）– （反应0分钟时RLU x 10 6 ）]]

DX = 反应时间= 30 分钟

表2. 不同ATP浓度下DY / DX反应速率的计算

ATP（μΜ）

RLU a
[RLU x 10 6

t0 = 0 分钟]

RLU b
[RLU x 10 6

t1 = 30 分钟]

DY
（RLU a -RLU b ）

DX
（反应分钟）

反应速率（DY / DX）

0

0

0

0

30

0

0.5

2.52

1.21

1.31

30

0.04 4

1个

6.31

0.86

5.45

30

0.18 2

2

9.38

3.38

6 .00

30

0.2 00

5

18.81

11.61

7.2 0

30

0.24 0

7.5

23.66

15.26

8.4 0

30

0.28 0

10

28.84

19.84

9 .00

30

0.3 00

20

68.37

54.33

14.04

30

0.468

50

121.65

106.3 0

15.35 0

30

0.51 2

RLU代表发光。a 是在反应开始时（t0 = 0分钟）测得的RLU（发光）。b 是在反应结束时（t1 = 30分钟）测得的RLU（发光）。DY是反应开始和结束时发光测量之间的差。DX表示两次发光测量之间的反应时间（反应总时间，30分钟）。

表3.不同浓度的GSK-3底物的DY / DX反应速率的计算

GSK-3底物（μΜ ）

RLU a
[RLU x 10 4

t0 = 0 分钟]

RLU b
[RLU x 10 4

t1 = 30 分钟]

DY
（RLU a -RLU b ）

DX
（反应分钟）

反应速率（DY / DX）

0

0

0

0

30

0

1个

29.36

24.86

4.50

30

0.150

2

28.81

23.35

5.46

30

0.182

5

26.44

19.84

6.60

30

0.220

10

27.67

18.07

9.60

30

0.320

20

28.69

14.59

14.10

30

0.470

50

28.99

14.29

14.70

30

0.490

RLU代表发光。a 是在反应开始时（t0 = 0分钟）测得的RLU（发光）。b 是在反应结束时（t1 = 30分钟）测得的RLU（发光）。DY是反应开始和结束时发光测量之间的差。DX表示两次发光测量之间的反应时间（反应总时间，30分钟）。

绘制反应DY / DX速率与ATP浓度（图5）和GSK-3底物（图6）浓度的关系图。
确定图中的Vmax 。
在图中找到Vmax / 2，并确定ATP和GSK-3底物的Km 。

图5.反应速率DY / DX与ATP浓度的关系图。在X轴上，给出了每个样品的ATP浓度（μM ）。在Y轴上，显示了对应于具有不同ATP浓度的每个样品的反应速率DY / DX ，如表2所示。在图中计算反应的Vmax，它等于0.51（Vmax / 2 = 0.255）。。在绘制对应的ATP浓度的Vmax / 2值之后，ATP的Km被确定为等于6.3μM 。

图6.反应速率DY / DX与GSK-3底物浓度的关系图。在X轴上，给出了每个样品的GSK-3底物浓度（μM ）。在Y轴上，显示了对应于具有不同GSK-3底物浓度的每个样品的反应速率DY / DX，如表3所示。在图中计算反应的Vmax，它等于0.48（Vmax / 2 = 0.238）。在绘制相应的Gmax-3值的GSK-3底物浓度后，确定GSK-3底物的Km等于5.8μM 。

Tb GSK-3s抑制剂的鉴定及其IC 50 值的计算
收集包含每种可能的Tb GSK-3s抑制剂浓度不同的样品的发光读数。
收集阴性和阳性对照的发光读数。
计算每个样品的发光平均值（RLU）和标准偏差。
。减去来自所有样品的平均RLU值和从阳性对照阴性对照的平均RLU值。
阳性对照的RLU值（减去阴性对照RLU值之后）对应于100％Tb GSK-3s活性。
使用以下公式计算每种浓度的抑制剂对Tb GSK-3s活性的抑制百分比：
抑制百分比=（抑制剂的RLU值/阳性对照的RLU值）x 100

注意：Ť 他RLU公式中使用的值是后的那些减法阴性对照RLU值的。

绘制Tb GSK-3s活性抑制百分率与抑制剂浓度的关系图。图7、8、9和10分别显示了没有抑制作用的类似物以及对Tb GSK-3具有弱，中和强活性的类似物的指示性批次。
确定抑制剂的IC 50 值。IC 50 值代表以50％的速率抑制激酶活性的抑制剂的浓度，因此与阳性样品相比，该抑制剂的浓度增加了样品发光50％（阳性对照是不含抑制剂的样品，但包含激酶，GSK-3底物和ATP）。

图7.对Tb GSK-3s 无抑制活性的类似物的指示图。在X轴上，显示了每个样品中抑制剂的浓度（μM ）。在Y轴上，表示了Tb GSK-3s活性的％抑制。通过对应于引起Tb GSK-3s活性50％抑制的抑制剂的浓度，在曲线图中计算IC 50 （以μM计）。计算用于当前指示图的化合物的IC 50 > 3.5μM 。

图8.对Tb GSK-3s 具有弱抑制活性的类似物的指示图。在X轴上，显示了每个样品中抑制剂的浓度（μM ）。在Y轴上，表示了Tb GSK-3s活性的％抑制。通过对应于引起Tb GSK-3s活性50％抑制的抑制剂的浓度，在曲线图中计算IC 50 （以μM计）。该IC 50 用于当前的化合物的指示情节被计算0.7 3 μΜ 。

图9.具有对Tb GSK-3s的modearte 抑制活性的类似物的指示图。在X轴上，显示了每个样品中抑制剂的浓度（μM ）。在Y轴上，表示了Tb GSK-3s活性的％抑制。通过对应于引起Tb GSK-3s活性50％抑制的抑制剂的浓度，在曲线图中计算IC 50 （以μM计）。计算用于当前指示图的化合物的IC 50 为0.59μM 。

图10.对Tb GSK-3s 具有强抑制活性的类似物的指示图。在X轴上，显示了每个样品中抑制剂的浓度（μM ）。在Y轴上，表示了Tb GSK-3s活性的％抑制。通过对应于引起Tb GSK-3s活性50％抑制的抑制剂的浓度，在曲线图中计算IC 50 （以μM计）。计算用于当前指示图的化合物的IC 50 为0.06μM 。

菜谱

激酶测定液（10x ）
MOPS（p ħ = 7.5）的500mM

的MgCl 2 的200mM

EGTA 100毫米

DTT 20毫米

注：分装于eppendorf管，并储存在- 20 ℃的。

致谢

作者在此感谢纽约洛克菲勒大学的George AM Cross 教授捐赠了布鲁氏T. brucei BSF 90-13株，Pevelope Mavromara 教授对杆状病毒表达系统的建议和支持。我们还要感谢IKY-SIEMENS博士后卓越奖学金2016-2017'合同号2016-017-0173-10398'和COST行动BM0801的财政支持。该协议是基于Tb的GSK-3激酶测定中提出（Efstathiou 等人。，2019 ），反对进行激酶测定协议的修改版本leismania 升在GSK-3 Xingi 等。，2009年。

利益争夺

两位作者都宣称他们没有利益冲突。

参考文献

Cohen，P。（1999）。蛋白激酶抑制剂的开发和治疗潜力。Curr Opin Chem Biol 3（4）：459-465。
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