材料和试剂

胶带
0.5 ml Eppendorf管
牙签
1.5 ml比色皿
塑料托盘，直接花盆，重型全种子托盘（无孔），货号：2012137PT（图1）
塑料插入物（直接盆栽，种子托盘插入物40，目录号：2012111PT）（图1）
塑料培养皿（Sarstedt ，目录号：821.473）
移液器吸头（Sarstedt ）
2 ml塑料管（Sarstedt ，目录号：72.695.500）
塑料架，用于2 ml试管，Eppendorf
塑料比色杯（品牌，货号：759115）
种子拟南芥拟南芥（可以得到，例如，从NASC 拟南芥库存中心，http://arabidopsis.info/BasicForm）
Sand，Quarzwerke （德国Frechen ）
土壤（例如，CAS11土壤，Bulgarelli 等，2012 ）
Murashige Skoog（MS）培养基（Duchefa Biochemie ，目录号：MO222.0025），在室温下保存
蔗糖（Sigma，目录号：S7903-1KG），在室温下保存
4-硝基苯基硫酸钾（Sigma，目录号：N3877-1G），储存在-20 °C
对硝基苯酚（Merck，目录号：48549），储存在-20 °C
二水合氯化钙（Sigma，目录号C3881-1KG），在室温下保存
氢氧化钠（NaOH）（Sigma，目录号：71687-500G），储存在室温下
三水合乙酸钠（Sigma，目录号：S8625-500G），在室温下保存
四水合硝酸钙（Ca（NO 3 ）2 · 4H 2 O）（Merck，目录号：C1396），在室温下储存
硝酸钾（KNO 3 ）（默克目录号：P8394），在室温下储存
钾磷酸二氢（KH 2 PO 4 ）（Merck公司，目录号：1.04873），储存于RT
EDTA铁（Fe-EDTA）（梅克（Merck），目录号：E6760），存储在RT
六水合氯化镁镁（MgCl 2 · 6H 2 O）（Merck，目录号：M2670），在室温下储存
液氮
冰醋酸（默克公司，目录号：A6283），在室温下存放
次氯酸钠溶液（NaClO ），12％，Cl （Roth，目录号：9062.4）
盐酸（HCl ）37％（Merck KGaA ，目录号：1.00317.1000），在室温下保存
琼脂糖（Sigma，目录号：A9539-500G），在室温下保存
甲苯（Sigma，目录号：34866-100 ml），在通风橱中于室温保存
改良的Long Ashton解决方案（请参阅食谱）
0.5 M醋酸盐缓冲液（请参阅配方）
0.005量m P - 硝基苯溶液（见配方）
0.5 M氯化钙溶液（请参阅食谱）
0.5 M氢氧化钠溶液（请参阅食谱）
标准对硝基苯酚溶液10 mM（100 ml）（请参阅食谱）
半强度MS培养基，含蔗糖（1 L）（请参阅食谱）

图1的照片（甲）的塑料托盘和（乙）在serts 用于植物生长

设备

玻璃烧杯250毫升
钳子
移液器（Eppendorf ）
天平（Sartorius ）
玻璃烧杯
三洋生长室，光照10 小时/ 黑暗14 小时，22 °C
旋转振动筛LTF （Labortechnik ，Intelli - Mixer，RM-2L ）
涡流（LMS，型号：VTX-3000L）
培养箱为37 ℃下（热科学，Heratherm 培养箱）
离心机（Eppendorf，5424 ）
分光光度计（Eppendorf ）
油烟罩
电脑
梅我Ç CATOR

程序

拟南芥拟南芥种子消毒
将少量种子（约10 µl）放入0.5 ml Eppendorf管中。
将敞口管放入干燥器内部的管架中（图2）。
将125 ml的次氯酸钠溶液加入250 ml的玻璃烧杯中，并置于种子附近。
向液体中加入2.5 ml浓HCl，形成氯气，然后迅速关闭干燥器盖。
消毒种子3小时。

图2照片S的（甲）打开或（乙）用于种子消毒封闭干燥器

初始平台准备
高压釜半- 用0.8％琼脂糖和0.5强度MS培养基％蔗糖和倒成圆形的Petri 培养皿，让其设置。
用无菌牙签将无菌拟南芥种子小心地放在琼脂上。每厘米2 1个种子。
用胶带密封板。
将板放入冰箱中2-3天进行分层。
将平板放入植物生长柜中9天（光照10小时/黑暗14小时； 22 °C，100 µE m -2 s -1 ）。

制作的托盘
将土壤与无菌的（高压灭菌的）沙子1：9（V / V）混合。
将塑料插件放入纸盘。
用土壤- 沙子混合物填充插入物。
稍加水
使用镊子小心地将每个插秧移入一株幼苗，轻轻覆盖根部。
多浇一点水，以保持土壤湿润。
用盖子盖住托盘。
将托盘放入植物生长柜（10 h光照/ 14 h黑暗； 22°C，100 µE m -2 s -1 ）中放置2周，三天后将其揭开，并每天用改良的Long Ashton溶液浇水。

图3. （A ）转移前带有幼苗的培养皿和（B ）拟南芥生态型托盘准备收集材料的照片

采集的样本进行硫酸酯酶活性
小心地从土壤中去除植物。
成一个2ml微量管收集约1g土壤- 砂混合物，这是最靠近植物的根部即，根际，记录鲜重。
每棵植物至少收集2个样品。
在液氮中冻结。

硫酸酯酶活性测定
在架子上解冻样品。
加入400 µl 0.5 M 醋酸盐缓冲液。
涡流各样品用于在至少5秒。
在通风橱下添加25 µl甲苯。
关闭试管并涡旋至少5 s。
将试管置于100 rpm的旋转架中6分钟。
在通风橱中加入100 µl对硝基苯基硫酸盐溶液。
涡旋每个样品10 s。
地方管用于添加人剧烈在5分钟摇动的1的Eppendorf摇床上，000转。
将装有试管的架子放在37°C的培养箱中1 h，每10分钟翻转一次将整个架子混合。
要在通风橱中终止反应，请添加100 µl的0.5 M CaCl 2 溶液和400 µl的0.5 M氢氧化钠溶液。
涡旋每个样品10 s。
在室温下以最大速度将离心管离心20分钟。
下通风柜仔细TRAN sfer 的上清液到塑料1.5毫升比色皿。
测量400 nm处的吸收。使用水作为空白。
通过将0、20、40、80、120、160和200 µl 10 mM对硝基苯酚标准品稀释到1 ml H 2 O中来制备标准品，并以相同的方式进行测量。
根据校准曲线（标准：0、200、400、800、1200、1600和2000 nmol ml -1 对硝基苯酚）计算样品的对硝基苯酚含量。
使用记录的FW数据和1 h的孵育时间，计算nmol g FW -1 h -1中的硫酸酯酶活性。

资料分析

该测定法确定的端浓度的所述硫酸产品，对硝基苯酚，使用一个校准曲线（图URE 1）和所述的活动可以被计算从所述权重的土壤和时间的的测定。所有的计算可以被很容易地执行在标准的办公软件，例如，Excel中（表1）。五次生物重复使用2次技术重复每一个应该被用来为每个工厂基因型。

图4. 用于测量硫酸酯酶活性的校准曲线。标准对硝基苯酚溶液通过用水稀释至含有0 - 2 ，每毫升和OD 000纳摩尔400 进行测定。

表1. 实施例的计算的硫酸酯酶活性

š 充足ID

土壤FW 1 （克）

OD400

对硝基苯酚（nmol）

硫酸酯酶活性
（nmol / g FW / h ）

一个verage

0-1

0 。1123

0 。183

915

8147 。8

Col-0-2

0 。1422

0 。203

1015

7137 。8

Col-0-3

0 。123

0 。261

1305

11641 。4

Col-0-4

0 。11

0 。161

805

6098 。5

Col-0-5

0 。111

0 。176

880

7926 。5

Col-0-6

0 。1121

0 。209

1045

9319 。5

8409 。938

0-1

0 。1012

0 。1174

587

5800 。4

WL-0-2

0 。1211

0 。0823

411 。5

3398 。0

WL-0-3

0 。1113

0 。0787

393 。5

3535 。5

WL-0-4

0 。1241

0 。0999

499 。5

4025 。0

WL-0-5

0 。1117

0 。1042

521

4664 。3

WL-0-6

0 。1003

0 。1092

546

5443 。7

4477 。805

1个的土壤FW 被调整从该FW 的土壤/砂样品和所述比率的土壤/砂混合物，这里10％的土壤。

笔记

所述测定法可容易地适应于不同的植物物种，各色NT大小š 的盆，或不同的土壤。

菜谱

改良的Long Ashton解决方案
1.5 mM的Ca（NO 3 ）2 · 4H 2 O

1毫米KNO 3

0.75毫米KH 2 PO 4

0.1 mM乙二胺四乙酸

0.75毫米MgCl 2 · 6H 2 O

pH值5.7

0.5 M醋酸盐缓冲液，pH 5.8（1 L）
64克三水合乙酸钠

1.7毫升冰醋酸

储存在4°C

0.005 M对硝基苯硫酸盐溶液（100毫升）
0.1287克对-硝基苯溶于百米升的0.5M的乙酸盐缓冲液中

储存在4°C

0.5 M氯化钙溶液（1 L）
将73.5 g CaCl 2 · 2H 2 O溶于1 L H 2 O

存放在RT

0.5 M氢氧化钠溶液（1 L）
将20 g NaOH溶于1 L H 2 O

存放在RT

标准对硝基苯酚溶液10 mM（100 ml）
139毫克对-硝基苯酚溶于在100毫升ħ 2 ö

储存在4°C

半强度MS培养基含蔗糖（1 L）
2.2克MS培养基

5克蔗糖

8克琼脂糖

pH值5 。7个，带1 M KOH

致谢

该硫酸法是改编自Margesin 等人，2014年SK ' 小号研究的资助由在德意志研究联合会（DFG）在德国的卓越战略，EXC- Nummer 1分之2048，项目390686111. AS 被资助的FP7-Peoople （293429 ）和在爱尔兰研究理事会新基金“S周期”。

利益竞争

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Bai，Y.，Muller，DB，Srinivas，G.，Garrido-Oter，R.，Potthoff，E.，Rott，M.，Dombrowski，N.，Munch，PC，Spaepen，S.，Remus-Emsermann，M 。，Huttel，B.，McHardy，AC，Vorholt，JA和Schulze-Lefert，P.（2015）。拟南芥叶和根微生物群的功能重叠。自然528（7582）：364-369。
Bulgarelli，D.，Rott，M.，Schlaeppi，K.，Ver Loren van Themaat，E.，Ahmadinejad，N.，Assenza，F.，Rauf，P.，Huettel，B.，Reinhardt，R.，Schmelzer， E.，Peplies，J.，Gloeckner，FO，Amann，R.，Eickhorst，T.和Schulze-Lefert，P.（2012）。揭示拟南芥根系细菌菌群的结构和组装提示。自然488 ：91-95。
Bulgarelli，D.，Schlaeppi，K.，Spaepen，S.，Ver Loren van Themaat，E.和Schulze-Lefert，P.（2013）。植物细菌菌群的结构和功能。Annu Rev Plant Biol 64：807-838。
Gahan，J。和Schmalenberger，A。（2014）。细菌和菌根在植物硫供应中的作用。前沿植物科学5：723。
Gunal，S.，Hardman，R.，Kopriva，S.和Mueller，JW（2019）。从红色到绿色的硫化途径。生物化学杂志294 ：12293-12312。
R.Jacoby，M.Peukert，A.Succurro，A.Koprivova和S.Kopriva（2017）。土壤微生物在植物矿物质营养中的作用-当前知识和未来方向。正面植物科学8：1617。
Kertesz，MA和Mirleau，P.（2004年）。土壤微生物在植物硫营养中的作用。J Exp Bot 55（404）：1939-1945。
Koprivova，A.，Schuck，S.，Jacoby，RP，Klinkhammer，I.，Welter，B.，Leson，L.，Martyn，A.，Nauen，J.，Grabenhorst，N.，Mandelkow，JF，Zuccaro， A.，Zeier，J. and Kopriva，S.（2019年）。根特异的camalexin生物合成控制多种细菌菌株对植物生长的促进作用。美国国家科学院院刊116（31）：15735-15744。
Margesin，R.，Minerbi，S.和Schinner，F.（2014）。长期监测意大利阿尔卑斯山南蒂罗尔两个森林地点的土壤微生物活动。微生物环境29 ：277-285。
田纳西州斯特林利斯，尤·K，费斯纳·K，德容格，R。范本图姆，范·沃克，MC，贝伦德森，RL，巴克，P。，费斯纳·I。和彼得·CMJ（2018 ）。依赖MYB72的香豆素分泌物可塑造根微生物组装配，从而促进植物健康。美国国家科学院院刊115：E5213-E5222。
Tejada，M.，Hernandez，MT和Garcia，C.（2006）。两种有机改良剂在土壤修复中的应用：对土壤生物学特性的影响。环境质量（J Environ Qual）35 ：1010-1017。
Zaborowska，M.，Kucharski，J.和Wyszkowska，J.（2018）。邻甲酚污染的土壤，并用Perna canaliculus贻贝粉生物刺激的土壤的生化和微生物活性。环境监测评估190：602。
Maharjan，M.，Sanaullah，M.，BS Razavi和Kuzyakov，Y.（2017年）。土地利用和管理方式对亚热带表层和亚土壤微生物生物量和酶活性的影响。应用土壤生态学113：22-28。