材料和试剂

样品制备
1. 手套
2. 长袖实验室外套
3. 样品瓶带有卡帽，尺寸4毫升（电子显微镜科学，目录号：64250）
4. Falcon 35毫米培养板（康宁，纽约州）
5. 黑腹果蝇飞行股票：Canton S（布卢明顿果蝇 Stock Center，目录号：FBst1000081）和 cpx SH1 （ cpx - / - ）（Huntwork和Littleton，2007）
6. 含有75μMAdasep-7（Biotium，目录号：70029）（见注1）的Ca 2 +
7. FM1-43（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：T35356），10μM
8. 在HEPES中的100mM NH 4 Cl（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
9. HEPES中的1.5 mg / ml DAB（Agilent Technologies，DAKO，OEM）
  注意：化合物可用于液体或药片中的片剂。
10. 使用4％OsO 4储备溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：19150）在90mM二甲胂酸盐缓冲液中制备的1％四氧化锇（OsO 4+）
11. 升序的丙酮系列50,70和90％由100％
  制备
12. 在水中制备的2％乙酸双氧铀（Electron Microscopy Sciences，目录号：22400）
13. 用分子筛脱水剂Fluka（Fluka Analysis，Sigma-Aldrich，目录号：270725）脱水的丙酮100％（Sigma-Aldrich，目录号：270725）
14. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
15. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
16. 氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
17. 氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
18. 碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S6014）
19. 海藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：T9531）
20. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S1888）
21. HEPES-Na盐（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
22. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
23. 多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
24. 戊二醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：16220）
25. 二甲胂酸钠缓冲液（Electron Microscopy Sciences，目录号：11653）
26. HL3果汁生理盐水（见食谱）
27. 预固定解决方案（请参阅配方和注2）
28. HEPES缓冲盐水（见食谱）
29. 固定解决方案（请参阅配方和注2）
样品嵌入
1. ACLAR ® 33C嵌入膜（Electron Microscopy Sciences，目录号：50425-10）
2. 三粒玉米烧杯：塑料，一次性（电子显微镜科学，目录号：60972）
3. 平底胶囊（电子显微镜科学，目录号：70021）
4. Epon（Embed-812）（Electron Microscopy Sciences，目录号：14900）
5. Nadic甲基酐（NMA）（电子显微镜科学，目录号：19000）
6. 十二碳烯琥珀酸酐特别蒸馏（DDSA）（电子显微镜科学，目录号：13710）
7. 2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（DMP-30）（Electron Microscopy Sciences，目录号：13600）
8. ERL-4221（电子显微镜科学，目录号：15004）
9. D.E.R. 736环氧树脂（用于简化与嵌入812结合的渗透）（电子显微镜科学，目录号：13000）
10. 壬烯基琥珀酸酐改性（NSA）（电子显微镜科学，目录号：19050）
11. 二甲基氨基乙烷（DMEA）（Electron Microscopy Sciences，目录号：13300）
12. 嵌入混合A（见配方）
13. 嵌入混合B（见配方）

设备

样品制备
1. Sylgard 184（世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州）
2. 精细镊子（世界精密仪器，型号：＃2和＃5）
3. 精细剪刀（世界精密仪器，型号：501233）
4. 昆虫微针（0.1毫米）（精细科学工具，目录号：26002-10）
5. 解剖立体变焦显微镜（Nikon Stereozoom Microscope，Nikon Corporation）
6. A.M.P.I. Master 8刺激器（A.M.P.I.，型号：Master-8）
7. 吸入电极填充HL3
8. 带荧光复合显微镜，带有针对FM1-43染料定制的长通辐射过滤器的过滤器立方体
9. 60x浸水物镜（ZEISS，Thornwood，NY）
10. 水银灯
11. Biowave（Ted Pella，Redding，CA）
12. 480±10带通滤波器
13. PELCO ® R1单速转子在35°位置（Ted Pella，型号：PELCO ® R1）
14. 通风柜
样品嵌入
1. 烤箱粘合剂（Tuttlingen，德国）
超薄部分准备和图像捕获
1. 超薄切片机（Leica，型号：Leica EM UC6）
2. Formvar /碳涂层2 x 1 mm槽铜格栅（电子显微镜科学，目录号：FCF-2010-Cu）
3. Ultra Diatome金刚石切片刀，湿（电子显微镜科学，目录号：27-US）
4. UltraTrim干燥室温度刀，4.0mm（电子显微镜科学，目录号：UTT-40-R）
5. 睫毛带柄（Ted Pella，目录号：119）
6. 双边不锈钢刀片（电子显微镜科学，哈特菲尔德，PA）
7. 镊子（电子显微镜科学，哈特菲尔德，PA）
8. JEOL 100 CX电子显微镜配备浜松数码相机和AMT软件

软件

ImageJ（National Institutes of Health）用于图像分析
用于图像分析的Adobe Photoshop（Adobe Systems）软件

程序

在HL3溶液中解除果蝇黑腹果蝇幼虫
1. 选择第三龄幼虫（L3），并将其置于Sylgard皿中。
2. 将L3置于前（头/口设备）和后部，背侧。
3. 将含有4-5毫升HL3溶液（食谱1）的夹心幼虫浸入Sylgard培养皿中。
4. 纵向剖开背侧，取出内脏（肠，脂肪体和气管）。
5. 拉伸并固定L3的其余部分。
6. 可以使用几个肌肉。在这项研究中，实验在肌肉6和7中的Ib boutons进行。（图1A）
  
  图1.三龄期幼虫解剖。A.肌肉纤维7,6,13,12和V形的高放大图像; B.L3中的腹侧肌肉的图像，其中神经（黑色箭头）被吸入连接到刺激器的吸引电极; C和D.调整加载FM1-43（WT幼虫加载30秒）的预先固定样品的照明时间。 C.DIC图像显示9分钟的照明时间产生成功的光转换。突触引物可以被识别为在肌肉表面几乎看不见的黑斑（白色箭头）。 D. 15分钟的照明时间是过量的，从强烈的DAB沉淀可以看出，在NMJ长度上观察到大的黑点（白色箭头）。比例尺= 10微米。
突触小泡与FM1-43染料的活性依赖性标记
注意：在低光条件下执行以下步骤以保护FM1-43染料的荧光团成分。用箔盖住FM1-43染料，或在室温下在黑暗中工作
1. 用含有10μMFM1-43的HL3替换HL3溶液。
2. 在没有刺激（自发回收池）的情况下装载，留下装载时间（在我们的研究中使用10,30,120和600秒）的准备。
3. 对于主动加载，使用头阶段控制器将神经拉入连接到刺激器的抽吸电极。吸收神经的末端使用刺激方案进行低频刺激，5分钟，5 Hz。一旦刺激完成，快速取出FM1-43染料（图1B）。（Verstreken等人，2008）采用的技术。
4. 在染料负载时，在含有75μMAdvasep-7的Ca 2+ / +无游离HL3盐水中快速洗涤3次，每次30秒。
固定术
1. 在室温下将制剂（配方2）前缀15分钟。
2. 在HEPES缓冲盐水中洗3次5分钟（食谱3）
3. 将制备物保留在100mM NH 4 Cl中10分钟以淬灭固定剂的自体荧光。
4. 用HEPES缓冲液洗涤NH 4 SCl 2溶液2次，5分钟
FM1-43光转换
1. 在含有1.5mg / ml DAB的HEPES缓冲液中预处理10分钟。
2. 将样品置于荧光显微镜下。在室温下，确定60倍水浸物镜下的感兴趣区域。
3. 使用具有最大光强度的480±10带通切除滤光片的汞灯照亮样品8-10分钟。染料会随时间漂白。通过周期性切换到明亮的视野来观察光电转换的过程。随着光转换的发生，深棕色DAB沉淀物定位在照射区域。需要调整照明时间，如图1C和1D所示
后固定
1. 在HEPES中洗涤样品三次5分钟。
2. 将制剂浸入固定剂溶液（配方4）中，并将样品在BioWave中以100W固定2分钟。将温度插入物靠近准备物，以监测温度波动。不允许温度超过25-26°C。
3. 从Sylgard菜中小心地取出准备。将准备物转移到带有卡帽的样品瓶中。
4. 将样品在90mM二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中洗涤两次，持续5分钟
EM样品处理
注意：以下步骤（除非另有说明）在室温下进行。
1. 四氧化锇后固定和乙酸铀酰染色
  1. 在室温下将制剂在1％OsO 4溶液中孵育1小时。未使用的溶液可以冷藏1个月以上。在通风橱下执行所有步骤，使用手套和长袖实验室外套。使用500μl该溶液浸泡样品。（注4）
  2. 用90mM二甲胂酸盐缓冲液洗涤5分钟
  3. 用去离子水洗涤5分钟
  4. 在2％乙酸铀酰中孵育制剂30-60分钟。未使用的溶液可以冷藏至多2个星期。
  5. 用去离子水洗涤5分钟两次。
2. 脱水
  1. 制备含有50％，70％，90％和100％丙酮的单独溶液。
  2. 向样品中加入1ml 50％丙酮10分钟
  3. 向样品中加入1ml 70％丙酮10分钟
  4. 向样品中加入1ml 90％丙酮10分钟
  5. 向样品中加入1ml 100％丙酮10分钟
3. 嵌入
  1. 将2体积的嵌入树脂（注3）与一体积的100％丙酮混合。在连续旋转下加入制剂1 h或过夜。
  2. 将样品保持在树脂中至少18小时（过夜）。
  3. 在立体显微镜下，将准备放在ACLAR电影上，然后识别和修剪感兴趣的区域。
  4. 将准备放在新的ACLAR胶片上，肌肉朝下，角质层朝上。将填充有聚合树脂的嵌入胶囊倒置在样品的顶部。在60℃下聚合24-36小时。
  5. 删除ACLAR电影。这将使样品附着在嵌入胶囊上。
4. 薄切片和EM成像

数据分析

使用光转换程序，我们调查了缺乏突触前蛋白复合物的果蝇幼虫中的回收囊泡池（ cpx / sup>）（Huntwork和图3A），其能够提高自发释放速率。相比之下，在自发加载期间在WT boutons中观察到的回收池可以忽略不计（数据未显示，参见[Sabeva等人，2017]）。在神经刺激期间装载的 cpx 中，与WT制剂相比，回收池也增加（图3A和3B）表明单独的回收池用于自发和诱发释放模式（Sabeva等人，2017）。

图3.显示回收囊泡池的代表性照片。 A. 在缺席的情况下加载boutons刺激10,30或120秒。在5Hz的神经刺激期间加载5分钟的WT和 cpx 。光转化的标记囊泡（黑色），未标记的囊泡（灰色）。比例尺= 500nm。
详细的数据处理分析和复制，包括应用的统计测试可以在原始手稿中找到，见Sabeva等人，2017年。

笔记

Advasep-7是β-环糊精衍生物。它可以作为染料清除剂，减少背景荧光
16％多聚甲醛溶液和25％戊二醛溶液可购买于10ml安瓿。
嵌入树脂：通过混合等体积的嵌入混合物A（配方5）和嵌入混合物B（配方6），在新的一次性250ml烧杯中制备。使用木制舌头按摩器彻底混合。在真空干燥器中脱气（消除气泡）5分钟，或在室温下放置30分钟。在室温下密封保存，并在同一天使用，或等分并储存于-20°C
EM样品处理过程中的所有步骤均在振动筛或样品旋转器中进行

食谱

HL3 生理盐水溶液
预固溶液
HEPES缓冲盐水
固定解决方案
嵌入混合A
混合准备：
20 g EMBed-812
11 g DDSA
9克NMA
0.8 ml DMP-30
在250毫升Tri-Corn一次性烧杯中使用木制舌头按压器彻底混合
嵌入混合B
混合准备：
10克ERL
6克DER
26克NSA
0.4毫升DMAE
在250毫升Tri-Corn一次性烧杯中使用木制舌头按压器彻底混合

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院授予的R01 MH099557和NIH NINDS SNRP Grant 5U54NS083924的支持。

参考

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