材料和试剂

盖玻片放置5-10个盖玻片（例如，Wash-N-Dry，Diversified Biotech，目录号：WSDR-1000）
手套
小塑料培养皿或50ml Falcon管（直径约30 mm）的帽子
15 x 20厘米黑色塑料板
高精度盖玻片（例如，Marienfeld Precision Cover Glass，22 x 22 mm，Marienfeld-Superior，目录号：0107052）
X光胶片（例如，Amersham HyperfilmTM ECL，GE Healthcare，目录号：28906835）
双面胶带（例如，，Tesa Doubleband Photostrip，Tesa，目录号：05338-00）
粗棉布
产生适合基因型女性的飞线或十字架（见注1）
干燥的粒状面包酵母（例如，Lesaffre Saf-Instant ^{＆lt; / sup＆gt;）}
卤代烃油（例如，，Voltalef 10S，VWR，目录号：24627.188）
100％乙醇（例如，EMD Millipore，目录号：100983）
在庚烷中的约5％二氯二甲基硅烷（DCDMS）（例如，硅烷化溶液，Sigma-Aldrich，目录号：85126）
PIPES（例如，，Sigma-Aldrich，目录号：P3768）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（例如，EMD Millipore，目录号：105833）
EGTA（例如，Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
HEPES（例如，，Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钾（KCl）（例如，EMD Millipore，目录号：104936）
硫酸葡聚糖，MW〜10kDa（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D4911）
来自Pro-BIO的Agar（例如，）
来自Volk Klaus的干酵母（例如，）
来自Ruckemann的大豆粉末（例如）
Sirup（例如，，来自Ruckemann）
来自Baeko Rhei的麦芽提取物（例如，）
来自Ruckemann的玉米粉（例如，）
丙酸（例如，VWR，目录号：ACRO447231000）
制造：Acros Organics，目录号：447231000。
尼泊金（例如，，Sigma-Aldrich，目录号：H5501）
BRB80（见配方）
1％注射缓冲液（1％IB）（见配方）
玉米粉琼脂（见食谱）

设备

标准的饲养设备（例如，具有玉米面琼脂的小瓶 - 食谱，带有湿度控制器的25℃培养箱，刷子，CO 2站，等等。 em>）
3-9孔解剖板（例如，，康宁，目录号：7220-85）
真空干燥器（例如，SP Scienceware - Bel-Art Products-H-B Instrument，目录号：F42025-0000）
Dumont＃5镊子（例如，，Fine Science Tools，目录号：11252-20）
Dumont＃55钳子（例如，，Fine Science Tools，目录号：11255-20）
用于显微镜的定制盖玻片支架（图1）

图1.装有盖玻片支架和硅烷储存器的真空干燥器。更换设备盖后，打开真空阀和水龙头进行真空。一旦形成真空，即，您可以通过盖子提起整个设备 - 关闭真空阀和水龙头。
具有5-40x（或更高）放大倍率的放大立体显微镜（例如，Carl Zeiss，型号：STEMI SV 11）
具有手柄的锋利钨针（例如，，Fine Science Tools，目录号：10130-20和26018-17）
具有高NA物镜和高灵敏度检测器的全内反射荧光（TIRF）显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica AF7000）
注意：我们使用带有100x 1.46 NA油浸物镜和Photometrics Evolve Roper 512 EMCCD相机的Leica 7000宽幅TIRF显微镜。

软件

显微镜控制器软件（例如，，Leica LASAF）
ImageJ / FIJI
用于ImageJ的定制粒子检测器和跟踪器插件（可从 https://github.com/Xaft/xs/blob/master/_xs.jar ）

R（优先使用RStudio），用于数据分析

程序

飞养
1. 建立产生在所需突变体遗传背景中表达适当荧光标记的雌性苍蝇的交叉（见注1）。根据最终基因型的复杂性，这可能需要多个连续的交叉
2. 在实验前一天，收集少数（最多六只）年轻（最多一周龄）的雌性蝇，并将它们与2-3个男性一起放在一个小瓶中，新鲜的玉米面琼脂和20-30粒干燥的面包酵母（见注2）
盖玻片的硅化（见注3）
1. 在实验当天，将5-10个工厂清洁的盖玻片装入盖玻片夹（见附注4）。
  注意：戴手套。
2. 将200μl硅烷化溶液（5％DCDMS）放入培养皿/ Falcon管帽（硅烷储存器）中。
3. 将盖玻片放在真空干燥器中的硅烷储存器旁边并施加真空（图1）
4. 在室温（RT）下在真空下孵育盖玻片90-120分钟。蒸发的DCDMS将覆盖盖玻片的表面。不应该观察到玻璃的颜色或透明度的变化
5. 硅藻盖玻片应在同一天使用，不应该储存。
准备TIRF显微镜
1. 在解剖之前，启动显微镜，加载软件并设置成像参数。
2. 如果控制温度至关重要，请在开始成像前至少半小时启动显微镜周围的孵育室。
3. 确保系统已校准。质量的折射率接近于卤烃油的折射率（η〜1.41），因此可以作为参考使用含有一滴卤代烃油的盖玻片。
解剖卵巢（见视频1）

Video 1. Dissection of the ovaries
1. 用100％乙醇和另外两个具有BRB80的孔装载一个孔（约2ml）的解剖板（参见食谱）。使用黑色塑料板作为飞行和卵巢操作的工作场所。
2. 麻醉一只雌性蝇，并用乙醇将其放入井中（见注5）
3. 孵化4-5秒后，使用＃55镊子，用BRB80将蝇转运到一个井中，另外4-5秒转移到含有BRB80的最后一个井。
4. 在解剖显微镜的中等放大倍率（10-15倍）下，用非支配手的＃5镊子，粉碎飞行的胸部以摧毁它，杀死动物并保持牢固的握力。用＃55钳子，轻轻地刺穿腹部的腹侧后侧靠近中线。
5. 通过拉拔去除后部部分来打开腹部。取出一对卵巢，并在一滴BRB80中将其转移到干净，非硅烷化的盖玻片上。
6. 将两滴1％IB（见食谱）（约4-5μl）放在同一盖玻片上。将卵巢顺序转移到每个滴液中以从其周围移除BRB80。
7. 将卵巢转移到硅藻土盖玻片中心的〜2微升1％IB中。
  注意：需要从此步骤使用硅化盖玻片。
卵的提取（见视频2和3）
1. 将一滴卤代烃油放在硅胶盖玻片上，使其与含有卵巢的液滴形成界面（见视频2）。
  
  Video 2. Separation and sorting of the ovarioles
2. 用100％乙醇擦拭钨针，然后在1％IB中冲洗。
3. 将放大倍数提高到约20-25倍。使用两根针，将卵子（鸡蛋串）彼此分开。
4. 鉴定包含感兴趣发育阶段（第9阶段或更早的图2A）的卵室的卵巢。用针
  小心地取出较旧的舞台注意：穿过它们，使用它们作为剪刀。
  
  果蝇发育。卵母细胞及其15个同胞细胞（护士细胞）通过一系列不完全的细胞分裂在胚胎中形成合胞体。这16个细胞通过细胞质桥连接并被形成蛋室的体细胞卵泡细胞层包围。卵巢成熟/经过14个不同阶段的卵子发生，以产生一个成熟的卵子（更多细节请参考，[Bastock和St Johnston，2008]）。为了可视化不同的细胞类型，使用三种不同的FIT探针（Hovelmann等人）的混合物进行与oskar mRNA的原位杂交的无洗涤 em>，2013）。刻度棒为50μm。 B-D。从9期卵母细胞提取的不同步骤（静止图像来自视频3）。刻度棒为500μm（B-D）
  
  Video 3. Ex vivo ooplasmic preparation
5. 使用你的优势手，抓住镶嵌在金刚石边上的修剪后的圆顶，轻轻地将其拉到油底下。
6. 重复步骤E4和E5。理想情况下，在进一步进一步处理之前，应该有5-10个石油兴趣小屋。
7. 缩放到大约40倍的放大倍数。在油下，首先清除比感兴趣的阶段更小的蛋室（例如，第9阶段），然后开始在护士细胞（卵母细胞的营养性姐妹细胞）的前端刺穿蛋室（图2B，见视频3）。
8. 当没有一个或只有几个护士细胞残留时，轻轻地用针在你的优势手中的后极上抓取含卵母细胞的卵泡袋（“卵母细胞袋”），并开始将其从护士细胞的瓦砾中拉出（图2C）。
9. 卵子应该开始流出。调整拉力的速度，使质地接触盖玻片并粘附。您可以通过在卵巢前方产生张力来帮助其他针头粘连（见注3）。
10. 根据拉动速度，卵形体的大小和盖玻片的疏水性，应形成（图2D），一至数个圆形的卵浆液滴（含有大量1-10μm大的蛋黄泡泡囊泡囊，可见于40x变焦）。 br />
11. 故障排除：太亲水的玻璃会导致几乎瞬间的，无法控制地将表面释放出来，而太疏水的玻璃通常会排斥“卵母细胞袋”，使其从表面浮起。在任一情况下，建议从步骤B1重新启动协议，分别减少或增加硅烷化时间。
12. 重复步骤E7-E9将更多的卵磷脂提取物沉积在同一个玻璃上。理想情况下，这样的准备工作中有四十六份（即复制）可放在一张22 x 22毫米的盖玻片上。
TIRF显微镜
1. 使用盖玻片支架将盖玻片加载到显微镜的支架上（图3）
  
  图3.定制的盖玻片支架。此盖玻片支架的基础是塑料块，尺寸为标准显微镜（76 x 25 x 2-3 mm），包含16-18 mm宽，其长边16-18毫米深切口。通过使用两条双面胶带将（使用）X射线胶片（约40×25mm，具有相似切口）的手工切割片固定到塑料块的底部。应该将两条胶带放置成使得所使用的盖玻片（例如，22×22mm）应该牢固地配合 - 在这个例子中，这两个条分开放置22毫米。带有卤素油的硅烷化盖玻片可以像抽屉一样在塑料块和X射线胶片之间滑动。刻度单位为cm。
2. 使用透射光，聚焦样品并定位其中一个液体液滴。通过卵巢颗粒（图4A和4B）的存在可以认识到卵磷脂，其在护士细胞质中不存在（图4C）（见附注6）。有时，通过形成卵黄层增强的卵母细胞膜保持完整，因此不会与玻璃表面接触。这种畸形的卵母细胞可以被其周围的锐利，正弯曲的边界识别（图4B）。 TIRF显微镜无法获得这种肿瘤（图4D）
  
  图4. 离开离子制备之后的液滴的典型外观。A，B，D和E。卵泡南瓜。 A和B.卵母细胞在中期生育阶段的卵质可以通过存在大（1-10μm）的卵黄颗粒来识别。 A和E.有时，卤代烃油滴混入卵质，表明卵母细胞周围的血浆和卵黄膜被去除。 C.护士细胞浆液滴。颗粒度比卵母细胞A和B更精细，并且通常巨大的护士细胞核保持完整。 B和D.具有完整膜的卵母细胞/卵母细胞（由红色箭头指示）。 D.在这种制剂中，卵磷脂不能与玻璃表面紧密接触，因此不能通过TIRF显微镜检测到内质网络合物和细胞器。 E.在适当的卵泡提取物中，通过TIRF显微镜（绿色 - oskarMS2（10x） - MCP-EGFP mRNPs）可以检测到在卵质内含有的复合物和细胞器。在同一天使用相同的显微镜设置拍摄D和E中的图像。
3. 可选：如果显微镜配备了2D / 3D电动舞台，建议在切换到TIRF显微镜之前将所有液滴定位和存储位置。
4. 启动TIRF成像并调整参数，如曝光时间，激光强度和摄像机增益，以获得良好的质量信号（图4E）。
5. 时间分辨率是研究运动物体动力学的关键参数。对于oskar mRNP的运动性分析，我们暴露了oskMS2 -GFP粒子20毫秒，同时成像EB1-mCherry（5毫秒），以获得关于底层的极性的信息微管（MT）网络。这导致每秒约10-12帧（FPS）采集，其间运送的oskar mRNP行进〜50-150nm（像素大小为140nm）。

数据分析

注意：可以在实验者选择的任何软件/管道中分析获得的图像。在这里，我们使用我们定制的粒子识别和跟踪算法描述了ImageJ / FIJI中的oskar mRNP的运动和共定位/共同迁移分析。 https://github.com/Xaft/xs/blob/master/xs%20plug-ins.pdf

运动分析（见视频4和5）

、
Video 4. Tutorial for the xsPT particle tracker plug-in of ImageJ, part one

Note: Please watch the video in full screen for better clarity.

Video 5. Tutorial for the xsPT particle tracker plug-in of ImageJ, part two

注意：请观看全屏视频以获得更好的清晰度。
1. 将获取的图像序列加载到ImageJ中。
2. 对所有通道应用高斯滤波器（0.8像素），以减少噪声
3. 选择包含要分析的粒子信息的通道（参考通道）。
4. 启动插件xsPT。
5. 通过使用弹出窗口，输入粒子检测和跟踪的参数。
  注意：请参阅插件附带的详细说明。
6. 在“GO”之后，参考通道的所有帧都被处理，如果选择了创建初始轨迹（见注7）。
7. 通过点击检测后显示的曲目，选择感兴趣的曲目。
  注意：在我们的示例中，这些轨迹看起来很长和线性。
8. 选择轨道后，按“选择模式”按钮。这将切换到“注释模式”。
9. 将通道更改为EB1-mCherry信号。通过播放电影（例如，“播放”按钮，鼠标滚动或拖动滚动条），尝试识别发生给定粒子运行的MT。
  注意：在我们的例子中，我们设法确定了85-90％的底层MT及其极性。
10. 点击轨道，使用数字键盘上的0-9个字符，添加一个注释来表示运行的极性（ eg ，加号指针'1'，负端的'2'定向运行）。
11. 完成后，按“保存所选”按钮保存所选和已注释的曲目。这将保存.csv文件，该文件包含轨道（号）的标识符，帧号，校准的x和y坐标，注释（步骤A9）和信息（例如，区域，集成密度，背景）关于构成轨道的识别点的顺序。
12. 如（Gaspar等人，2014年）所述提取运动信息（例如，速度，持续时间，位移，暂停和反转频率）。
共同迁移分析（见视频4和5）
第二通道（靶通道）包含感兴趣的蛋白质（例如，驱动蛋白重链或原肌球蛋白1-I / C）的信号强度，而不是MT极性信息。
1. 执行A部分的A1-A7步骤
2. 选择感兴趣的曲目后，保存所选的曲目。
  注意：这将保存所有通道中检测到的斑点的集成密度。
3. 为了检测在给定时刻跟踪的粒子上是否存在感兴趣的蛋白质，将相应信道的平均信号强度（积分密度/面积）（通常以“integral_2”存储）与阈值进行比较。
4. 要确定适当的阈值，首先选择目标通道，即重新运行xsPT插件，使其成为参考。
5. 按“全部保存”保存所有点的数据。
6. 作为阈值，我们使用在荧光标记的兴趣蛋白质杂合的卵母细胞提取物中确定的平均信号强度分布的下10个百分位数。
7. 按照（Gaspar等人，2017）所述分析数据。
基于对象的协同定位分析（见视频6）

Video 6. Tutorial for the xsColoc colocalization analysis plug-in of ImageJ

注意：请观看全屏视频以获得更好的清晰度。

对于没有动态信息可用的情况，或者如果两个信道的信号预计不会完全重叠 - 例如，则两个通道中的对象很大，我们开发了一个修改版本的粒子跟踪器确定单个快照帧中对象（与原始信号相反）的共定位。该插件通过使用图像的粒子信息运行一系列蒙特卡罗模拟来估计随机（预期）共定位的可能性。
1. 将获取的图像的一帧加载到ImageJ中。
2. 运行xsColoc插件。
3. 通过从弹出窗口的下拉菜单中选择通道，调整每个通道的粒子检测参数（详细说明与插件捆绑在一起）。
4. 点击“GO”后，选择两个相邻对象的参考和目标通道和允许的最大距离（以nm为单位）（见注8）。
5. 可选：如果图像的部分不包含关于样本（通常为空白区域）的任何信息，建议将分析限于感兴趣区域（由ImageJ的标准ROI工具绘制）。这将确保模拟（预期）共定位的准确性。
6. 按“测试colocalization”按钮运行分析。
7. 将打开“保存”对话框。这里保存三个文件：（i）实际图像（.tif），（ii）包含粒子检测参数和ROI（.mcc）坐标的描述符文件，（iii）文件（.csv ）包含参考通道中所有对象的特征，来自目标通道的共定位对象（如果有的话，否则为-1）的特征，以及100个距离条目（以nm为单位，用于100个蒙特卡罗模拟运行）在参考对象和目标通道的模拟粒子之间。
8. 按照（Gaspar等人，2017）所述分析数据。

笔记

为了标记oskar mRNPs，我们使用转基因oskMS2（10x）与单体MCP-EGFP（Zimyanin等人，2008）组合。对于极性标记MT，我们使用 oskar -Gal4驱动程序（Telley等人，2004年）在女性种系中表达了UASp-EB1-mCherry（Damian Brunner的礼物）。对于共同迁移分析，我们分别用mKate2和mCherry分别标记了驱动蛋白重链和原肌球蛋白1-I / C（Gaspar等人，2017）。
蛋白质不足的饮食和其他压力来源（过度拥挤，缺乏配偶）显示出负面影响oskar的mRNP运动性，并导致将海马mRNA快速重新分配到海绵/加工中身体（Snee和Macdonald，2009; Shimada等人，2011）。
适当的疏水性是成功的卵磷脂提取的关键。太亲水的玻璃导致蛋白质（包括oskar mRNPs的组分）与表面的非特异性结合，使得颗粒不稳定，而疏水的表面防止了卵石的粘附。
根据我们的经验，用1N HCl，2NH 2 SO 4或1N NaOH洗涤导致玻璃上闪烁的红色荧光斑点的出现，这些斑点通常是不可区分的或比标记的蛋白质分子的红色荧光强。因此，我们建议在硅烷化之前用酸性或碱性洗涤剂清洁盖玻片。
100％乙醇快速溶解覆盖飞角角质层的疏水性蜡层，从而允许苍蝇沉入井底。此外，它终于麻醉了苍蝇。
从单个蛋室衍生的液滴通常由可以追踪在卤代烃下面的薄的液体串连接，有助于在TIRF显微镜上使用1,000倍放大率，有时繁琐地搜索液滴。
xsPT插件允许在自动和手动跟踪之间进行在线切换。此外，从自动跟踪中选择的轨迹将转移到手动跟踪模式，允许手动修复跟踪错误。
如果有第三个通道可用，则可以将其用作掩模通道，即仅将参考和目标通道中的那些物体在一定距离内（“nm距离”）考虑到掩模通道的对象。

食谱

BRB80
80 mM PIPES，pH 6.9
2mM MgCl 2
1 mM EGTA
1％注射缓冲液（1％IB）
10 mM HEPES，pH 7.7
120 mM KCl
1mM MgCl 2
1％（w / v）硫酸葡聚糖（MW〜10kDa）
玉米棒琼脂
10 L H 2 O O
来自Pro-BIO的120g琼脂（例如，）
来自Volk Klaus的180g干酵母（例如，）
来自Ruckemann的100g大豆粉（例如）
220克sirup（例如，，来自Ruckemann）
来自Baeko Rhei的800g麦芽提取物（例如，）
来自Ruckemann的800克玉米粉（例如，）
62.5ml丙酸（例如，VWR）
24g nipagin（例如，Sigma-Aldrich）

将一半水中的一半水煮沸琼脂（90℃），直到琼脂完全溶解。将除了丙酸和nipagin之外的所有物质溶解在其余的水中，并加入水壶中的琼脂 - 水混合物中
煮2小时，每10分钟搅拌一次
减少热量（80°C）
添加nipagin和丙酸
倒入瓶子，瓶子，并立即用干酪包布覆盖
让瓶子干几个小时;瓶子应该在堵塞之前干燥一整夜
在18°C或4°C下存放飞行食物

致谢

这项工作由EMBL资助。该协议是从2017年的Gaspar等人改编的。

参考

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Gaspar，I. Sysoev，V.，Komissarov，A.和Ephrussi，A.（2017）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 28028052“target =”_ blank“>一种RNA结合非典型原肌球蛋白可以动态地将kinesin-1招募到oskar mRNPs。 EMBO J 36（3）：319-333。

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Shimada，Y.，Burn，KM，Niwa，R。和Cooley，L。（2011）。早期卵子发生的蛋白质定位和微管组织对营养胁迫的可逆反应 355（2）：250-262。

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