土壤线虫群落DNA提取、扩增及高通量测序
DNA Extraction, Amplification and High-throughput Sequencing of Soil Nematode Community   

材料与试剂

1. 一次性口罩、无菌手套
2. 面巾纸
3. 0.5 ml和2 ml的离心管
4. 无水乙醇
5. DNeasy Blood & Tissue 线虫DNA提取试剂盒
6. NF1/18Sr2b引物
   

仪器设备

1. 线虫提取富集相关材料 (18目、60目、500目不锈钢网筛 (浙江上虞银河测试仪器厂)、表面皿、天平、烧杯、2 L的量杯等)
2. 10 μl, 20-200 μl, 1000 μl的移液器 (Eppendorf)
3. 4/-80 °C冰箱 (海尔)
4. 真空泵 (郑州长城科工贸有限公司SHB-lll)
5. 高压灭菌锅 (上海申安医疗器械厂DSX-18L-l)
6. 恒温水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司DK-S24)
7. 无菌工作台
8. 离心机 (Eppendorf Centrifuge 5425)
9. PCR仪 (ABI GeneAmp® 9700型)
   

实验步骤

一、土壤线虫的提取富集

线虫的提取富集使用浅盘法结合贝尔曼漏斗的方法进行 (图1)。

1. 取100 g鲜土倒入量杯中，每次1 L水淘洗，悬停1 min，倒入上层60目下层500目的一组网筛，重复三次。
2. 将淘洗后500目网筛上得到的泥浆转移至有面巾纸的18目网筛中 (网筛置于浅盘)，静置24 h。
3. 静置后取走网筛，将浅盘中的水全部转移至250 ml的烧杯中。将烧杯中的线虫悬液经玻璃棒引流转移至铺有面巾纸的漏斗中 (直径10-15 cm)，静置6 h以上。
4. 打开漏斗胶管下部的弹簧夹收集线虫悬液，静置2 h后用真空泵抽取上清液，留约5-10 ml的线虫悬液在显微镜下活体计数。线虫悬液可置于4 °C冰箱保存一周 (或室温保存1-2 d)。
   

二、土壤线虫DNA提取

1. 在提取线虫DNA之前，将每个样品的线虫悬液以1902 × g离心10 min (或线虫悬液静置2 h以上)。弃去上清液后，保留约2 ml线虫悬液并转移到2 ml离心管中。然后将2 ml离心管以6010 × g离心2 min，弃去上清液后，最终保留0.5 ml线虫悬液使用DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒 (Qiagen) 进行线虫DNA提取。
2. 根据DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒的说明书，我们对实验方法进行了微调，为了得到更多的线虫DNA，我们使用双倍的裂解缓冲液 (360 μl Buffer ATL, 40 μl蛋白酶K) 来充分浓缩和裂解线虫，消化时间延长至1.5 h。具体的操作步骤如下：
   1)

   在保留0.5 ml线虫悬液的离心管中加入360 μl Buffer ATL，40 μl蛋白酶K，涡旋15 s后水浴消化1.5 h，水浴消化期间间断振荡 (每隔15 min上下颠倒几次)。
   2)

   涡旋15 s，加入400 μl Buffer AL，涡旋混匀后加入400 μl (96-100%) 的酒精，涡旋混匀。
   3)

   用移液器将2 ml离心管中的所有液体转移至带有滤柱的2 ml收集管中 (分几次转移视情况而定)，6010 × g离心1 min，弃去离心液及收集管。
   4)

   将滤柱转移到一个新的收集管中，加入500 μl Buffer AW1，6010 × g离心1 min，弃去滤出液和收集管。
   5)

   将滤柱转移到一个新的收集管中，加入500 μl BufferAW2，18,407 × g离心3 min干燥滤柱，弃去滤出液和收集管。
   6)

   将滤柱置于一个1.5 ml的离心管中，加入100 μl (一般为50-200 μl) Buffer AE，室温孵化1 min后6010 × g离心1min最终得到线虫DNA。
   7)

   提取的线虫DNA储存在-80 °C冰箱用于后续的PCR扩增和测序。
   
   
   图1. 土壤线虫DNA提取流程示意图
   
   

三、线虫群落的扩增测序

1. 使用引物NF1-F/18Sr2b-R (Porazinska et al., 2009) 对线虫18S rDNA V4区进行扩增。PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μl反应体系：5x FastPfu Buffer 4 μl，2.5 mM dNTPs 2 μl，Forward Primer (5μM) 0.8 μl，Reverse Primer (5μM) 0.8 μl，FastPfu Polymerase 0.4 μl，BSA 0.2 μl，Template DNA 10 ng，最后使用灭菌PCR水补足至20 μl。
2. 线虫 (NF1-F/18Sr2b-R) PCR反应参数为：95 °C预变性3 min，95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸45 s，35次循环后最终在72 °C延伸10 min。扩增之后，PCR产物使用2 %琼脂糖凝胶电泳进行可视化 (图2)，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒 (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 进行纯化，并使用QuantiFluor™-ST (Promega, USA) 对回收产物进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台 (Illumina, San Diego, USA) 标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 300文库。PCR文库构建是在引物上合成barcode，采用混合样品建库的模式。具体构建文库的步骤为：(1) 连接"Y"字形接头；(2) 使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3) 利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4) 氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行双端测序。原始数据已上传至NCBI数据库 (序列号：PRJNA580055)。
   
   
   图2. 利用NF1和18Sr2b引物对进行PCR扩增的电泳图谱及PCR产物浓度 (相关结果来自课题组先前发表的文章(Du et al., 2020) )
   
   

结果与分析

一、生物信息分析

1. 数据优化
   使用Trimmomatic软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH (http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7) 软件进行拼接：
   1)

   过滤reads尾部质量值20以下的碱基及质控后200 bp以下的reads，去除含N碱基的reads。
   2)

   根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10 bp。
   3)

   拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，去除无法拼接的序列。
   4)

   根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配。
2. OTU聚类
   使用UPARSE软件 (http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根据 97%的相似度对序列进行OTU聚类，具体流程如下：
   1)

   提取优化序列中的非重复序列，去除没有重复的单序列。
   2)

   按照97%相似性对非重复序列 (不含单序列) 进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列。
   3)

   将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。
3. 分类学分析
   通过Blast搜索，比对NCBI NT数据库对物种进行分类注释。
   

二、线虫DNA提取效率和测序深度比较

利用浅盘法结合贝尔曼漏斗法提取富集线虫后，利用DNeasy Blood & Tissue试剂盒提取线虫DNA，注释的线虫序列占总序列的68.40%，平均每个样本的测序深度达到28978/样本。相比前人的研究结果 (Sapkota et al., 2015; Peham et al., 2017; Griffiths et al., 2018; Treonis et al., 2018) (表1)，经过对线虫的物理分离、富集以及试剂盒提取方法的改进，提高了线虫DNA的提取效率和测序深度，为利用高通量测序技术开展土壤线虫群落研究提供了技术参考。

         表1. 基于高通量测序不同提取方法线虫测序深度比较
         

注意事项

1. 针对不同的土壤选择合适的土壤线虫提取方法是提取线虫DNA的关键步骤，在保证线虫富集效率的同时还要保证线虫悬液样本的清晰，土壤线虫提取方法的选择可参考张晓珂等 (2013)。
2. 线虫引物和试剂盒在未来可能会进一步优化，需关注最新的研究进展选择合适的引物和试剂盒进行研究。
3. 线虫高通量测序数据的处理可根据需求灵活分析，也可使用Usearch软件对原始测序序列进行质控，聚类，生成OTU表。
4. 用于线虫分析的数据库对于分子技术在线虫领域的应用十分重要，今后需进一步补充和完善现有的线虫数据库。
   

致谢

本研究成果主要来源于课题组先前发表的相关文章 (Du et al., 2020)。相关研究得到了国家科技基础资源调查专项项目 (2018FY100304)、中国科学院国际合作局对外合作重点项目 (151221KYSB20200014) 和国家自然科学基金项目 (41877047) 的资助。

参考文献

1. 张晓珂，梁文举，李琪. (2013). 长白山森林土壤线虫. 中国农业出版社. 北京. ISBN: 9787109177840.
2. Du, X. F., Li, Y. B., Han, X., Ahmad, W. and Li, Q. (2020). Using high-throughput sequencing quantitatively to investigate soil nematode community composition in a steppe-forest ecotone. Appl Soil Ecol 152: 103562.
3. Griffiths, B. S., de Groot, G. A., Laros, I., Stone, D. and Geisen, S. (2018). The need for standardisation: exemplified by a description of the diversity, community structure and ecological indices of soil nematodes. Ecol Indic 87: 43-46.
4. Peham, T., Steiner, F. M., Schlick-Steiner, B. C., and Arthofer, W. (2017). Are we ready to detect nematode diversity by next generation sequencing? Ecol Evol 7: 4147-4151.
5. Porazinska, D. L., Giblin-Davis, R. M., Faller, L., Farmerie, W., Kanzaki, N., Morris, K., Powers, T. O., Tucker, A. E., Sung, W. and Thomas, W. K. (2009). Evaluating high-throughput sequencing as a method for metagenomic analysis of nematode diversity. Mol Ecol Resour 9: 1439-1450.
6. Sapkota, R. and Nicolaisen, M. (2015). High-throughput sequencing of nematode communities from total soil DNA extractions. Bmc Ecol 15: 3.
7. Treonis, A. M., Unangst, S. K., Kepler, R. M., Buyer, J. S., Cavigelli, M. A., Mirsky, S. B. and Maul, J. E. (2018). Characterization of soil nematode communities in three cropping systems through morphological and DNA metabarcoding approaches. Sci Rep-Uk. 8: 2004.