水禽肠道食糜微生物脂多糖含量的检测
Analysis of Lipopolysaccharide Content in Chyme Microbiota of Waterfowl Cecum   

材料与试剂

1.  吸水纸
2.  NaCl
3.  KCl
4.  Na₂HPO₄·12H₂O
5.  KH₂PO₄
6.  各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
7. 脂多糖酶联免疫吸附试剂盒 (南京建成，H255)
8. PBS (见溶液配方)
   

仪器设备

1.  离心机
2.  移液器
3.  恒温培养箱
4.  涡旋仪
5. 分析天平
6.  -80 °C冰箱
7.  酶标仪
   

软件

1.  ELISA Calc回归拟合计算程序- v 0.1

试验原理

本实验利用酶联免疫吸附法测定水禽食糜中LPS含量，将LPS抗原吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，最终通过荧光显色反应，利用呈色的深浅进行定量分析。

实验步骤

1.  样品采集
   分离动物肠段，采集动物肠道，用冻存管小心收集盲肠食糜，置于液氮中保存，转移到实验室后，放入-80 °C冰箱保存。所有使用的器具耗材均去除热原。分离动物肠段，采集动物肠道，用冻存管小心收集盲肠食糜，置于液氮中保存，转移到实验室后，放入-80 °C冰箱保存。所有使用的器具耗材均去除热原。
   
   
    图1. 禽类肠段解剖图例
   
   
2.  检测步骤
   
   2.1

   使用差量法在分析天平称取盲肠食糜。
   2.2

   按照1 g︰19 ml的比例，在食糜样品中加入PBS溶液。
   2.3

   在涡旋仪上振荡5 min混匀。
   2.4

   将离心管置入离心机中，25 ℃，900 × g离心10 min。
   2.5

   小心吸取上清液，置于离心管中备用。
   2.6

   将脂多糖酶联免疫吸附试剂盒放置于室温平衡30 min。
   2.7

   在5支无菌离心管中加入样品稀释液，并标号A、B、C、D和E，各加入150 μl样品稀释液。向A管中加入150 μl标准品，涡旋振荡30 s混匀后，从A管中吸取150 μl稀释液加入B管，以此类推。配制洗涤液备用。
   2.8

   取出酶标板，加入50 μl的标准品/样品，加入抗体一50 μl，HRP亲和素50 μl，轻轻振荡混合均匀，覆膜，放入37 °C恒温培养箱，避光孵育60 min。
   2.9

   弃去酶标板中液体，每孔加入300 μl洗涤液，轻轻摇晃振荡30 s，弃去洗液，在吸水纸上拍干，重复5次。
   2.10

   加入TMB显色液，轻轻摇晃振荡混匀，在37 °C恒温培养箱中避光孵育10 min。
   2.11

   轻轻摇晃酶标板，在波长450 nm读数。
   2.12

   根据标准孔数据绘制标准曲线，根据OD值计算脂多糖浓度。
   
   

结果与分析

利用ELISA Calc回归拟合计算程序– v 0.1，绘制标准曲线：

1.  根据标准曲线孔结果，输入与标准品浓度对应的OD值（图2），扣除零孔背景值，进行回归拟合。
   
   
   图2. ELISA Calc回归拟合计算程序——v 0.1数据输入界面
   
   
2.  点击“回归方程”，获得拟合曲线（图3）。
   
   
   图3. Logistic曲线拟合（四参数）标准曲线
   
   
3.  确定r²值 (与1越接近曲线越真实可靠，图4)。
   
   
   图4. 回归方程及数据转换界面
   
   
4.  点击由Y (反应/OD值) 计算X (浓度/剂量)
   
5.  输入每孔对应OD值读数，获得LPS浓度 (EU/L)。

注意事项

1. 食糜匀浆离心后需要小心吸取上清，避免杂质干扰试验结果。
2.  确保孵育时间和孵育温度正确，以保证抗原抗体结合充分。
3.  配置洗涤液时应轻轻摇匀，避免泡沫产生。
4.  洗板过程中不要让板处于干燥状态时间过长，以免影响显色结果。
5. 显色液应按顺序足量添加。
6. 确保酶标板底部干净，未受污染，以免影响读数结果。
7. 如有多余孔可进行复孔试验，增加试验稳定性以及数据可信性。
8.  根据实际情况确定最佳稀释倍数，有条件的情况下，可以进行预实验。
9. 所有试验中使用的器材均做去热原处理，避免干扰试验结果。
   

失败经验

1. 未调节离心转速，导致LPS离心沉淀，无法检出。应注意离心转速数值和单位，以及离心时间。

溶液配方

1. PBS
   使用分析天平分别称取8 g NaCl，0.2 g KCl，3.628 g Na₂HPO₄·12H₂O，0.24 g KH₂PO₄，加入灭菌去离子水，搅拌均匀，使用容量瓶定容至1 L，用NaOH或HCl调节pH至7.4，常温保存。

致谢

感谢国家自然科学基金面上项目 (32072751) ，广东省现代农业产业技术体系创新团队 (2019KJ137) ，十三五重点研发计划 (2016YFD0500509-07) ，国家水禽产业技术项目 (CARS-42-15) ，广东省基础与应用基础研究基金温氏联合基金项目 (2019B1515210012) 对本研究提供的资助。

参考文献

1. Lu, Y. C., Yeh, W. C., and Ohashi, P. S. (2008). LPS/TLR4 signal transduction pathway. CYTOKINE 42, 145-151.
2. Riedel, C. U., Schwiertz, A., and Egert, M. (2014). The human microbiota and microbiome. CABI.
3. Sridharan, G. V., Choi, K., Klemashevich, C., Wu, C., Prabakaran, D., Pan, L. B., Steinmeyer, S., Mueller, C., Yousofshahi, M., and Alaniz, R. C. (2014). Prediction and quantification of bioactive microbiota metabolites in the mouse gut. NAT COMMUN 5, 5492.