土壤宏转录组样本制备
Soil Sample Preparation of Microbial Communities for Metatranscriptomics    

材料与试剂

1. 微型玻璃珠 (Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司，货号：Z250465和G1145，室温保存)
2. 水饱和酚 (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：A504195，冷藏保存)
3. Tris (赛默飞世尔科技有限公司，货号：AM9851，室温保存)
4. Tris-HCI Buffer (赛默飞世尔科技有限公司，货号：15567027，室温保存)
5. Polyvinylpyrrolidone (Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司，货号：81400)
6. MgCl₂ (国药集团化学试剂有限公司，常温保存)
7. TE缓冲液 (赛默飞世尔科技有限公司，货号：AM9849，室温保存)
8. 十二烷基硫酸钠 (SDS) (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：A500228，室温保存)
9. 苯酚 (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：A601971，冷藏保存)
10. Tris-HCl缓冲液 (pH 7.0) (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：B548137，室温保存)
11. 苯酚-氯仿-异戊醇混合物 (国药集团化学试剂有限公司，货号：K7761701，冷藏保存)
12. 氯仿-异戊醇混合物 (Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司，货号：C0549，冷藏保存)
13. 乙酸钠 (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：A100602，常温保存)
14. 异丙醇 (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：A507048，常温保存)
15. 无水乙醇 (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：A500737，常温保存)
16. 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水 (赛默飞世尔科技有限公司，货号：AM9916，冷藏保存)
17. Recombinant DNase I (TaKaRa生物工程有限公司，货号：2270A，冷冻保存)
18. 0.5 M EDTA溶液 (生物工程 (上海) 股份有限公司，货号：B540625，常温保存)
19. Glycogen (碧云天生物，货号：D0812，冷冻保存)
20. RNeasy MinElute Cleanup Kit (凯杰企业管理 (上海) 有限公司，货号：74204，RNeasy MinElute spin columns冷藏保存，其余试剂室温保存)
21. Ribo-Zero rRNA removal Kit (Illumina有限公司 (美国)，货号：MRZMB126，磁珠和磁珠缓冲液冷藏保存，其余试剂于-80 °C保存)
22. RNA 6000 Pico Chip (安捷伦科技 (中国) 有限公司，货号：5067-1513，保存期4个月)
23. NEBNext^® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (安诺伦 (北京) 生物科技有限公司，货号：NEB #E7420S，冷冻保存)
24. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，分析纯，常温保存)
25. TPM缓冲液 (见溶液配方)
26. PBL缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 快速核酸提取仪 (安倍医疗器械贸易 (上海) 有限公司 (MP Biomedicals)，型号：FastPrep^®-24)
2. 台式超速离心机 (Eppendorf中国有限公司)
3. 微型离心机
4. PCR核酸扩增仪 (美国Bio-Rad (伯乐) 有限公司)
5. 恒温混匀仪
6. 电泳仪 (美国Bio-Rad (伯乐) 有限公司)
7. 凝胶成像分析系统 (美国Bio-Rad (伯乐) 有限公司)
8. Qubit 4荧光计 (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司，型号：Q33239)
9. 立式压力蒸汽灭菌器 (上海博迅医疗生物仪器有限公司)
10. Bioanalyzer (安捷伦科技 (中国) 有限公司，型号：2100)
11. 磁力试管架 (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司，型号：12321D)
    

实验步骤

1. 总RNA提取
   本研究的RNA提取方法参考 (Mettel et al., 2010; Ma et al., 2012; Peng et al., 2017; Peng et al., 2018)，以SDS-Phenol (Sodium dodecyl sulfate-Phenol) 法为例。
   
   1.1

   称取0.5 g新鲜土壤样品于2 ml离心管中。加入同等重量玻璃珠 (0.5 mm：0.1 mm = 3:2，Sigma) 和700 μl预冷的TPM缓冲液。
   1.2

   将混合液样品管放入快速核酸提取仪，以6.0 ms^-1的速度裂解细胞35 s。
   1.3

   4 °C，20,000 × g，离心5 min。转移上清液至新的2 ml离心管中。加入预冷的PBL缓冲液700 μl，再次震荡离心。最后将两次裂解所得的上清液混合，弃沉淀样品。
   1.4

   在得到的上清液中加入500 μl水饱和酚，颠倒30 s充分混匀后以20,000 × g离心3 min，将水相转移至新的2 ml离心管中。依次加入500 μl酚-氯仿-异戊醇混合液和氯仿-异戊醇混合液，步骤同上。最后吸取水相500 μl至新的1.5 ml离心管。
   1.5

   将所得水相与0.1体积的3 M乙酸钠溶液 (pH 5.7) 和0.7体积的异丙醇混合，室温下静置孵育5 min。随后在12,000 × g和4 °C条件下离心30 min (可通过延长离心时间 (最长1 h) 来提高RNA产量)。
   1.6

   沉淀中加入400 μl 预冷的70%乙醇，轻摇 (使乙醇覆盖沉淀) 数次，离心5 min。用移液枪吸走残留乙醇溶液，并于超净工作台中自然风干 (5-10 min)。最后加入50 μl DEPC水溶解，混匀RNA样品。
   1.7

   使用Recombinant DNase I (Takara) 去除RNA 样品中的DNA污染，主要体系 (50 μl) 如下：
   总RNA 1-5 μg
   10× DNase I Buffer 4.5 μl
   Recombinant DNase I 2.5 μl
   RNase Inhabitor 20 U
   DEPC水 补齐至50 μl
   1.8

   混合液于37 °C孵育30 min。加入2.5 μl 0.5 M EDTA，混匀，于80 °C孵育2 min，移至新管。用DEPC水定容至100 μl (试剂盒说明书下载地址如下：https://www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/2270A.pdf)。
   1.9

   以RNA提取物为模板，对细菌16S rRNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA中DNA是否去除。
2. 总RNA纯化
   利用RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)，按照说明书 (https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=0acfc1c7-a1f8-4425-9aaf-b0d98b81bd1f&lang=en) 去除5S rRNA和盐，具体操作步骤如下：
   
   2.1

   利用DEPC水调节获得的RNA样品体积至100 μl，加入350 μl RLT缓冲液，混匀。
   2.2

   加入250 μl 100%乙醇，移液枪吹打混合均匀。
   2.3

   将步骤 (2) 获得样品转移至含有RNeasy MinElute 柱的2 ml离心管中。以 ≥ 8,000 × g速度离心15 s，丢弃液体。
   2.4

   将RNeasy MinElute柱子放入新的2 ml离心管中。添加500 μl RPE (确保已加入要求体积的乙醇) 缓冲液以 ≥ 8,000 × g速度离心15 s来洗涤柱膜，丢弃液体。
   2.5

   在RNeasy MinElute柱中加入500 μl 80%乙醇。以≥ 8,000 × g离心2 min。
   2.6

   将RNeasy MinElute柱放入新的2 ml离心管，以最大的速度离心5 min，弃液体和收集管。
   2.7

   将RNeasy MinElute柱放入新的1.5 ml离心管中。加入14 μl DEPC水至膜柱中心。以最大转速离心1 min来洗脱RNA (可洗脱两次提高RNA量)。
   2.8

   通过琼脂糖凝胶电泳，评判总RNA质量 (是否还有第三条条带 (5S rRNA))，利用荧光计 (Qubit^®, ThermoFisher, USA) 及Qubit™ RNA BR Assay 试剂盒测定RNA浓度。
3. mRNA富集
   mRNA只占原核细胞总RNA的1 - 5%，对mRNA进行富集可以显著提高转录组覆盖率和图谱的分辨率。本文利用Ribo-Zero rRNA removal Kit (Illumina)，按照说明书 (https://jp.support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/docu mentation/chemistry_documentation/ribosomal-depletion/ribo-zero/ribo-zero-reference-guide-15066012-02.pdf) 对mRNA进行富集。主要步骤如下：
   
   3.1

   清洗磁珠。每个样品取225 μl 磁珠溶液，添加到1.5 ml离心管中。利用磁力试管架吸附磁珠直到液体变清 (约1min)。小心移除所有上清液，添加225 μl DEPC水，涡旋充分清洗磁珠。重新吸附磁珠弃上清。向磁珠中添加65 μl磁珠缓冲液，涡旋混匀，于室温下放置。
   注：磁珠于2 °C – 8 °C温度下保存。在室温条件下使用磁珠。
   3.2

   探针与样品rRNA杂交。将1-5 μg总RNA、8-10 μl Ribo-Zero Removal溶液、4 μl Ribo-Zero 反应缓冲液加入到0.2 ml 离心管中，用DEPC水补齐至40 μl。68 °C孵育10 min。短暂离心后于室温下孵育5 min。
   注：探针杂交前，RNA样品必须经过纯化，无DNA污染。
   3.3

   移除rRNA。将获得的40 μl RNA样品添加含有清洗过的磁珠的离心管中，用移液枪轻轻吹打混匀。涡旋10 s后于室温孵育5 min。然后置于50 °C恒温仪孵育5 min。置于磁力试管架吸附磁珠，直到液体变清 (约1 min)。转移85 - 90 μl富集的mRNA上清液移至1.5 ml收集管中，冰上放置。
   3.4

   乙醇沉淀法去除盐分和缓冲液。向获得的mRNA上清液中加入DEPC水，调节溶液体积为180 μl。依次加入18 μl 3 M 乙酸钠、2 μl 糖原 (10 mg ml^-1)和600 μl 100% 乙醇，涡旋混匀。在-25 °C 至 -15 °C放置1 h后于10,000 × g，4 °C条件下离心30 min，弃上清。沉淀中加入200 μl 新配制的70% 乙醇，10,000 × g，4 °C下离心管5 min，弃上清，重复该步骤。室温下干燥5 min，加入适量DEPC水溶解沉淀。
   3.5

   检测mRNA样品产量和质量。利用荧光计 (Qubit^®, ThermoFisher, USA) 定量mRNA浓度。使用Agilent bioanalyzer 2100仪器和RNA 6000 Pico Chip检测mRNA质量。
4. 宏转录组文库构建
   基于NEBNext^® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, USA) 试剂盒，按照说明书(https://international.neb.com/protocols/2015/06/09/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-ribosome-depleted-rna-e7420) 进行宏转录组文库构建。主要步骤如下：
   
   4.1

   将纯化后的mRNA反转录为单链cDNA。体系为：5 μl mRNA (10-100 ng)、4 μl NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) 和1 μl Random Primers，体系总体积为10 μl。
   4.2

   根据RNA的完整度，在94 °C下孵育7-8 min (RIN为2-6) 或15 min (RIN > 7)。转移离心管至冰上。
   4.3

   体系中加入0.5 μl Murine RNase Inhibitor、5 μl Actinomycin D (0.1 μg μl^-1)、1 μl ProtoScript II Reverse Transcriptase、3.5 μl DEPC水，使最终体系为20 μl。用移液枪轻轻吹打混匀。依次在25 °C条件下孵育10 min，42 °C孵育15 min，70 °C孵育15 min。
   4.4

   合成双链cDNA。向孵育结束后的离心管中加入8 μl Second Strand Synthesis Reaction Buffer (10×)、4 μl Second Strand Synthesis Enzyme Mix和48 μl DEPC水，体系最终体积为80 μl。反应液用移液枪轻轻吹打混匀，在PCR仪上以16 °C孵育60 min (热盖温度为40 °C)。
   4.5

   纯化双链cDNA。添加144 μl (1.8×) AMPure XP Beads悬浮液至上述体系中，涡旋混匀后于室温孵育5 min。快速离心，用磁力架吸附磁珠。待溶液澄清后(约5 min)，小心去除上清液。加入200 μl 新配制80% 乙醇，室温下孵育30 s后小心移去上清液，重复该步骤。开盖干燥磁珠5 min (注：切记不要过长时间干燥磁珠，以免降低cDNA产量)。以上步骤均在磁力架上进行。离心管从磁力架移下，添加60 μl 0.1× TE缓冲液或10 mM Tris-HCl，涡旋混匀，从而将cDNA从磁珠上洗脱。短暂离心后于室温孵育2 min，置于磁力架上至溶液清晰。转移55.5 μl含有cDNA的上清液至新PCR管。
   4.6

   cDNA文库制备。向纯化后的双链cDNA中 (55.5 μl) 加入6.5 μl NEBNext End Repair Reaction Buffer (10×) 和 3 μl NEBNext End Prep Enzyme Mix，体系最终体积为65 μl。反应程序为：热盖，75 °C ；20 °C，30 min；65 °C，30 min；4 °C，保持。
   4.7

   进行接头连接。PCR管中配置接头连接体系：65 μl上述反应液、15 μl Blunt/TA Ligase Master Mix、1 μl 稀释至1.5 μM 的NEBNext Adapter，最后用2.5 μl DEPC水补齐体系至83.5 μl。用移液枪吹打混匀，经短暂离心后置于20 °C孵育15 min。
   注：配置连接体系前，切勿预混以上试剂，以免形成接头二聚体。
   4.8

   纯化连接反应。
   

   1)

   向上述连接液中加入DEPC水使其体积为100 μl，然后加入100 μl重悬AMPure XP Beads，涡旋混匀，于室温下孵育5 min。

   2)

   PCR管经短暂离心后放于磁力架上，分离磁珠和溶液。待溶液澄清后 (约 5 min)，小心移除上清，从而去除非目的片段。

   3)

   加入200 μl新制备的80%乙醇，放于磁力架，室温孵育30 s，轻轻移去上清液，重复该步骤。

   4)

   短暂离心后将PCR管放于磁力架上，开盖干燥5 min (切忌干燥时间过长)，完全去除残留乙醇。

   5)

   PCR管从磁力加上移去，添加52 μl 0.1× TE 或 10 mM Tris-HCl，涡旋充分混匀，将cDNA从磁珠上洗脱，室温孵育2 min。

   6)

   重新放置PCR管于磁力架直至溶液澄清。转移50 μl上清液至新PCR管，加入50 μl (1.0×)重悬AMPure XP Beads，涡旋混匀，室温孵育5 min。

   7)

   重复步骤2)-步骤4)。

   8)

   PCR管从磁力架上移除，添加19 μl 0.1× TE 或 10 mM Tris-HCl，涡旋充分混匀，室温孵育2 min。重新放置PCR管于磁力架直至溶液澄清。

   9)

   轻轻转移17 μl 上清液至新PCR管进行PCR扩增富集，注意勿扰动磁珠。
   4.9

   PCR扩增富集接头连接DNA。
   

   1)

   向步骤4.8获得cDNA (17 μl) 中加入 3 μl NEBNext USER Enzyme、25 μl NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix、2.5 μl Index (X) Primer和2.5 μl Universal PCR Primer，体系最终体积为50 μl。

   2)

   PCR反应程序如下：
   37 °C，15 min；98 °C，30 s；98 °C 10 s 和65 °C 30 s，循环12-15次；65 °C，5 min; 4 °C，保持。
   4.10

   利用Agencourt AMPure XP Beads纯化PCR反应。
   

   1)

   向步骤4.9中获得的反应液中加入45 μl重悬AMPure XP Beads，涡旋混匀，于室温下孵育5 min。

   2)

   PCR管经短暂离心后放于磁力架上，分离磁珠和液体，待溶液澄清后 (约 5 min)，小心移除上清。

   3)

   加入200 μl新制备的80%乙醇，于磁力架上室温孵育30 s，轻轻移去上清液，重复该步骤。

   4)

   短暂离心后将PCR管放于磁力架上，开盖干燥5 min，完全去除残留乙醇。

   5)

   PCR管从磁力架上移去，加入23 μl 0.1× TE。涡旋充分混匀，将cDNA从磁珠上洗脱，短暂离心后室温孵育2 min。重新放置PCR管于磁力架直至溶液澄清。

   6)

   转移20 μl上清液至新的PCR管，储存于-20 °C。
   4.11

   文库质量评估。用10 mM Tris 或 0.1× TE稀释2-3 μl cDNA。利用Agilent bioanalyzer 2100检测cDNA电泳分布。

结果与分析

1. RNA质量评价-基于bioanalyzer电泳图
   
   
   图1. 水稻土总RNA (a) 和富集mRNA (b和c) 电泳图 (Peng et al., 2017)
   
   图1为bioanalyzer分析原核生物mRNA富集前后电泳图对比，可以清晰地看到不同样品中mRNA富集程度差异 (即16S rRNA和23S rRNA去除程度)。b 图样品中16S rRNA和23S rRNA去除程度高，mRNA富集程度好，适合进行下游反转录和宏转录组文库构建，而c图样品中16S rRNA和23S rRNA残留程度相对较高，mRNA富集程度较差。
2. cDNA质量评价标准——电泳图
   
   
   图2. cDNA电泳图 (Peng et al., 2018)
   
   图2为bioanalyzer原核生物cDNA典型电泳图。左侧峰为50 bp内标物，中间峰为cDNA，而右侧峰为1700 bp内标物。由图可知，该样品中cDNA峰较为明显且峰面积大，无拖尾峰、前沿峰、包裹峰及其他的杂乱峰，说明文库质量较高，可满足文库构建和下一步宏转录测序的需要。
   

溶液配方

1. TBM缓冲液 (pH 7.0): 50 mM Tris-HCl，1.7% (wt/vol) polyvinylpyrrolidone和20 mM MgCl₂。
2. PBL缓冲液 (pH 7.0): 5 mM Tris-HCl，5 mM Na₂EDTA，0.1% (wt/vol) 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和6% (vol/vol) 苯酚溶液。
   

致谢

感谢国家自然科学基金 (41977038，42007032) 对本研究的资助。使用本实验方案已发表的文章有：Peng, J., Wegner, C. E. and Liesack, W. (2017). Short-term exposure of paddy soil microbial communities to salt stress triggers different transcriptional responses of key taxonomic groups. Front Microbiol 8: 400; Peng, J., Wegner, C. E., Bei, Q., Liu, P. and Liesack, W. (2018). Metatranscriptomics reveals a differential temperature effect on the structural and functional organization of the anaerobic food web in rice field soil. Microbiome 6:169.

参考文献

1. Ma, K., Conrad, R. and Lu, Y. (2012). Responses of methanogen mcrA genes and their transcripts to an alternate dry/wet cycle of paddy field soil. Appl Environ Microbiol 78: 445-454.
2. Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M. and Liesack, W. (2010). Extraction of mRNA from soil. Appl Environ Microbiol 76: 5995-6000.
3. Peng, J., Wegner, C. E., Bei, Q., Liu, P. and Liesack, W. (2018). Metatranscriptomics reveals a differential temperature effect on the structural and functional organization of the anaerobic food web in rice field soil. Microbiome 6:169.
4. Peng, J., Wegner, C. E. and Liesack, W. (2017). Short-term exposure of paddy soil microbial communities to salt stress triggers different transcriptional responses of key taxonomic groups. Front Microbiol 8: 400.