乳酸菌的耐热实验
Heat Resistance Test of Lactic Acid Bacteria   

材料与试剂

1. 涂布器
2. 离心管 (1.5 ml，15 ml)
3. MRS肉汤培养基 (赛默飞，CM1175)
4. 琼脂 (生工，A505255)
5. PBS缓冲液 (国药，HYSH3025601)
6. MRS固体培养基 (见溶液配方)
7. MRS液体培养基 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 量筒
2. 玻璃棒
3. 涂布器
4. 移液枪
5. 恒温水浴锅 (江苏荣华仪器，HH-4)
6. 90 mm塑料培养皿 (biosharp BS-90-D)
7. 纯水制备仪 (ELGA PURELAB系列)
8. 吸头 (生工，F601227)
9. 烘箱 (天津泰斯特101-0AB型电热鼓风干燥箱)
10. 厌氧培养箱 (Whitley, DG250)
11. 超净工作台 (天津泰斯特，CJ-2D)
12. 10 μl, 20 μl接种环 (生工，F619312)
13. 高压灭菌锅 (上海庆开，GI54TW)
14. 冰箱 (美菱)
15. 摇床 (Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪)
    

实验步骤

一、制备细菌悬液 (以下操作均于超净工作台上进行)

1. 将待测菌株从-80 °C冰箱取出置于冰盒上，用无菌接种环采用连续划线的方式将待测菌株接种于MRS固体培养基，37 °C厌氧培养箱中倒置培养24 h。
2. 从厌氧培养箱中取出培养皿，用灭菌后的牙签或枪头挑取平板上由单个菌生长成的单菌落，接种于装有1 ml MRS液体培养基的微型离心管（1.5 ml或2.0 ml）中，搅拌或吹打混匀 (谢凤珍等，2014)。做好标记置于37 °C厌氧培养箱中静置培养12 h，直至OD₆₀₀约为3.0。
3. >将步骤2培养后的菌液震荡混匀，取100 μl转移至装有900 μl MRS液体培养基的微型离心管中，做好标记置于37 °C厌氧培养箱继续静置培养18 h。直至OD₆₀₀约为3.0。
4. 重复步骤3以充分活化乳酸菌。
5. 将步骤4培养后的菌液震荡混匀，取1 ml菌液转移至装有30 ml MRS液体配养基的灭菌小锥形瓶中，轻轻混匀置于37 °C厌氧培养箱静置培养24 h，直至OD₆₀₀约为3.0。
6. 取10 ml锥形瓶中菌液至15 ml离心管中，盖上盖子颠倒混匀，再从中取1.5 ml菌液于2.0 ml微型离心管中，共取四管。分别编号为1，2，3，4。
   注：不能直接取用锥形瓶中的菌液，避免上下层菌液不均匀影响实验结果。

二、将菌液进行热处理
        将编号为1，2，3，4的菌液分别至于预调到37 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C的水浴锅中处理5 min，处理后立即放在冰盒中。
       注：处理温度和时长可根据细菌的耐受情况进行适当调整。

三、测定存活细菌数

1. 用灭菌PBS缓冲液对热处理后的菌液进行梯度稀释至10^-3，10^-4，10^-5(周平等，2014)。
2. 分别取上述稀释倍数的菌液10 μl，用无菌接种环或涂布器将菌液均匀涂布于MRS固体培养基上，待干燥后将培养皿于37 °C厌氧培养箱中倒置培养24 h。每个稀释倍数3个重复。
3. 次日观察培养皿上的菌落生长情况，数出培养皿上的菌落数（菌落数在30-300为有效），每个稀释倍数的三个重复组的菌落数取平均值为实验结果，与对照组(37 ℃热处理组)菌落数的比值即为该菌在该温度下的生存率。

Survival (%) =CFU/ml (t) ×100/CFU/ml (t0)

结果与分析

1. 耐热实验结果
   

本实验待测菌为HSM-1,HSM-10,HSM-14,HSM-18四株乳酸菌。热处理后HSM-1表现出最高的存活率，其次是HSM-10和HSM-14。50 °C热处理5 min后，HSM-1 存活率为74.6% ，HSM-10和HSM-14的生存率分别为57.5%和32.7%，而HSM-18的热处理后存活率最低为9.0% 。60 °C热处理5 min后，HSM-1存活率为74.2%。HSM-10和HSM-14的生存率分别下降到14.4%和11.6% (Chen et al., 2020)。在70 °C热处理后，菌株存活率下降不到1%。这些结果表明，在50 °C和60 °C条件下，与其他三种菌株相比，HSM-1具有更好的耐热性，更利于工业化应用。

表1. 四种乳酸菌体外耐热实验结果 (Chen et al., 2020)

失败经验

一、失败原因

1.  操作过程中没有进行严格的无菌操作。
2.  细菌活化程度低，导致后期生长速度太慢。
3.  细菌接种后菌落数太多或太少，使实验结果不精确。
   
   
   

1. 若平板染菌则重新用储存在4 ℃冰箱的的菌液重新稀释涂布于MRS固体培养基进行实验。
2. 把握活化细菌时的培养时间，取对数期生长的细菌进行实验。
3.  进行多个稀释倍数处理，以找到数量适宜的培养皿进行数数。
   
   
   

溶液配方

1.  MRS固体培养基配方 (1,000 ml)
   
   
   
   
2.  MRS液体培养基配方 (1,000 ml)
   
   
   

MRS培养基灭菌温度为115 °C、20 min。

致谢

感谢国家自然科学基金青年项目 (31700004) ，全国大学生平台创新和创业培训项目(S202010542046)，湖南省大学生研究性学习与创新实验项目(S201910542041)，湖南省科技厅创新人才与平台计划 (2019RS5001) ，湖南创新型省份建设专项经费 (2019RS3022) 的支持。

参考文献

1. 谢凤珍,华承伟,牛宏阳.(2014).耐热木聚糖酶源细菌筛选、鉴定及酶学性质[J].河南科技学院学报(自然科学版),42(05):7-10.
2. 周平,罗惠波,黄丹,邓波,王庆,黄治国,卫春会,邓杰.(2016).中高温大曲中一株耐热细菌的分离鉴定及其风味代谢产物分析[J].食品工业科技,37(24):215-220.
3. Chen,T.,Wang,L.,Li,Q.,Long,Y.,Lin,Y.,Yin,J.,Zeng,Y.,Huang,L.,Yao,T.,Abbasi,M.N.,Yang,H.,Wang,Q.,Tang,C.,Khan,T.A.,Liu,Q.,Yin,J.,Tu,Q.,&Yin,Y.(2020).Functionalprobiotics of lactic acid bacteria from Hu sheep milk. BMC microbiology 20(1), 228.