瘤胃内容物样本中有机酸的定量分析 (高效液相色谱)
Quantitative Analysis of Organic Acids in Samples of Rumen Content (HPLC)   

材料与试剂

1. 枪头 (10, 200和1000 μl)
2. 离心管2 ml
3. 超纯水
4. 封口膜
5. 滤膜 (0.2 μm)
6. 氢氧化钙 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
7. 硫酸铜 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
8. 巴豆酸 (Macklin，色谱纯)
9. 浓硫酸 (H₂SO₄，沪试，优级纯)
10. 乙二胺四乙酸 (阿拉丁，色谱纯)
11. 琥珀酸 (阿拉丁，色谱纯)
12. 乳酸 (阿拉丁，色谱纯)
13. C1-C6 (阿拉丁，色谱纯)
14. 氢氧化钙溶液 (见溶液配方)
15. 硫酸铜溶液 (见溶液配方)
16. EDTA溶液 (见溶液配方)
17. 混合标准酸溶液 (见溶液配方)
18. 标样中有机酸浓度 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 螺口瓶 (250 ml)
2. 锥形瓶 (500 ml)
3. 容量瓶 (500 ml)
4. 量筒 (500 ml)
5. 烧杯 (4 L)
6. 玻璃棒
7. 高效液相色谱仪 (Waters 1525)
8. 磁力搅拌器 (上海雷磁 JB-2A)
9. 离心机 (Eppendorf 5810R)
10. 真空泵 (上海亚荣 YR-PTB)
    

实验步骤

一、样品前处理制备

1. 将1.5 ml的体外瘤胃培养液 (参照Menke1979等体外瘤胃发酵方法) 或过滤瘤胃液 (直接从瘘管牛/羊瘤胃中取出瘤胃液经四层纱布过滤所得) 样本移入2.0 ml的离心管中，离心 (12,000 × g，5 min，4 °C)。
2. 吸取 600 μl 上清液，转移到新的 2.0 ml 离心管中，加入600 μl 氢氧化钙溶液和300 μl硫酸铜溶液，涡旋混匀，放置-20 °C冰箱冷冻 (Siegfried and Huckermann, 1984)。
3. 解冻试管，离心 (12,000 × g，10 min，4 °C)。
4. 转移1000 μl的上清液到空的2.0 ml的离心管中 (含有28 μl的浓硫酸) 混匀，-20 °C冷冻。
5. 再次解冻试管后，重复冷冻一次，使溶液沉淀充分析出。
6. 解冻试管，离心 (12,000 × g，10 min，4 °C)。
7. 转移 800 μl 上清液到高效液相色谱小瓶中，待测。
   

二、高效液相色谱条件 (Weimer, et al., 1991; Njokweni et al., 2019)

1. 色谱柱：Rezex RHM Monosaccharide 7.8 × 300 mm column (00H0132-K0, Phenomenex)
2. 溶剂：EDTA
3. 流速：0.7 ml/min
4. 柱温：45 °C
5. 进样量：50 μl
6. 检测器：UV/Vis检测器 (220 nm)
   

三、有机酸浓度的计算
通过标准样品和内标巴豆酸各自的浓度 (或峰面积) 计算出乙酸、丙酸等有机酸的相对 校正因子，然后根据乙酸、丙酸等酸的浓度与其峰面积成正比计算出样品中有机酸的 浓度。
        例如：求体外瘤胃发酵样品中丁酸浓度。
        通过上样分析我们已知标样中的内标巴豆酸峰面积为800，丁酸峰面积为400；样品中内标巴豆酸峰面积为1000，丁酸峰面积为200。
        相对校正因子：f_丁 = C_丁A_内标/W_内标A_丁 = 10 × 800/10 × 400 = 2
        C_丁 ：标样中组分丁酸的浓度
        W_内 ：标样中内标物的浓度
        A_内标 ：标样中组分丁酸的峰面积
        A_丁 ：标样中内标物的峰面积
        丁酸浓度 (mM) = w_内标f_丁a_丁/a_内标 = 10 × 2 × 200/1000 = 4 mM/L
        w_内标 ：待测样品中内标物的浓度
        f_丁 ：组分丁酸的校正因子
        a_丁 ：待测样品丁酸的峰面积
        a_内标 ：待测样品内标物的峰面积
        某酸浓度 (mM) = (样品某酸峰面积值×巴豆酸标样峰面积×某酸标样浓度)/(样品中巴豆酸面积值×标样某酸峰面积)
        有机酸重现率：将某有机酸 (如乙酸) 连续上样几次，测定其峰面积值，利用某酸峰面积值和内标峰面积值计算其重现率。

结果与分析

各组分出峰时间见下表1。

表1. 有机酸出峰时间

溶液配方

1. 氢氧化钙溶液
   称取52.9 g Ca(OH)₂，放入250 ml螺口瓶中，加入磁力搅拌子和200 ml超纯 水，将瓶中溶液混匀。当分配试剂时，使用磁力搅拌器，以保持吸取均匀的浆液。
2. 硫酸铜溶液
   称取50.0 g CuSO₄·5H₂O加入500 ml三角瓶中，用400 ml超纯水溶解，再加入2.0 g巴豆酸，充分溶解后，定容于500 ml容量瓶中。
3. EDTA溶液
   1.60 ml浓硫酸、0.40 g乙二胺四乙酸，3.5 ml超纯水溶解在4 L烧杯中。在加热 板加热，然后冷却过夜，以完全溶解EDTA。用超纯水将冷却的溶液稀释到4 L， 利用真空泵过膜 (0.2 μm)，将滤液转移到HPLC储存瓶中。
4. 有机酸标准溶液 (见表2)
   
   表2. 有机酸标准溶液
   

   琥珀酸 10 mM	乳酸 10 mM	甲酸 10 mM	乙酸 10 mM	丙酸 10 mM	异丁酸 10 mM	丁酸 10 mM	异戊酸 5 mM	巴豆酸 10 mM	戊酸 10 mM	己酸 10 mM
   118.1 mg	75.1 μl	37.7 μl	57.3 μl	74.6 μl	92.8 μl	91.8 μl	54.5 μl	84.6 μl	108.4 μl	124.9 μl

   注：有机酸标准样品定容在100 ml容量瓶中。

致谢

本研究得到了国家现代农业产业技术体系 (CARS-36)，江苏省高校优势学科建设自主工程项目资助。Lin, M., Dai X. X. and Weimer P. J. (2019). Shifts in fermentation end products and bacterial community composition in long-term, sequentially transferred in vitro ruminal enrichment cultures fed switchgrass with and without ethanol as a co-substrate.Bioresource Technol285: 121324.

参考文献

1. Menke, K. H., Raab, L., Salewski, A. and Schneider, W. (1979). The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro. J Agr Sci 93(1): 217-222.
2. Siegfried, V. R., Huckermann, H. and Stumpf, G. (1984). Method for the determination of organic acids in silage by high perfomance liquid chromatography. Landwirtsch Forsch 37: 298-304.
3. Weimer, P. J., Shi, Y. and Odt, C. L. (1991). A segmented gas/liquid delivery system for continuous culture of microorganisms on solid substrates, and its use for growth of Ruminococcus flavefaciens on cellulose. Appl Microbiol Biotechnol 36: 178-183.
4. Njokweni, G. S., Weimer, P. J., Warburg, L., Botes, M. and van Zyl, W. H. (2019). Valorisation of the invasive species, Prosopis juliflora, using the carboxylate platform to produce volatile fatty acids. Bioresource Technol 288: 121602.