原生质体法制备根系腐生型共生菌 (伞菌目) 单核化菌丝
Protoplast Regeneration to Obtain Monokaryotic Strain from the Quercus-Associated Clitopilus hobsonii   

研究背景

荷伯生氏斜盖伞Clitopilus hobsonii (Agaricales) 首次分离自栎类林腐木 (Orton, 1960)，是典型的土壤腐生真菌。笔者发现该菌在大果栎Quercus macrocrpa、舒玛栎Quercus shumardii、牛栎Quercus michauxii、琴叶栎Quercus lyrata、白栎Quercus fabri等新鲜菌根组织中均能分离到。进一步研究发现，该菌能够促进栎类幼苗生长，且与多种苗木建立共生关系，形成类似“微菌核”的侵染结构，促进苗木根系发育和养分吸收。笔者认为破译该菌的遗传信息可能为丰富外生菌根真菌起源于腐生真菌这一学说提供更多的基因组进化证据。然而该菌株为异核双核体，基因组存在不同程度的杂合率，这将给基因组组装和注释带来一定挑战，影响后续进化生物学分析和功能研究。单核化作为“简化”复杂基因组的一种策略，是有效开展异核双核真菌全基因组测序分析的重要环节。因此，制备荷伯生氏斜盖伞单核体菌株将为顺利开展基因组测序和组装奠定基础。

材料与试剂

1. 纱布
2. 无纺布
3. 10 ml注射器
4. 0.45 μm滤膜
5. 50 ml离心管
6. 荷伯生氏斜盖伞双核体菌株
7. DAPI (sigma, catalog number: D9542) 
8. 细胞壁裂解酶 (sigma, catalog number: L1412)
9. 真菌基因组DNA快速提取试剂盒 (Aidlab, catalog number: DN4102)
10. I-5™ 2× High-Fidelity Master Mix (TSINGKE, catalog number: TP001)
11. 琼脂糖 (Genview, catalog number: 9012-36-6)
12. 超纯水
13. ddH2O
14. 葡萄糖 (Macklin, catalog number: D810588)
15. 酵母提取物 (Oxoid, catalog number: LP0021)
16. 琼脂 (BD, catalog number: 214010)
17. 麦芽提取物(Cool Chemistry, catalog number: BL360016)
18. 蔗糖 (沪试, catalog number: 10021418)
19. NaCl (沪试, catalog number: 10019318)
20. KH₂PO₄ (沪试, catalog number: 10017618)
21. K₂HPO₄ (沪试, catalog number: 20032118) 
22. PDA培养基 (见溶液配方)
23. YMG液体培养基 (见溶液配方)
24. MYG再生培养基 (见溶液配方)
25. 0.5 M蔗糖溶液 (见溶液配方)
26. 0.1 M PBS缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 盖玻片
2. 载玻片
3. 打孔器
4. 250 ml锥形瓶
5. 涂布棒
6. 漏斗
7. 镊子
8. 直尺
9. 电泳仪 (六一, model: DYY-6C) 
10. 全温振荡器 (培英, model: THZ-C-1)
11. 生化培养箱 (博讯, model: SPX-250B-Z)
12. 台式高速冷冻离心机 (Sigma, model: 3K15) 
13. 电热鼓风干燥箱 (新诺, model: 101-0AS) 
14. 立式压力蒸汽灭菌器 (申安, model: LDZF-50KB-II) 
15. 激光共聚焦荧光显微镜 (Carl Zeiss, model: LSM700) 
16. PCR扩增仪 (BIO RAD, model: MyCyclerTM Thermal Cycler)
17. 光学显微镜 (Carl Zeiss, model: Axio Scope A1)
    

实验步骤

一、原生质体的制备及再生

1. 原生质体制备
   1.1

   以0.5 M蔗糖溶液作为渗透压稳定剂配置浓度为10 μg/ml的裂解酶溶液20 ml，先以0.45 μm 滤膜过滤除菌，再以0.22 μm滤膜二次过滤除菌后转移至50 ml离心管中备用。
   1.2

   用6 mm打孔器取10个菌丝块接种至100 ml的YMG液体培养基中，25 °C 120 rpm避光培养7 d，然后以四层纱布过滤收集菌丝体，用无菌水洗涤三次，再用0.5 M蔗糖溶液洗涤一次。
   1.3

   将洗净后的菌丝体置于10 μg/ml的裂解酶溶液中使用手持式搅拌机打碎，使其均匀分布 (1 g菌丝/5 ml酶液)，于37 °C、70-80 rpm条件下震荡酶解3 h。
   1.4

   酶解后将菌丝酶解液经无纺布过滤，得到较纯的原生质体初悬液，将所得滤液在4 °C下3000 rpm离心10 min，弃上清，得到原生质体沉淀；用0.5 M蔗糖溶液冲洗2次，弃上清，保留沉淀。
   1.5

   用1 ml 0.5 M蔗糖溶液重悬沉淀。
   1.6

   将得到的原生质体重悬液置于光学显微镜下进行镜检，用血球计数板计数并记录拍照原生质体形态。
2. 原生质体的再生
   2.1

   将100 μl原生质体重悬液均匀涂布于MYG再生培养基上，25 °C避光培养，每天观察菌落生长情况。
   2.2

   挑取10 d后长出的再生单菌落转接至PDA固体培养基上，25 °C避光条件下培养14 d后即可获得原生质体再生菌株，一次挑选10株为宜。

1. 再生菌株与出发双核体菌落的培养特征比较分析
   1.1

   菌落形态特征观察，用打孔器沿再生菌株、出发菌株的菌落边缘打孔，分别接种于PDA固体培养基中心，置于25 °C培养箱，避光培养12 d后观察菌落表型特征 (包括菌落正反面及边缘特征、色素、生长速度等)，并拍照记录。
   1.2

   再生菌株与出发菌株生长速度测定，用打孔器沿原生质体再生菌落、出发菌 落的边缘打孔，分别接种至PDA固体培养基中心，25 °C避光培养，以十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝的生长速度 (mm/d)，每个菌株设置3次生物学重复。
2. 再生菌株与出发双核体菌株的显微形态比较分析
   2.1

   菌丝形态观察，用打孔器沿原生质体再生菌落、出发菌落的边缘打孔，分别 接种至PDA固体培养基中心，25 °C避光培养3 d，在菌落边缘斜插入无菌盖玻片，待菌丝延伸至盖玻片的2/3处时，在无菌条件下取出盖玻片，制片后置光学显微镜下镜检，100× 油镜下观察两类菌株的菌丝是否存在锁状联合结构。
   2.2

   细胞核荧光染色及观察，参考胡晓棣等 (2016) 的方法并稍作改动。用镊子取出经插片培养后附着有菌丝体的盖玻片，擦去背面菌丝，向菌丝附着位置均匀滴加50 μl DAPI染色液，避光条件下对再生菌株、出发菌株的菌丝进行细胞核染色3-5 min，然后用磷酸盐缓冲液 (PBS) (pH 6.8，0.1 M) 洗涤3次。将带有菌落一侧盖玻片朝下，盖到滴有PBS缓冲液 (pH 6.8，0.1 mol/L) 的载玻片上，置于荧光显微镜下镜检 (激发光与发射光波长分别为340、488 nm
3. 基因杂合位点鉴定
   3.1

   用真菌基因组DNA快速提取试剂盒分别提取荷伯生氏斜盖伞再生菌株、出发菌株的基因组DNA。
   3.2

   采用fRPB2-5F/fRPB2-7cR和983F/2218R两对引物分别扩增rpb2 (Liu et al., 1999) 和tef-1α (Rehner and Buckley, 2005) 基因片段。PCR扩增体系 (50 μl) 如下：25 μl 1-5^TM2× High-Fidelity Master Mix，1 μl模板DNA (10-20 ng/μL)，上下游引物各2 μl (10 μmol/L)，加20 μl ddH₂O。rpb2基因PCR扩增程序：95 °C预变性4 min；95 °C变性40 s，55 °C退火50 s，72 °C延伸1.5 min，共扩增35个循环；最后72 °C延伸10 min。采用降落PCR (touch-down PCR) 方法扩增tef-1α基因，降落PCR程序参考Kluting at al. (2014) 的方法并稍作改动：94 °C预变性4 min；94 °C变性40 s，66 °C退火50 s，每循环下降1 °C，72 °C延伸1.5 min，10个循环；94 °C变性40 s，56 °C退火50 s，72 °C延伸1.5 min，共扩增30个循环；最后72 °C延伸10 min。
   3.3

   PCR扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测出条带后送擎科生物科技有限公司进行测序。采用SeqMan v.5.0软件分别对再生菌株、出发菌株的rpb2基因和tef基因进行核酸序列比对和双峰杂合位点鉴定。

结果与分析

本实验通过酶解实验成功获得了荷伯生氏斜盖伞的原生质体，经再生培养可观察到两种形态的菌落：一类表现为菌丝快速萌发 (大多出现在再生培养前期)，菌丝形态略稀疏且呈毛毡状，菌落边缘放射状，与出发菌株的菌落并无明显差异 (图1B)；另一类表现为菌丝缓慢萌发 (大多出现在再生培养后期)，菌丝形态浓白且呈绒毛状，菌落边缘明显，与出发菌落形态差异较大 (图1C)，该类型菌落体可能是潜在的单核体菌落。
        以其中一株菌落特征具有较明显差异的再生菌株为材料，比较该菌株与出发菌株的菌落形态特征和生长速度差异：培养结果表明再生菌株呈辐射状生长，菌丝呈浓密绒毛状，在平板反面形成裂褶状纹路并有深黄色色素分泌 (图2A) (表1)。而出发菌株生长呈现轮纹状扩大，菌丝稀疏毛毡状，无裂痕特征，有淡黄色色素分泌 (图2B)。此外，出发菌株的菌丝生长速度为5.72 ± 0.07 mm/d，再生菌株的菌丝生长速度为2.82 ± 0.03 mm/d，显著低于出发菌株的菌丝生长速度 (表1)。
        锁状联合结构是双核体担子菌特有的菌丝结构，通常作为双、单核体担子菌的鉴定依据 (丛倩倩等，2019；徐思佳等，2020)。然而，镜检结果表明，本研究中出发菌株与再生菌株的菌丝中均未发现锁状联合结构 (图3)，这与Singer (1986) 研究结果一致。此外，DAPI染色结果表明，再生菌株的菌丝中相邻细胞核之间被隔膜分开，每个菌丝细胞中仅有一个细胞核 (图4A)，而出发菌株的菌丝细胞中含有两个明显可见的细胞核 (图4B)。据此可判断本研究所获得菌株为单核体。
        由于异核体菌株基因型杂合，因此在基因Sanger测序峰图中通常会出现套峰，即存在杂合位点；而单核体菌株基因型理论上应该是纯合的 (Huang et al.，2010)，不存在杂合位点。通过对rpb2和tef-1α基因片段序列峰图比对发现，出发菌株存在多个杂合位点，尤其是rpb2基因 (图5A；图5C)；而再生菌株均未发现杂合位点 (图5B；图5D)。


图1. 原生质体再生菌落形态
注：A：再生菌落；B：再生菌落类型l；C：再生菌落类型II。


图2. 荷伯生氏斜盖伞再生菌株与原出发双核体菌株菌落形态
注：A：再生菌株菌落（正、反）；B：出发菌株菌落（正、反）。


图3. 荷伯生氏斜盖伞再生菌株与原出发双核体菌株菌丝显微形态
注：A：再生菌株；B：出发菌株。


图4. 荷伯生氏斜盖伞再生菌株与原出发双核体菌株细胞核染色
注：A：再生菌株；B：出发菌株. 箭头：隔膜。

表1. 再生菌株与出发菌株的生长特征比较

溶液配方

1. PDA培养基
   马铃薯         200 g (去皮煮熟后过滤取汁液)
   葡萄糖         20 g
   琼脂             15 g
   加超纯水至1 L，调pH至7.0，115 °C高温高压灭菌30 min
2. YMG液体培养基
   葡萄糖                    10 g
   酵母提取物             4 g
   麦芽提取物            10 g
   加超纯水至1 L，调pH至7.0，115 °C高温高压灭菌30min
3. MYG再生培养基
   葡萄糖                   10 g
   酵母提取物            4 g
   麦芽提取物           10 g
   琼脂                       15 g
   加0.5 M蔗糖溶液至1 L，调pH至7.0，115 °C高温高压灭菌30min
4. DAPI染色液
   用无菌水将DAPI配制成50 μg/ml的母液，-20 °C条件下保存
   染色时，用PBS缓冲液 (pH = 6.8，0.1 M) 稀释成5 μg/ml的工作液，4 °C、避光条件下使用
5. 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (PBS)
   0.1 M KH₂PO₄           510 ml
   0.1 M K₂HPO₄           490 ml
   NaCl                           8 g，pH = 6.8
6. 裂解酶
   用0.5 M蔗糖溶液配制浓度为10 μg/ml的裂解酶溶液，先以0.45 μm滤膜过滤除菌，再以0.22 μm滤膜二次过滤除菌。
7. 0.5 M蔗糖溶液
   蔗糖171.5 g
   加超纯水至1 L，以0.45 μm滤膜过滤除菌再以0.22 μm滤膜二次过滤除菌。
   

致谢

本工作得到国家自然科学基金项目 (项目编号：31722014; 31901290) 的经费资助。

参考文献

1. 丛倩倩，崔晓，王庆武. (2019). 灵芝原生质体单核菌株的制备及形态特性比较. 食用菌 41(2): 34-36.
2. 胡晓棣，李熠，任蜀豫，姚一建. (2016). 冬虫夏草、蛹虫草菌丝隔膜和细胞核 荧光染色. 菌物学报 35(9): 1099-1105.
3. 徐思佳，万佳宁，李焱，李燕，尚俊军，鲍大鹏. (2020). 刺芹侧耳交配型基因敲入单核体后锁状联合和核相的表征观察. 菌物学报 39(6): 1130-1138.
4. Huang, C., Xu, J., Gao, W., Chen, Q., Wang, H. and Zhang, J. (2010). A reason for overlap peaks in direct sequencing of rRNA gene ITS in Pleurotus nebrodensis. FEMS Microbiol Lett 305(1): 14-17.
5. Kluting, K. L., Baroni, T. J. and Bergemann, S. E. (2014). Toward a stable classification of genera within the Entolomataceae: a phylogenetic re-evaluation of the Rhodocybe-Clitopilus clade. Mycologia 106(6): 1127-1142.
6. Liesche, J., Ziomkiewicz, I. and Schulz, A. (2013). Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biol 13: 226-226.
7. Liu, Y. J., Whelen, S. and Hall, B. D. (1999). Phylogenetic relationships among ascomycetes: evidence from an RNA polymerse II subunit. Mol Biol Evol 16: 1799-1808.
8. Rehner, S. A. and Buckley, E. (2005). A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia 97: 84-98.
9. Singer, R. (1986). The Agaricales in modern taxonomy. In: Koeltz Scientific Books. 4th edition. Germany, Koenigstein. 699-700.