锁核苷酸PCR解析植物内生细菌多样性方法
Locked Nucleic Acid (LNA) Oligonucleotide PCR Clamping Method for Investigating the Plant Endophyte Bacteria   

材料与试剂

1. 枪头
2. 无菌水
3. 植物基因组DNA提取试剂盒 (BioTeke, catalog number: DP3111)
4. High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis IN, USA, catalog number: 11732668001)
5. PCR相关试剂 (Takara RR030A Premix Ex Taq™ Hot Start Version, catalog number: RR030A)
6. LNA扩增引物和细菌特异性扩增引物 (华大公司合成)
   

仪器设备

1. 移液器
2. 超纯水仪
3. LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器
4. -20 °C冰箱
5. BIO-RAD低温离心机
6. DYY-6C型电泳仪
7. 超净工作台
8. PCR仪
9. Gel Doc凝胶成像系统
10. FM40制冰机
    

实验原理

本方法的设计原理如图1所示，主要是通过设计与常规细菌PCR引物有交叠序列的、针对植物细胞器的特异性LNA引物，由于LNA引物的Tm值较高，因此可在较高温度(70 °C) 时与植物细胞器基因退火，而常规细菌PCR引物不能完成此过程。之后，由于交叠部分的碱基位置被LNA引物锚定，在较低温度的Tm值时，如54 °C时，常规PCR产物不能和植物细胞器基因退火，加之LNA引物的3'端引物被磷酸化，不能被用于PCR引物，PCR反应被终止，从而达到选择性的扩增细菌SSU rRNA基因，而抑制了植物细胞器基因扩增的目的。


图1. LNA-PCR工作原理简图

实验步骤

以提取样品DNA为模板，利用LNA-PCR引物 (表1) 进行第一轮PCR扩增，25 μl反应体系为：Premix (5 U·μl^-1, Ex Taq, Takara) 12.5 μl、KU63f/KU1494r (20 pmol·μl^-1) 各1 μl、LNA-Mit63/LNA-Mit1492 (20 pmol·μl^-1) 各3.75 μl、LNA-Pla63/LNA-Pla1492 (20 pmol·μl^-1) 各1.25 μl、DNA模板0.5 μl、无菌水定容至25 μl。扩增条件为：94 °C 3 min、94 °C 1 min、70 °C 1 min、54 °C 1 min、72 °C 2 min (30个循环)、72 °C 10 min。获得PCR产物后，将PCR产物进行琼脂糖电泳检测，电泳条件如下 (供参考，可根据电压对电泳时间进行调整)：琼脂糖浓度1-1.5%；电压120 V-150 V；marker (100 bp-1500 bp)。此步PCR反应的目的是抑制来自植物体本身细胞器的基因对PCR扩增的干扰，最大限度的提高来自植物内生菌基因的PCR扩增。研究者可以根据自身实验目的和需求，决定是否以第一步PCR扩增产物为模板进行第二步PCR反应。比如，想用DGGE技术来研究植物内生细菌多样性，那么，由于第一步PCR反应的产物片段较长，不适用于DGGE技术 (片段长度最好小于500 bp)，因此需要通过第二步PCR扩增缩短片段长度；如果想进行二代高通量测序，也需要进行第二步PCR扩增来缩小片段长度并使用带barcode的扩增引物。进行第二步PCR时首先要利用High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis IN, USA, catalog number: 11732668001) 对上述PCR产物进行纯化，目的是对第一步PCR产物进行纯化稀释，去除第一步PCR产物中可能会对第二步PCR反应产生干扰的杂质，比如盐类物质和核苷酸等(详细纯化步骤及试剂盒原理请参照试剂盒说明书介绍)，以便第二步PCR扩增获取更好的扩增效果。
      第二轮PCR扩增以上述第一轮PCR产物经纯化稀释后的样品为模板^注1，以341F/907R (341F 5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'; 907R 5'-CCGTCAATTC CTTTGAGTTT-3') 为扩增引物，进行第二轮扩增^注2。25 μl反应为： Premix (5 U·μl^-1, Ex Taq, Takara) 12.5 μl、341F/907R (20 pmol·μl^-1) 各1 μl、第一轮PCR产物1 μl、无菌水定容至25 μl 扩增条件为：94 °C 3 min、94 °C 1 min、54 °C 1 min、72 °C 2 min (30个循环^注3)、72 °C 10 min。
      采用该方法所得的PCR产物可有效排除来自植物细胞器SSU rRNA基因的干扰，可进行高通量测序等下游实验，而且后续结果分析中也不需要进一步人工筛选不属于植物内生细菌的序列。

表1. LNA-PCR扩增引物和细菌特异性扩增引物

注：“粗体碱基”表示LNA碱基；“下划线碱基”表示LNA引物和细菌引物交叉部分；“p”表示3'末端为磷酸化处理。

注释：

1. 此步稀释可以先选择少量样品进行不同稀释浓度的PCR扩增效果摸索，找到最优扩增效果下的稀释梯度，进而再对所有样品进行该稀释浓度下的PCR扩增。本方法中，作者将第一步PCR产物的10^-1-10^-4稀释度都进行了PCR扩增和琼脂糖电泳检测，发现10^-3和10^-4稀释度下条带杂带较少，最后从中选择了10^-3稀释度作为第二步PCR反应的模板。
2. 此步扩增引物可以根据下游实验需要进行更换，比如，如果进行变形梯度凝胶电泳，那么可以换成带GC-夹的引物；如果进行高通量测序，可以换成带barcode的引物，本方法中使用的具体barcode引物序列是测序公司提供的，但需要提前告知测序公司样品数目和本次测序所用的引物，测序公司会基于以上两点给出与每一个样品对应的barcode引物序列，也可以根据拟测序公司提供的barcode引物序列自行选择引物合成公司进行barcode引物的合成。
3. 本研究中作者在进行PCR扩增时发现30个循环是能够将所有样品都扩增出来的最低循环数，因此采用了30个循环，在数据处理分析时也没有发现高比例的嵌合体，故采用了30个循环，此步骤中研究者可以在保证扩增效率的前提下使用最低的循环数。

注意事项

1. 不同植物的LNA-Pla63/1492序列有所不同，本表格以大豆和玉米为例展示不同之处，可以和大豆使用相同引物的植物还包括黄瓜、菠菜、莴苣和荞麦等；可以和玉米使用相同引物的植物还包括水稻、小麦、玉米和大麦等。
2. 本方法采用的引物浓度为推荐浓度，具体实验时可根据第一步PCR结果调整引物浓度。比如，研究者发现经过第一轮PCR后，PCR产物中仍然有来自植物细胞器的基因被扩增出来，那么可能说明第一轮PCR扩增中的LNA引物浓度太低，可适当加大浓度。
   

结果与分析

采用此方法得到的第一轮PCR产物经电泳检测后，在未采用LNA引物进行PCR扩增的样品中来自植物叶绿体和线粒体的条带占有优势，相反，在采用LNA引物进行PCR扩增的样品中，来自植物内生细菌的条带占有优势，如下图所示：


图2. 以大豆和玉米内生细菌PCR为例，说明LNA-PCR效果图，marker (100 bp-1500 bp) (Yu et al., 2016)

      以上述第一轮PCR产物为模板，采用带有barcode的细菌引物进行第二轮PCR扩增，再进行高通量测序后发现，对于大豆样品，采用LNA-PCR扩增后没有发现来自大豆叶绿体和线粒体的序列，而未采用LNA-PCR扩增后来自叶绿体和线粒体的序列分别占序列总数的66.43%和1.33%；对于玉米样品，采用LNA-PCR扩增后来自叶绿体和线粒体的序列分别占序列总数的0.13%和0.88%，而未采用LNA-PCR扩增后来自叶绿体和线粒体的序列分别占序列总数的93.15%和4.23%，进一步说明本方法在研究植物内生细菌多样性方面的优势。

致谢

感谢中国科学院战略先导对本工作的支持 (XDB15010103)，感谢日本鹿儿岛大学Masao Sakai和Makoto Ikenaga对实验技术的指导。已发表的使用过本实验方案的文章详见Ikenaga and Sakai, 2014; Ikenaga et al., 2015 (Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 79, 1556–1566); Yu et al., 2016; Ikenaga et al., 2018; 喻江等 (应用生态学报，2016, 27(8): 2663－2669)；喻江 (东北农业大学博士学位论文, 2016)。

参考文献

1. Ikenaga, M. and Sakai, M. (2014). Application of locked nucleic acid (LNA) oligonucleotide-PCR clamping technique to selectively PCR amplify the SSU rRNA genes of bacteria in investigating the plant-associated community structures. Microbes Environ 29(3): 286-295.
2. Ikenaga, M., Katsuragi, S., Handa, Y., Katsumata, H., Chishaki, N., Kawauchi, T. and Sakai, M. (2018). Improvements in bacterial primers to enhance selective SSU rRNA gene amplification of plant-associated bacteria by applying the LNA oligonucleotide-PCR clamping technique. Microbes Environ 33(3): 340-344.
3. Yu, Z. H., Yu, J., Ikenaga, M., Sakai, M., Liu, X. B. and Wang, G. H. (2016). Characterization of root-associated bacterial community structures in soybean and corn using locked nucleic acid (LNA) oligonucleotide-PCR clamping and 454 pyrosequencing. J Integr Agric 15(8): 1883-1891.
4. Ikenaga, M., Tabuchi, Masakazu., Oyama, T., Akagi I., Sakai, M. (2015). Development of LNA oligonucleotide–PCR clamping technique in investigating the community structures of plant-associated bacteria. Biosci Biotech Bioch 79 (9): 1556-1566.
5. 喻江, 于镇华, Ikenaga, M, Sakai, M, 刘晓冰, 王光华. 施用有机肥对侵蚀黑土玉米苗期根内生细菌多样性的影响. 应用生态学报, 2016, 27(8): 2663-2669.
6. 喻江. 玉米和大豆根内生细菌多样性及促生细菌鉴定评价. 东北农业大学. 2016.