材料和试剂

30天的拟南芥茎片段
90％丙酮
4％戊二醛
0.1％Tween 20
绝对乙醇
组织蛋白酶标准试剂盒（Reichert-Jung，目录号：70-2218-500）
组件：
1. 碱性树脂液（图2A）
2. 活化剂粉末
3. 固化剂
甲酚紫醋酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：C-5042）
预过滤溶液（参见配方）
渗透解决方案（参见配方）
嵌入介质（参见配方）
甲酚紫染色介质（参见配方）

设备

真空泵（图1）
真空罐（图1）
Histomold托盘（6×8mm）（Leica Microsystems，目录号：14702218311）
Histomold托盘（13×19mm）（Leica Microsystems，目录号：14702218313）
样品夹适配器（Leica Microsystems，目录号：14702218310）
干燥炉DO-90（Raypa）
电动切片机Leica RM2155（Leica Microsystems）
水/乙醇浴HI 1210（Leica Microsystems）
碳化钨一次性刀片TC-65（Leica Microsystems，目录号：140216266379）
玻璃幻灯片Superfrost ultra plus（Menzel-Glasër，目录号：J3800AMNZ）
Surgipath微型装载（Leica Microsystems，目录号：3801731）
盖玻片（24 x 60）（Menzel-Glasër，目录号：BB024060A1）

图1.用于组织浸润的真空瓶和真空泵

程序

从15毫升猎鹰（图2A）中最上面的莲座叶上方收集主花序的30天的拟南芥植物的茎片段（5至10mm）。
在90％丙酮中孵育30分钟
用水清洗两次，清空收件人并用新鲜水填充
用4％戊二醛，0.1％吐温20覆盖，并真空浸润15分钟
在4℃下放置过夜或更长时间。茎可以存储在此固定剂中。
用水洗涤两次。
在乙醇系列中至多100％乙醇脱水：
30％乙醇（3小时） 50％乙醇（3小时） 75％乙醇（3小时） 95％乙醇（3小时） 100％乙醇（过夜）
在4°C孵育过夜（最小）预浸液中的茎。
在4℃下在浸润溶液中孵育茎（最小过夜，长达两周）。
填充HISTORESIN模具托盘的底部与包埋介质（图2B，2C）。
将样品浸入和定向在模具托盘中（图2D，2E）。
在聚合之前将块支架适配器放在模具上，使其与块一起形成单件（图2F，2G）。
允许在室温下聚合过夜。
从模具中取出块加适配器（图2H-J）。

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图2.制作树脂块。 A.块制作所需的反应物。 B，C。模具托盘填充有包埋介质。 D，E。将样品浸入并在模具托盘中定向。 F，G。在聚合之前将块支架适配器设置在模具上。 H-J。块加适配器从模具中取出。
将其固定到切片机的移动头（图3A-3C）。
使用具有碳化钨刀片TC-65的机动切片机Leica RM2155切割树脂嵌入样本的3-8μm切片（图3C，3D，视频1）。

视频1.切割和幻灯片
在50℃水/乙醇浴中漂浮切片几秒钟，直到切片变平（图3E，3F，视频1）。加入约40ml的100％乙醇/升水，以限制漂浮在水中时发生的组织蛋白酶切片的快速移动。
收集玻片上的切片（图2G，视频1），并允许在烘箱中在50℃下干燥过夜。
可选染色步骤（仅当需要造影染色溶液时）
将载玻片浸入甲酚紫染色培养基2-5分钟
用蒸馏水清洗2分钟。
使用kimwipe从幻灯片中干燥过量的水分。
在50℃下在烘箱中干燥15分钟
在Surgipath微型安装中安装部分
用盖玻片盖。

图3.切割树脂块。 A-C。块体固定到切片机的移动头部。 D.使用机动切片机切割3-8μm切片的树脂包埋的样品。 E.用镊子收集切片。 F.将切片在50℃水浴中漂浮几秒钟直到切片变平。 G.在玻片上收集切片。

图4. 拟南芥茎部分用甲酚紫染色，按本协议所述制备

笔记

为了获得横向茎段，使用2步法。首先，杆水平地放置在模具中，在表面的底部，并且制造第一块。然后修剪该块以仅留下含有茎的一片树脂。该块在第二模具中垂直定向，其用于产生第二块，其中杆将被适当地定向以用于切片。
该程序可以应用于来自动物和植物来源的其它样品。通常，与动物组织（其中通常过夜渗透时间足够）相比，植物组织需要更长的浸润时间（最少2-3天）。

食谱

预先过滤溶液
50％无水乙醇 50％浸润溶液
浸润溶液
50ml碱性树脂/液体
1包（0.5克）活化剂
用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解
它可以在4℃下储存数周。
嵌入媒介
15ml浸润溶液
1 ml硬化剂
新鲜制作
立即混合并使用
甲酚紫染色介质
1％甲酚紫乙酸酯在蒸馏水中的溶液 100mg甲酚红醋酸盐 10ml蒸馏水

致谢

这项工作得到了西班牙部长会议（BIO2011-25687）的支持。该方案改编自Giménez等人（2001）和Chevalier等人（2014）。我们感谢InésPoveda的摄影作品。

参考文献

Chevalier，F.，Nieminen，K.，Sanchez-Ferrero，J.C.，Rodriguez，M.L.，Chagoyen，M.，Hardtke，C.S.and Cubas，P.（2014）。 Strigolactone促进降解DWARF14，一种拟南芥中独脚金内酯信号传导所必需的α/β水解酶。植物细胞26（3）：1134-1150。
Gimenez，E.，Giraldo，P.，Jeffery，G.and Montoliu，L。（2001）。斑驳表达和延迟的视网膜色素沉着在转基因小鼠的发育过程中，在基因座控制区的酪氨酸酶基因。 30（1）：21-25。