材料和试剂

设备

程序

在培养罩下，将来自一只6-8周龄小鼠的胫骨和股骨用不含FBS的DMEM在预先在37℃温热的培养皿中（见视频1）冲洗。

视频1.鼠标骨髓收集
用注射器和针头，吸出并弹出2-3次骨髓，以破坏它
转移到50ml锥形管中
在4℃下以430×g离心10分钟。
用补充有15％FBS和青霉素/链霉素的DMEM以10 6个细胞/ml的密度重悬沉淀物。
板在T25烧瓶中的1×10 7个细胞（10ml）
在37℃-5％CO 2下孵育7-10天而不更换培养基。
除去上清液，以保持只有粘附细胞，用5ml PBS洗涤烧瓶2次
胰蛋白酶细胞扩增。对于细胞胰蛋白酶化：在漂洗的细胞上加入0.5ml胰蛋白酶。等待3到5分钟，直到细胞从塑料表面剥离。转移细胞在15毫升管，并迅速加入10毫升含10％FBS的DMEM，以抑制胰蛋白酶作用。
7-10天后，通过流式细胞术评估生长的贴壁细胞的表型。
1. 用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD45（克隆30-F11）和用别藻蓝蛋白（APC）标记的抗CD31（克隆MEC133）染色细胞。这些抗体应稀释1/200。细胞应该对于这两种标记是阴性的，因为CD45是造血细胞标记物，CD31是内皮细胞标记物。
2. 用1/200稀释的APC标记的抗CD44（克隆IM7），藻红蛋白（PE）标记的抗CD105（克隆MJ7/18）和FITC标记的抗CD90（克隆5E10）。细胞应该对这三种标记是阳性的。

致谢

该协议改编自Tormo等人（2013）。

参考文献

Tormo，A.J.，Beaupre，L.A.，Elson，G.，Crabe，S.and Gauchat，J.F。（2013）。聚谷氨酸基序赋予IL-27羟基磷灰石和骨结合特性。 J Immunol 190（6）：2931-2937。
Tormo，A.J.，Beauséjour，C。和Gauchat，J.F。（2014）。在体外绑定到分泌的骨基质。 生物协议 4（4）：e1030