基于96孔板的点阵式菌种文库复制及维护
Replication and Maintenance of 96-well Plate-based Arrayed Bacteria Library   

材料与试剂

1. 96孔保菌板 (Nunc, catalog number: 260860) 
2. 手封铝膜 (Thermo, catalog number: CNG6570) 
3. iPipettePro高通量移液器配套枪头 (Apricot Designs, catalog number: 125-096-EZ-S) 
4. Multidrop配套标准分液盒 (Thermo, catalog number: 24072671) 
5. 甘油 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 10010618)
6. Tryptone (OXOID LTD, catalog number: LP0042) 
7.  酵母提取物 (OXOID LTD, catalog number: LP0021) 

仪器设备

1. 自动分液器 (Thermo, Multidrop Combi) 
2. 高通量移液器 (Apricot Designs, iPipettePro) 
3. 震板机 (Eppendorf, Thermomixer, comfort) 
4. 细菌培养箱 (上海精宏实验设备有限公司，DNP-9162) 
5. -80 °C冰箱 (Thermo, FORMA 900 Series) 

实验步骤

本实验的主要流程是从已有保菌板中吸取少量菌液接种至装有新鲜冻存培养基的多孔板内，静置培养后，封膜冻存，得到新的菌种备份板。具体操作方法如下：
一、准备工作

1. 提前配制含8%甘油的保菌用LB液体培养基，高压灭菌待用。
2. 处理工作间环境：酒精擦拭超净台，紫外灭菌20-30 min，风机通风。
3. 实验开始前根据文库菌种抗性将相应抗生素加入步骤1所制备的LB培养基，混匀待用。
4. 打标签、贴标签：使用打标机及贴标机将新的保菌板侧面贴好标签，此步也可使用常规打印机，手动贴标。

1. 原始菌种板融化：
   从-80 °C冰箱拿出原始菌种板，迅速撕掉封板膜 (不要等菌液融化)，盖好盖子室温融化，约20-30 min。
   注意：如果等待融化后再撕膜，封板膜内表面形成的液珠容易导致菌种的孔间污染，所以应在菌种板自冰箱拿出后尽快撕膜。
2. 使用Multidrop将含有抗生素及8%甘油的LB液体培养基加至新的保菌板，每孔155 μl (视频1)。
   
   
   
   视频1
   
   注意：本实验所用的保菌板为具有疏水表面的未经处理的多孔板，适合悬浮细胞培养；也可用表面经过处理的用于贴壁细胞培养的培养板代替。
3. 利用iPipettePro从原始菌种板内每孔取5 μl菌液，加入新保菌板对应孔内 (图1，表1，视频2)。
   
   
   图1. iPipettePro接种菌种程序设置
   
   表1. iPipettePro接种菌种程序说明
   

   程序	参数设置	说明
   Change-head		卸下枪头卡夹，以便安装枪头
   Z-height	0.0 mm	设定吸液头的初始位置 (0 mm为最高处)
   Plunge-speed	80%	设置吸液速度 (最大速度的80%)
   Station-right		右侧板位 (放有原始保菌板) 移动至吸液头对应位置
   Z-height	73.0 mm	吸液头Z轴高度移动至73 mm处 (该高度需根据不同板型进行设置)
   Aspirate	100.0 μl	将孔内菌液吸打混匀：吸液100μl后，排空；重复一次。
   Empty
   Aspirate	100.0 μl
   Empty
   Aspirate	5.0 μl	吸取5 μl菌液
   Z-height	0.0 mm	移液头抬高至最高位置
   Station-left		左侧板位 (放有新保菌板) 移动至加样位置
   Z-height	73.0 mm	吸液头Z轴高度移动至73 mm处 (该高度需根据不同板型进行设置)
   Empty		将枪头内液体全部加至板内
   Z-height	0.0 mm	移液头抬高至最高位置
   Change-head		卸下枪头卡夹，取下枪头，程序完成

   
   
   
   视频2
   
   
4. 弃去枪头。
5. 原始保菌板封好铝膜后盖上板盖，放回-80 °C冰箱。
6. 重复步骤3-5，直至所有菌板复制完成。
7. 将已加入菌液的备份用保菌板放至震板机上震荡混匀 (650 rpm，3 min)。
8. 放至30 °C细菌培养箱静置培养24 h。 
9. 观察孔内菌液浑浊情况，如已变浑浊说明菌种生长正常，封上手封铝膜，放入-80 °C冰箱，作为一套新的备份菌种板保存。
   注意：为避免孔间交叉污染，封膜过程中保证菌板稳定不发生晃动；封板膜对齐板子边缘，贴好后确保各孔上边缘封严，若发现贴膜歪斜导致部分边缘孔未封严，建议更换新膜重贴。 

结果与分析

培养24 h后的菌板孔内培养基会变浑浊，OD₆₀₀值一般在0.2-0.8范围内。下图为静置培养前后96孔板内菌液浑浊程度比较 (图2)。


图2. 菌种保存板培养前后及封膜后图片

失败经验

1. 撕膜的操作需要在保菌板拿出冰箱后尽快完成，否则菌液融化后撕膜过程容易溅入其他孔导致孔间菌种污
2. 复制过程中需要保证原始保菌板和新保菌板摆放方向一致，即保证A1孔在同一个位置，以免菌种对应的孔位发生错乱。
3. 菌种整板接种并震荡混匀后，放入30 °C细菌培养箱静置培养即可，无需震荡培养。
4. 保菌板避免离心操作，否则会导致菌种沉降至孔底。
5. 保菌板在菌种使用过程中，尽量避免反复冻融 (根据笔者测试，反复冻融5次以内未见菌种活性收到明显影响)。
6. 如果保菌板用于菌种单挑，可在撕膜后直接用灭菌枪头或牙签刮取菌种，无需解冻，以避免反复冻融对菌种活性的影响。挑取结束后，使用新的封板膜重新封板。
7. 当用菌种文库进行高通量筛选时，需要首先通量化地制备可用于细胞转染的质粒。我们使用iPipettePro高通量移液器及商业化的高通量质粒抽提试剂盒 (例如Promega公司的Wizard® SV 9600 Plasmid DNA Purification System) 可方便地一次性制备96个质粒样品。测定浓度后进行浓度均一化调整，以得到孔间浓度均一的可直接用于整板细胞转染的质粒文库。
   

溶液配方

1. 保菌用LB液体培养基：
   1)

   800 ml去离子水中溶解Tryptone 10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g。
   2)

   加入80 ml甘油，搅拌混匀。
   3)

   使用去离子水定容至1 L。
   4)

   高压灭菌后，4 °C保存。
   5)

   使用前加入抗生素混匀。

致谢

本项工作得到了中国科学院关键技术人才项目的支持 (课题号：Y907S21A11)。

参考文献

1. Yang, X., Boehm, J. S., Yang, X. P., Salehi-Ashtiani, K., Hao, T., Shen, Y., Lubonja, R., Thomas, S. R., Alkan, O., Bhimdi, T., Green, T. M., Johannessen, C. M., Silver, S. J., Nguyen, C., Murray, R. R., Hieronymus, H., Balcha, D., Fan, C., Lin, C., Ghamsari, L., Vidal, M., Hahn, W. C., Hill, D. E. and Root, D. E. (2011). A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.Nat methods 8(8): 659-661.