低密度脂蛋白吸收试验
Experiment of Low-density Lipoprotein Absorption   

材料与试剂

1. 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603 (Corning Costar, Cambridge, MA, catalog number: 04119005)
2. Human Dil-Low Density Lipoprotein (上海翊盛生物科技有限公司，Yeason，catalog number: 20614ES76)
   
3. Lipofectamine^® RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA，catalog number: 13778075)
4. 4% PFA (国药集团化学试剂有限公司)
5. 20x PBS (上海生工生物工程有限公司，catalog number: B548117)
6. Hoechst 33342 (上海翌圣生物科技有限公司，Yeason，catalog number: 40731ES10)
7. MEM/EBSS培养基 (Hyclone, Logan, UT, USA，catalog number: AF29549370)
8. Penicillin/Streptomycin (Gibco, Germany，catalog number: 15240-062)
9. Opti-MEM培养基 (Gibco, Germany，catalog number: 31985-070)
10. HepG2 (ATCC，USA)
11. Dil-LDL工作液 (见溶液配方)
12. Hoechst (见溶液配方)
13. 1x PBS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. PerkinElmer Operetta CLS^TM (PerkinElmer, USA)
2. 移液器 (Eppendorf)
   

实验步骤

1. 利用RNAiMAX试剂，反式转染PCSK9的siRNA (30 nM) 以及阴性对照 (NC)，于底部透明的96孔黑板中，按照每个孔20 μl Opti-MEM培养基+ 0.2 μl RNAiMAX + NC/siRNA (终浓度30 nM) 的体系进行溶液配制，之后用每孔100 μl MEM/EBSS培养基以密度为2 x 104个/孔HepG2细胞进行铺板。
   注：实验中的Opti-MEM培养基和MEM/EBSS培养基，使用前需在37 °C烘箱预热15 min左右。
   
2. 48 h后，更换无血清培养基 (此时细胞汇合度应为70%-85%)，继续培养24 h。
3. 将之前培养基吸走，每个孔中添加100 μl Dil-LDL溶液 (终浓度为30-40 μg/ml，配置在无血清培养基中)。
4. 4 h后，用Hoechst染色。吸走含有Dil-LDL的溶液，按照Hoechst:MEM/EBSS培养基= 1:2000配制Hoechst工作液，每孔加入100 μl Hoechst工作液。
5. 5-10 min后，吸走板中培养基，利用1x PBS清洗两次后，加入4% PFA 100 μl/孔。20 min后吸走4% PFA，加入1x PBS 100μl 维持细胞形态。
6. 利用PerkinElmer Operetta拍照。
7. 利用细胞内红色荧光聚集的点的个数除以细胞个数，得到实验结果。

结果与分析

1. 首先利用Hoechst的蓝紫光确定细胞核的个数。 (Hoechst 激发波长：360 nm；发射波长：460 nm。)
2. 利用红色荧光找到Dil-LDL的荧光，并计算聚集点的个数。 (Dil-LDL激发波长：488 nm；发射波长：565 nm。)
   
3. 红色荧光聚集的点的个数除以细胞个数，得到实验结果。
   
   
   图 1. Dil-LDL 荧光探针法检测细胞对LDL的吸收能力
   
   
   前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9) 可以在细胞内外通过与低密度脂蛋白受体(LDLR) 的相互作用影响LDLR的降解，从而减弱细胞对LDL-C的吸收 (范磊，2020)。本实验利用PCSK9的siRNA，来验证当细胞内PCSK9被敲低后，细胞是否会对LDL-C的吸收增强，进而验证利用Dil-LDL来指征细胞对LDL吸收能力的可行性 (Du et al., 2016)。
   最终实验结果也证明了，当细胞内PCSK9被敲低后，细胞对于LDL-C的吸收能力增强。
   

注意事项

1. 严格注意Dil-LDL的保质期，过期后会导致荧光信号极其不稳定。
2. 固定完细胞的板子不可低温储存。
   

溶液配方

1. Dil-LDL工作液：使用前半小时，按照Dil-LDL试剂的初始浓度，利用无血清培养基，将其稀释成30-40 μg/ml。
2. Hoechst：用无菌超纯水配制成10 mg/ml的储存液，-20 °C避光保存。
3. 1x PBS：取50 ml 20x PBS加入ddH₂O并定容至1 L，高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存待用。
4. MEM/EBSS完全培养基：MEM/EBSS培养基 450 ml，FBS 50 ml，Penicillin/Streptomycin 5 ml。
   

致谢

感谢实验室范磊博士和侯蕾等人对于此方法的摸索。基金项目 (Foundation)：国家科技部"重大新药创制"科技重大专项 (No 2018ZX09101001-003-007)。

参考文献

1. 范磊. (2020). miR-552-3p改善糖脂代谢失调性疾病作用发现及机制研究. 博士学位论文. 中国科学院大学 (中国科学院上海药物研究所).
2. Du, Y., Li, S., Cui, C. J., Zhang, Y., Yang, S. H. and Li, J. J. (2016). Leptin decreases the expression of low-density lipoprotein receptor via PCSK9 pathway: linking dyslipidemia with obesity. J Transl Med 14(1): 276.