荧光偏振技术在β-catenin/LEF1相互作用小分子抑制剂高通量筛选中的应用
Application of A Fluorescence Polarization Screening Assay for the Discovery of β-catenin/LEF1 Interaction Antagonists   

研究背景

荧光偏振 (fluorescence polarization, FP) 技术被广泛应用于药物筛选、蛋白质活性鉴定、药物分析与疾病诊断，具有均相反应、操作简便、检测灵敏、成本低廉等优点。本文以β-catenin/LEF1相互作用为靶标，将FITC-LEF1作为核转录因子LEF1的模拟物，基于偏振荧光强弱与荧光分子大小正相关的原理建立了荧光偏振高通量筛选模型 (Lea and Simeonov, 2011)。如果小分子化合物为非活性化合物，那么分子量较大的β-catenin将与分子量较小的FITC-LEF1发生特异性结合反应，荧光复合物的分子量将增大，旋转速度较慢，荧光偏振实验中表现较高的毫偏值 (millipolarization units, mP)；反之，活性化合物能够特异性阻断β-catenin与FITC-LEF1的相互作用，荧光复合物的分子量将明显减小，旋转速度较快，荧光偏振实验中则表现较低的mP值 (图1)。


图1. 荧光偏振高通量筛选方法原理示意图

材料与试剂

1. 384孔板 (PerkinElemer, catalog number: 6007270)
2. 荧光探针FITC-LEF1 (FITC-GDPELCATDEMIPFKDE-OH，纯度大于97.0%，由上海强耀生物科技有限公司合成)
3. LEF1多肽 (GDPELCATDEMIPFKDE-OH，纯度大于97.0%，由上海强耀生物科技有限公司合成)
4. Tris (Sigma, catalog number: V900483)
5. NaCl (Sigma, catalog number: V900058)
6. EDTA (Sigma, catalog number: V900106)
7. DMSO (Sigma, catalog number: V900090)
8. HCl (国药试剂，catalog number: 10011018)
9. 血根碱 (TargetMol公司，catalog number: 2781)
10. 白屈菜红碱 (TargetMol公司，catalog number: 3419)
11. H₂O
12. 天然产物化合物库 (TargetMol公司)
13. 荧光偏振反应液 (见溶液配方)
14. 重组人β-catenin (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 多功能酶标仪 (BioTek, Cytation^TM 5型)
2. 移液器 (Eppendorf)
3. 微孔板快速振荡器 (Kylin-Bell Lab, QB-9001型)
   

实验步骤

1. 将2 mM FITC-LEF1以荧光偏振反应液稀释至终浓度分别为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 nM，依次加入到384孔板中，每孔60 μl，每组设置3组复孔，室温避光孵育15 min，选择荧光偏振检测程序，设定激发光波长485 nm，发射光波长535 nm，以多功能酶标仪检测mP值。
2. 将40 nM FITC-LEF1加入到384孔板中，每孔30 μl，再依次加入0、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000 nM β-catenin，每孔30 μl，每组设置3组复孔，以微孔板快速振荡器缓慢振摇，室温避光孵育15 min，选择荧光偏振检测程序，设定激发光波长485 nm，发射光波长535 nm，以多功能酶标仪检测mP值。选择One site-Specific binding，以GraphPad Prism 5.0软件拟合结合曲线，计算β-catenin/FITC-LEF1结合反应的解离平衡常数 (dissociation constant) K_d值。
3. 将40 nM FITC-LEF1加入到384孔板中，每孔30 μl，再将0、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000 nM β-catenin依次加入到384孔板中，每孔30 μl。反应体系中含DMSO终浓度分别为0、2%、4%、6%、8%、10%，每组设置3组复孔，以微孔板快速振荡器缓慢振摇，室温避光孵育15 min，选择荧光偏振检测程序，设定激发光波长485 nm，发射光波长535 nm，以多功能酶标仪检测mP值。选择One site-Specific binding，以GraphPad Prism 5.0软件拟合结合曲线，计算β-catenin/FITC-LEF1结合反应在各DMSO浓度中的K_d值。
4. 将40 nM FITC-LEF1和180 nM β-catenin加入到384孔板中，每孔各加入30 μl，其中A板1#~50#孔反应体系中含2% DMSO，B板1#~50#孔反应体系中含10 μM LEF1多肽，以微孔板快速振荡器缓慢振摇，室温避光孵育15 min，选择荧光偏振检测程序，设定激发光波长485 nm，发射光波长535 nm，以多功能酶标仪检测mP值。设定A板1#~50#孔为阴性对照孔，其平均值为μN，B板1#~50#孔为阳性对照孔，其平均值为μP，按照下述公式计算Z´因子。
   
   
5. 天然产物化合物库的次级库浓度为1.0 mg/ml。将180 nM β-catenin加入到384孔板中，每孔29 μl，再依次加入小分子化合物，每孔1 μl，室温孵育45 min。再将40 nM FITC-LEF1加入到384孔板中，每孔30 μl，室温避光孵育15 min，选择荧光偏振检测程序，设定激发光波长485 nm，发射光波长535 nm，多功能酶标仪检测mP值，计算小分子化合物的抑制率。阴性对照孔和阳性对照孔的设定如上所述。按照下述公式计算苗头化合物 (Hit) 的抑制率，其中μHit为苗头化合物mP值的平均值。苗头化合物的初判标准：抑制率 > 50%的小分子化合物。
   
   
6. 将10 mM血根碱 (sanguinarine，SAN) 和白屈菜红碱 (chelerythrine, CHE) 以180 nM β-catenin进行2倍倍比稀释 (起始浓度100 μM，共稀释12个浓度梯度)，加入到384孔板中，每孔30 μl，每组设置3组复孔，室温孵育45 min。再将40 nM FITC-LEF1依次加入到384孔板中，每孔30 μl，以微孔板快速振荡器缓慢振摇，室温避光孵育15 min，选择荧光偏振检测程序，设定激发光波长485 nm，发射光波长535 nm，以多功酶标仪检测mP值。按照上述公式计算各稀释浓度的抑制率，再以GraphPad Prism 5.0软件拟合抑制曲线，计算IC₅₀值。

结果与分析

1. 荧光探针FITC-LEF1最佳反应浓度的确定
   将不同浓度的FITC-LEF1置于384孔板中，以多功能酶标仪检测mP值。实验结果表明，从100 nM开始，不同浓度的FITC-LEF1在实验体系中的mP值基本保持一致，在50至5 nM之间，mP值波动最小，基本保持在25-30之间，具有相对较低且平稳的mP值 (图2)。为了保持实验体系的良好灵敏度和较低的本底值，选用FITC-LEF1最佳反应浓度为20 nM。
   
   
   图2. 荧光探针FITC-LEF1最佳反应浓度的确定
   
   
2. β-catenin最佳反应浓度的确定
   在荧光偏振实验中，随着β-catenin加入浓度的升高，mP值也逐渐升高。当β-catenin浓度达到350 nM时，mP值达到最大并趋于平台期 (图3)。经GraphPad Prism 5.0软件拟合结合曲线，计算其结合反应的K_d值为60 nM。为了使其结合反应在荧光偏振实验中接近饱和状态，并保证较高的灵敏度和信号窗，实际使用的β-catenin浓度应达到K_d值的1.5倍 (Nikolovska-Coleska et al., 2004; Zhu et al., 2018)。故此选用β-catenin最佳反应浓度为90 nM。
   
   
   图3. β-catenin最佳反应浓度的确定
   
   
3. 实验体系对DMSO的耐受性
   通过DMSO对β-catenin/FITC-LEF1结合反应饱和曲线K_d值的影响，判断荧光偏振实验体系对DMSO的耐受性。当DMSO浓度在0-10%时，饱和曲线的K_d值为62.36 ± 0.68 nM，波动极小 (图4)。实验结果表明，当DMSO浓度在10%以内时，其对β-catenin/FITC-LEF1结合反应没有显著影响，实验体系对DMSO具有良好的耐受性。
   
   
   图4. DMSO对β-catenin/FITC-LEF1结合反应的影响
   
   
4. Z´因子值的测定
   Z´因子是评价药物高通量筛选体系稳定性的核心参数。通过综合分析和计算，本筛选模型Z´因子值为0.77 (图5)，满足高通量筛选中Z´因子值大于0.5的基本要求 ( Zhang et al., 1999)。
   
   
   图5. 荧光偏振筛选模型Z´因子值的确定
   
   
5. 苗头化合物的筛选
   应用上述已建立的荧光偏振高通量筛选模型，对本室天然产物化合物库进行了高通量筛选，成功筛选到血根碱 (sanguinarine, SAN) 和白屈菜红碱 (chelerythrine, CHE) 具有良好的抑制活性，其IC₅₀值分别为1.44 ± 0.08、3.55 ± 0.25 μM (图6)。
   
   
   图6. 苗头化合物的筛选与发现 A) 血根碱的分子结构; B) 白屈菜红碱的分子结构; C) SAN和CHE在荧光偏振筛选模型中的抑制活性
   

失败经验

1. 荧光偏振实验中，溶液黏度是影响mP值检测的重要因素。因此，荧光偏振反应体系中应尽可能减少甘油含量，尽量保持低盐。
2. 反应温度对荧光偏振实验略有一定影响，但通常情况下，室温反应即可满足高通量筛选的基本需求。实验中所用溶液需要提前预热至室温备用。
3. β-catenin最佳工作浓度确定是高通量筛选模型建立的关键要素。通常认为参与反应的β-catenin浓度为K_d值的1.5倍才能满足高通量筛选需求。在β-catenin使用中，尽量避免反复冻融。
4. 化合物库中小分子化合物的溶解度较低时，由于悬浮颗粒的影响和干扰，可能导致荧光偏振筛选模型表现为假性结果。在实验设计中，应尽量选择溶解度高的化合物用于高通量筛选。
5. 实验操作中，每一步需小心谨慎，务必防止检测孔中出现气泡。如果出现气泡，将影响mP值的检测，导致较大的波动值。
6. 为了在荧光偏振实验中保持较大的信号窗，荧光探针与配体结合蛋白需要亲和力较高，且分子量差异保持在20至30倍。
7. 在以蛋白质-蛋白质相互作用 (protein-protein interactions, PPIs) 为靶标的药物筛选中，荧光偏振技术具有良好的适用性与推广性。荧光偏振实验方案对探针的荧光分子标记无苛刻要求，只需按照探针标记的荧光分子，设定既定的激发光与发射光波长，开始荧光偏振检测即可。
   

溶液配方

1. 重组人β-catenin
   重组人β-catenin由大肠杆菌原核表达，经分离纯化后制备，用于荧光偏振筛选模型的建立。重组人β-catenin的制备方法如参考文献 (牛夏忆等，2019和2020) 所述。
   
2. 荧光偏振反应液
   10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0
   

致谢

衷心感谢国家自然科学基金 (81703546)、安徽省自然科学基金 (1808085QH265) 和安徽省高校自然科学研究重大项目 (KJ2019ZD30) 对本研究的资金支持！应用本实验方案发表的主要论著如下：

1. Chen, Y., Fu, Z., Li, D., Yue, Y. and Liu, X. (2021). Optimizations of a novel fluorescence polarization-based high-throughput screening assay for β-catenin/LEF1 interaction inhibitors. Anal Biochem 612: 113966.
2. 陈云雨，胡克，付正豪，牛夏忆，张晶，刘晓平. (2020). 靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型的建立与应用. 药学学报 55(5): 884-891.
   

参考文献

1. Lea, W. A. and Simeonov, A. (2011). Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert Opin Drug Discov 6: 17-32.
2. Nikolovska-Coleska, Z., Wang, R., Fang, X., Pan, H., Tomita, Y., Li, P., Roller, P. P., Krajewski, K., Saito, N. G., Stuckey, J. A. and Wang, S. (2004). Development and optimization of a binding assay for the XIAP BIR3 domain using fluorescence polarization. Anal Biochem 332: 261-273.
3. Zhu, M. R., Du, D. H., Hu, J. C., Li, L. C., Liu, J. Q., Ding, H., Kong, X. Q., Jiang, H. L., Chen, K. X. and Luo, C. (2018). Development of a high-throughput fluorescence polarization assay for the discovery of EZH2-EED interaction inhibitors.Acta Pharmacol Sin 39: 302-310.
4. 牛夏忆，李淼，张倩，陈云雨，刘晓平. (2019). 大鼠抗人β-catenin多克隆抗体的制备与鉴定. 中国免疫学杂志 35: 1992-1998.
5. 牛夏忆，韩茂椿，李淼，陈云雨，刘晓平. (2020). 重组人β-catenin原核表达条件的优化及生物学活性鉴定. 微生物学杂志 40: 58-66.
6. Zhang, J. H., Chung, T. D. and Oldenburg, K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen 4: 67-73.